Estudio de los efectos ejercidos por la expresión y coexpresión radicular de genes MON1 y CCZ1 de Solanum chilense sobre la respuesta a estrés salino de Arabidopsis thaliana y su capacidad para compartimentar Na+ en vacuolas

130 p.Para evitar el efecto detrimental del estrés salino, las plantas son capaces de reducir las concentraciones citoplasmáticas de Na+ mediante el incremento de su compartimentación en la vacuola. Para lograrlo, un activo y eficiente mecanismo de transporte de vesículas, provenientes desde la Red Trans-Golgi o endosoma temprano, moviliza proteínas y membranas que se fusionarán con el tonoplasto y permitirán el secuestro de los iones. Recientemente, se estableció que este proceso requiere del intercambio entre miembros de la familia de RabGTPasas RabF y RabG, el cual es regulado por el complejo heterodimérico MON1/CCZ1. La proteína MON1 actúa como efector de RabF, dirigiendo la fusión de vesículas con el endosoma tardío, mientras que el complejo MON1/CCZ1 actúa como una proteína con actividad GEF (Intercambiadora del Nucleótido de Guanina) activando a RabG y permitiendo la fusión de vesículas provenientes desde el endosoma tardío con la vacuola. En Arabidopsis thaliana, la familia MON1 está compuesto de un solo miembro, mientras que la familia CCZ1 posee dos (CCZ1a y CCZ1b). La ausencia de cualquiera de ambas proteínas involucradas en el complejo causa enanismo y retardo en el desarrollo, evidenciando su importancia para el desarrollo vegetal. Por otra parte, las familias RabF y RabG están formadas por tres y ocho miembros, respectivamente, y todos son blancos de MON1/CCZ1. Entre ellas se destacan RabF1 y RabG3e, que ha sido involucradas en la tolerancia a estrés salino de A. thaliana, al incrementar la tasa endocítica, y la capacidad de compartimentar Na+ en la vacuola, sugiriendo fuertemente el potencial rol del complejo GEF en estos mecanismos. A partir de genes obtenidos de especies vegetales halófitas, diversas investigaciones señalan que los mecanismos de endocitosis y el tráfico vesicular pre-vacuolar tendría un rol fundamental en la capacidad de tolerancia a estrés salino. De igual manera, mediante herramientas biotecnológicas, se ha demostrado que esta capacidad puede ser transferida a especies de interés comercial especialmente sensibles a estrés abiótico. En ese contexto, Solanum chilense, una especie de tomate silvestre tolerante a sequía y salinidad, evidenció poseer genes homólogos a los de MON1 y CCZ1 de A. thaliana, ambos denominados SchMON1 y SchCCZ1, y con capacidad para complementar funcionalmente las líneas mutantes de A. thaliana mon1-1 y ccz1a/b. Adicionalmente, la fuerte y coordinada expresión de ambos genes, en raíces y hojas de plantas de S. chilense sometidas a estrés salino, sugirió el involucramiento del complejo y la vía de tráfico pre-vacuolar en la capacidad de tolerancia de esta especie. Para confirmarlo, análisis experimentales de expresión y co-expresión heteróloga de SchMON1 y SchCCZ1, utilizando un promotor específico para raíces, evidenciaron incrementar la tolerancia a estrés salino de A. thaliana de forma diferencial. Entre los tres genotipos obtenidos, la expresión radicular de SchMON1 otorgó mayor tolerancia a estrés salino, debido a una mayor tasa endocítica en sus células radiculares, tanto en condiciones normales como en estrés. Adicionalmente, se reveló la presencia de grandes estructuras endosomales que podrían estar asociadas a esta mejorada capacidad para tolerar el estrés en este genotipo. El rol modulador que posee el tráfico pre-vacuolar durante estrés abiótico ha sido recientemente investigado en otros ámbitos, como el control hormonal, el movimiento vesicular de especies reactivas de oxígeno y la autofagia. En tal contexto, los tres genotipos transgénicos analizados evidenciaron reducir la expresión de genes involucrados en la vía de señalización por ABA cuando eran sometidos a estrés salino, sugiriendo la activación de la vía independiente a esta hormona. Esto fue confirmado con la reducción de la sensibilidad frente a la aplicación de ABA exógeno. Conjuntamente, se redujo del contenido de H2O2 en raíces, lo cual