Tumor inflating lymphocytes. Purification, expanding and cytotoxicity analisys on primary tumor cultures

Background. Tumor Infiltrating Lymphocytes (TILs) is one of the most promising sources of autologous cytotoxic T-cells for adoptive immunotherapy, which has already shown high efficiency in the treatment of metastatic melanoma. However, the isolation of TILs from solid tumors is technically difficult. A suppressive tumor microenvironment, in particular, a high level of expression of check-point inhibitors PD-1 CTLA4, tissue hypoxia and other factors cause that T cells isolated from the tumor do not proliferate well and do not exhibit cytotoxic properties. Aims. In this study, we isolated TILs from surgical material obtained by resection of solid tumors (primary and metastatic adenocarcinomas of various localization, melanoma, glioblastoma), studied their population composition and developed protocols for the purification expanding, and activation of CD4+, CD8+ cytotoxic antitumor lymphocytes. Methods. An urgent task is the activation of TILs, turning off immunosuppressive mechanisms and increasing their antitumor cytotoxic activity. Various approaches are used for this: activation by a cocktail of cytokines and antibodies, editing the lymphocyte genome by knocking out suppressor genes or, conversely, transduction of activating genes, coincubation with feeder cells, etc. Cells were obtained from samples of resected tumors in 16 patients; in each case we obtain an autologous pair: the primary tumor culture and the TILs culture. Results. We could isolate viable lymphocytes in 100% of cases. Isolated TILs were successfully expanded in our specialized medium using various combinations of IL-2, IL-15, IL-21, IL-7, anti-CD3 and anti-CD28. Immunophenotyping showed that the obtained TILs are a heterogeneous mixture of CD4+, CD8+ cells containing populations of CD3+CD8+CD45+(CTL) CD3+CD4+CD45+ (T-helpers), CD4+CD25+CD127- (Т-regulatory cells), CD3-CD56+CD45+ (NK-cells), CD3+CD56+CD45+ (Т-NK-cells). The initial cultures of TILs were also characterized by a high level of PD1 expression, indicating their low antitumor cytotoxicity. Using different protocols of isolation, expansion, and activation, we obtained a cell preparation containing 80% of CD8+ PD-1- activated TILs in an amount sufficient for adoptive therapy (500106 or more). An in vitro study of the cytotoxicity of obtained TILs in primary cultures of homologous tumors using RTCA Icelligence showed high cytotoxicity, providing almost 100% tumor cell death. Conclusion. Our developed protocol for the production and activation of TILs can be recommended for the phase III clinical trials of adoptive immunotherapy of recurrent, highly metastatic solid tumors

Sustained proliferation in cancer: mechanisms and novel therapeutic targets

Proliferation is an important part of cancer development and progression. This is manifest by altered expression and/or activity of cell cycle related proteins. Constitutive activation of many signal transduction pathways also stimulates cell growth. Early steps in tumor development are associated with a fibrogenic response and the development of a hypoxic environment which favors the survival and proliferation of cancer stem cells. Part of the survival strategy of cancer stem cells may manifested by alterations in cell metabolism. Once tumors appear, growth and metastasis may be supported by overproduction of appropriate hormones (in hormonally dependent cancers), by promoting angiogenesis, by undergoing epithelial to mesenchymal transition, by triggering autophagy, and by taking cues from surrounding stromal cells. A number of natural compounds (e.g., curcumin, resveratrol, indole-3-carbinol, brassinin, sulforaphane, epigallocatechin-3-gallate, genistein, ellagitannins, lycopene and quercetin) have been found to inhibit one or more pathways that contribute to proliferation (e.g., hypoxia inducible factor 1, nuclear factor kappa B, phosphoinositide 3 kinase/Akt, insulin-like growth factor receptor 1, Wnt, cell cycle associated proteins, as well as androgen and estrogen receptor signaling). These data, in combination with bioinformatics analyses, will be very important for identifying signaling pathways and molecular targets that may provide early diagnostic markers and/or critical targets for the development of new drugs or drug combinations that block tumor formation and progression

