Interaction de la phospholipase D avec des systèmes lipidiques biomimétiques (rôle de l'organisation membranaire sur l'activité de cette enzyme)

La phospholipase D (PLD) est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des phospholipides, elle participe ainsi au remodelage des membranes biologiques. Deux protocoles de mesure de l'activité PLD de Streptomyces chromofuscus ont été mis au point. L'une est basé sur l'utilisation d'un substrat chromogène hydrosoluble : le bis(paranitrophényl)phosphate. Ce substrat a permis de distinguer les facteurs influençant l'activité enzymatique et ceux permettant la localisation de la PLD à la surface des membranes phospholipidiques. L'autre protocole de dosage de l'activité PLD que nous avons développé est basé sur l'utilisation des monocouches de Langmuir. Cette technique permet de déterminer les propriétés physique des membranes lipidiques. Ainsi, nous avons mis en évidence un lien entre l'activité PLD et la rhéologie de la membrane phospholipidique constituant son substrat naturel. Cette technique a aussi permis de définir les propriétés interfaciales de cette enzyme. Ces protocoles ont été mis au point afin de proposer des outils d'analyse de l'activité de PLD plus complexes comme celles de mammifère. Dans la deuxième partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à une activité PLD PIP2- dépendante de cellule eucaryote. Les enzymes responsables de cette activité ne sont pas faciles à purifier et présentent des régulations très fines et complexes. De plus, la membrane plasmique des cellules eucaryotes possède des microdomaines lipidiques dont la composition et les propriétés physiques sont particulières. Nous avons alors recherché une activité PLD PIP2-dépendante au sein des microdomaines préparés à partir de cerveau de porc. Cette activité enzymatique est fortement impliquée dans la signalisation lipidique, sa localisation au sein de ces structures pourrait être liée à sa régulation. Les résultats obtenus ont soulevé plusieurs interrogations sur la signification d'un enrichissement en activité PLD PIP2-dépendante dans les microdomainesLYON1-BU.Sciences (692662101) / SudocSudocFranceF

Blistering of supported lipid membranes induced by Phospholipase D, as observed by real-time atomic force microscopy.

Phospholipase D from Streptomyces chromofuscus (PLDSc) is a soluble enzyme known to be activated by the phosphatidic acid (PA)-calcium complexes. Despite the vast body of literature that has accumulated on this enzyme, the exact mechanism of activation remains poorly understood. In this work, we report the first observation of PLDSc activity in real time and at nanometer resolution using atomic force microscopy (AFM). AFM images of continuous and patchy dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) bilayers were recorded, prior and after incubation with PLDSc. For continuous bilayers, the enzyme induced important morphological alterations; holes corresponding to the bilayer thickness were created, while an additional elevated phase, about 2.5 nm high, was observed. This bilayer blistering is believed to be due to the production of the negatively charged lipid PA that would cause localized repulsions between the bilayer and the underlying mica surface. By contrast, these elevated domains were not seen on patchy bilayers incubated with the enzyme. Instead, the shapes of DPPC patches were strongly deformed by enzyme activity and evolved into melted morphologies. These results point to the importance of lipid packing on PLD activity and illustrate the potential of AFM for visualizing remodeling enzymatic activities

Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.

During the past 15years, atomic force microscopy (AFM) has opened new opportunities for imaging supported lipid bilayers (SLBs) on the nanoscale. AFM offers a means to visualize the nanoscale structure of SLBs in physiological conditions. A unique feature of AFM is its ability to monitor dynamic events, like bilayer alteration, remodelling or digestion, upon incubation with various external agents such as drugs, detergents, proteins, peptides, nanoparticles, and solvents. Here, we survey recent progress made in the area

Polymère à empreintes moléculaires comme élément de reconnaissance dans un biocapteur

COMPIEGNE-BU (601592101) / SudocSudocFranceF

Interaction de molécules antipaludiques avec des systèmes membranaires biomimétiques

COMPIEGNE-BU (601592101) / SudocSudocFranceF

Étude des interactions de nanoparticules de dyoxyde de titane manufacturées avec des cellules et des biomolécules

COMPIEGNE-BU (601592101) / SudocSudocFranceF

Sample preparation procedures for biological atomic force microscopy.

Since the late 1980s, atomic force microscopy (AFM) has been increasingly used in biological sciences and it is now established as a versatile tool to address the structure, properties and functions of biological specimens. AFM is unique in that it provides three-dimensional images of biological structures, including biomolecules, lipid films, 2D protein crystals and cells, under physiological conditions and with unprecedented resolution. A crucial prerequisite for successful, reliable biological AFM is that the samples need to be well attached to a solid substrate using appropriate, nondestructive methods. In this review, we discuss common techniques for immobilizing biological specimens for AFM studies