fue coherente con activación transcripcional de genes involucrados en mecanismos enzimáticos de detoxificación, como AtSOD1 y AtAPX, y además al verse contenido en endosomas. Adicionalmente, la reducción en la expresión de los genes de respuesta a estrés oxidativo en tejido aéreo sugirió un menor efecto del estrés salino en los genotipos tolerantes. Por otra parte, resultó evidente el incremento en la actividad autofágica en los tres genotipos, lo cual es coherente con una mayor capacidad de la vacuola para compartimentar el Na+. Esto fue confirmado mediante el incremento en la intensidad de la fluorescencia del indicador de Na+, Sodium-Green, y la correlación positiva con la inducción transcripcional del gen AtNHX1. Todos estos resultados permiten concluir que SchMON1 y SchCCZ1 de S. chilense tienen la capacidad de participar del intercambio Rab5-Rab7 y del tráfico pre-vacuolar en A. thaliana; y que la expresión o co-expresión radicular de ambos genes incrementa diferencial y significativamente el grado de tolerancia a estrés salino de A. thaliana, de una manera independiente de ABA, vía la reducción del estrés oxidativo, el incremento de la actividad autofágica, y una capacidad superior para compartimentar Na+ de sus vacuolas, mecanismos potencialmente transferibles a especies agrícolas de interés económico. // ABSTRACT: To avoid the detrimental effect of salt stress, plants reduce cytoplasmic Na+ concentrations by increasing its compartmentalization in the vacuole. To achieve this, an active and efficient vesicle transport mechanism, coming from the Trans-Golgi Network or early endosome, mobilizes proteins and membranes that will fuse with the tonoplast and allow the sequestration of ions. Recently, it was established that this process requires the conversion between members of the RabGTPase family RabF and RabG, which is regulated by the MON1/CCZ1 heterodimeric complex. The MON1 protein acts as an effector of RabF, directing the fusion of vesicles with the late endosome, while the MON1/CCZ1 complex acts as a protein with GEF activity (Guanine Nucleotide Exchanger) activating RabG and allowing the fusion of vesicles from late endosome with the vacuole. In Arabidopsis thaliana, the MON1 family has only one member, while the CCZ1 family has two (CCZ1a and CCZ1b). The absence of either of the two proteins involved in the complex causes dwarfism and developmental delay, evidencing the importance of both in plant development. On the other hand, the RabF and RabG families have three and eight members, respectively, and all are MON1 / CCZ1 targets. Among them, RabF1 and RabG3e have been involved in the tolerance to saline stress of A. thaliana, by increasing the endocytic rate, and the capacity to compartmentalize Na+ in the vacuole, which strongly suggests a potential role of the GEF complex in these mechanisms. From genes obtained from halophytic plant species, various investigations indicate that endocytosis mechanisms and pre-vacuolar vesicular traffic would play a fundamental role in the capacity for tolerance to salt stress. Similarly, using biotechnological tools, it has been shown that this capacity can be transferred to species of commercial interest that are especially sensitive to abiotic stress. In this context, Solanum chilense, a species of wild tomato tolerant to drought and salinity, showed homologous genes to those of MON1 and CCZ1 of A. thaliana, both named SchMON1 and SchCCZ1, and with the capacity to functionally complement mutant lines of A. thaliana mon1-1 and ccz1a/b. Additionally, the strong and coordinated expression of both genes, in roots and leaves of S. chilense plants subjected to saline stress, suggested the involvement of the complex and the pre-vacuolar traffic pathway in the tolerance capacity of this species. To confirm this, experimental analysis of heterologous expression and co-expression of SchMON1 and SchCCZ1, using a specific promoter for roots, showed the differential increase of the tolerance to saline stress of A. thaliana. Among the three genotypes obtained, the radicular expression of SchMON1 granted greater tolerance to saline stress, due to a higher