Визначення причин появи «pinking» у білих винах та його усунення

Investigation of the appearance and elimination of “pinking” phenomenon in white wines is presented in the paper. Several factors that can cause pinking were analyzed: the degree of grapes ripeness and enzymatic treatment. The effect of fining agents based on polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) on the elimination of “pinking” was determined. It was proved that pinking in wines decreases with an increase in the sugar content in grape. This is explained by a decrease in the content of anthocyanins at the end of technical ripeness of grape. Experimental studies  confirmed that the use of pectolytic enzymes with cellulase, hemicellulase, β-glucanase activities increases the intensity of straw color and the appearance of body tones, but does not affect pinking. Such treatment contributed to a slight increase in the content of phenolic compounds in wine materials, but did not affect the content of anthocyanins and  “pinking” susceptibility. Treatment of wine materials with complex PVPP-based agents including sorbents and flocculants, is an effective way to eliminate the “pinking” phenomenon. This reduces “pinking” in wine materials from 70…90 % to 1…2 %. This is due to the presence of sorbents and flocculants in the fining agents, which react with phenolic substances that cause “pinking” in white wines, and remove them from the system. So, there are reasons to argue that processing grape at the end of technical ripeness will contribute to a lower “pinking” susceptibility of wine materials; pectolytic enzymes did not affect the appearance of this phenomenon in white wines, and PVPP-based fining agents together with bentonite, activated carbon, gelatin or casein, are an effective way to reduce the “pinking” susceptibility of wine.Статья посвящена исследованиям появления и устранения явления «pinking» в белых винах. Проанализировано несколько факторов, которые могут вызвать появление розового оттенка: степень зрелости винограда и применение ферментных препаратов. Установлено влияние препаратов на основе поливинилполипираллидона на устранение «pinking». Доказано, что с увеличением сахаристости винограда склонность к порозовению в винах снижается, что объясняется уменьшением содержания антоцианов в конце технической зрелости винограда. Установлено, что применение ферментных препаратов пектолитического действия с целлюлазными, гемицеллюлазными, β-глюканазными активностями способствует усилению интенсивности соломенного цвета и появлению телесных тонов, однако не влияет на порозовение. Такая обработка способствует незначительному увеличению фенольных соединений в виноматериалах, однако не влияет на содержание антоцианов и на склонность к «pinking». Обработка виноматериалов комплексными препаратами на основе поливиниполипирилидона, включающими сорбенты и флокулянты, является эффективным способом устранения «pinking». Склонность виноматериалов к "pinking" при этом снижается с 70...90 % до 1...2 %. Это объясняется наличием в препаратах сорбентов и флокулянтов, которые реагируют с фенольными веществами, ответственными за «pinking» в белых винах, выводя их из системы. Следовательно, есть основания утверждать, что переработка винограда в период окончания технической зрелости будет способствовать меньшей склонности виноматериалов к «pinking»; ферментные препараты пектолитического действия не влияют на появление этого явления в белых винах, а препараты на основе поливинилполипирралидона, являются эффективным способом снижения склонности виноматериалов к «pinking»Стаття присвячена дослідженням появи та усунення явища «pinking» в білих винах. Проаналізовано декілька факторів, які можуть спричиняти появу порожевіння: ступінь зрілості винограду та застосування ферментних препаратів. Встановлено вплив препаратів на основі полівінілполіпіралідону на усунення «pinking». Доведено, що зі збільшенням цукристості винограду схильність до порожевіння у винах знижується, що пояснюється зменшенням вмісту антоціанів наприкінці технічної зрілості винограду. Експериментальними дослідженнями підтверджено, що застосування ферментних препаратів пектолітичної дії з целюлазними, геміцелюлазними, β-глюканазними активностями сприяє посиленню інтенсивності солом’яного кольору та появі тілесних тонів, однак не впливає на порожевіння. Така обробка сприяла незначному збільшенню вмісту фенольних сполук у виноматеріалах, однак не впливала на вміст антоціанів і на схильність до «pinking». Обробка виноматеріалів комплексними препаратами на основі полівінілполіпіралідону, які включають сорбенти та флокулянти є ефективним способом усунення «pinking». Схильність виноматеріалів до «pinking» при цьому знижується 70…90 % до 1…2 %. Це пояснюється наявністю в препаратах сорбентів і флокулянтів, які реагують з фенольними речовинами, що спричиняють «pinking» білих вин, та виводять їх із системи. Отже, є підстави стверджувати, що переробка винограду в період закінчення технічної зрілості буде сприяти меншій схильності виноматеріалів до «pinking»; ферментні препарати пектолітичної дії не впливають на появу цього явища в білих винах, а препарати на основі полівінілполіпіралідону разом з бентонітом, активним вугіллям, желатином або казеїном, є ефективним способом зниження схильності виноматеріалів до «pinking