endocytic rate in its root cells, both under normal and stress conditions. Additionally, the presence of large endosomal structures that could be associated with this improved ability to tolerate stress in this genotype was revealed. The modulatory role of pre-vacuolar traffic during abiotic stress has recently been investigated in other areas, such as hormonal control, the vesicular movement of reactive oxygen species, and autophagy. In this context, the three transgenic genotypes showed a reduction in the expression of genes involved in the ABA signaling pathway when they were subjected to salt stress, suggesting the activation of the pathway independent of this hormone. This was confirmed with the enhance insensitivity to exogenous ABA. Together, the H2O2 content was reduced in roots, which was consistent with the transcriptional activation of genes involved in enzymatic detoxification mechanisms, such as AtSOD1 and AtAPX, and also with their compartmentalization in endosomes. Additionally, the reduction in gene expression related to oxidative stress response in air tissue suggested a lower effect of salt stress in tolerant genotypes. On the other hand, the increase in autophagic activity was evident in the three genotypes, which is consistent with a greater capacity of the vacuole to compartmentalize Na+. This was confirmed by the increase in the intensity of the fluorescence of the Na+ indicator, Sodium-Green, and the positive correlation with the transcriptional induction of the AtNHX1 gene. All these results allow us to conclude that SchMON1 and SchCCZ1 from S. chilense have the ability to participate in the conversion of Rab5-Rab7 and pre-vacuolar trafficking in A. thaliana; and that the radicular expression or co-expression of both genes increases the degree of tolerance to saline stress of A. thaliana, in an ABA-independent way, via the reduction of oxidative stress, the increase of autophagic activity, and a superior capacity to compartmentalize Na+ into its vacuoles, mechanisms potentially transferable to agricultural species of economic interest

Evaluación de la capacidad de un gen SNARE-like involucrado en tráfico vesicular, para modular la tolerancia a estrés salino en Solanum lycopersicum

97 p.El tráfico vesicular intracelular asegura el intercambio de lípidos y proteínas entre los compartimentos membranosos. Bajo estrés salino esto cobra gran importancia, ya que tanto la remoción de transportadores y canales iónicos de la membrana plasmática como la compartimentación de los iones tóxicos requiere de la formación de vesículas, que pueden ser mantenidos como cuerpos multivesiculares, o bien, ser fusionados a la vacuola central. Uno de los componentes participantes incluye a la familia de proteínas SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor), que actúan en el proceso de fusión de vesículas, otorgándole especificidad al destino final de éstas. Es por ello que las SNAREs son un blanco interesante de investigación que permitiría entender el rol que tienen éstas durante el estrés salino en plantas. Las evidencias descritas hasta la fecha en Arabidopsis thaliana muestran que la sobreexpresión de determinados SNAREs conducen a un aumento de la tolerancia al estrés salino. Este efecto podría ser consecuencia de un aumento en la acumulación de sodio en la vacuola o que ocurra una compartimentación de especies reactivas de oxígeno en cuerpos multivesiculares, evitando con ello la alcalinización y pérdida de viabilidad de la vacuola. Por otra parte, el análisis de los genomas de plantas ha revelado una superfamilia de genes que codifican para proteínas denominadas SNARE-like, que al igual que las anteriores parecen estar participando en el tráfico vesicular con funciones semejantes. La participación de estas proteínas durante el estrés abiótico es prácticamente desconocida, a excepción de los estudios recientemente descritos con la sobreexpresión en tabaco de un gen SNARE-like de la planta halófita Salicornia brachiata, que es capaz de otorgar tolerancia a múltiples tipos de estrés abiótico, incluyendo el estrés salino. Los estudios de la participación de SNARE-like en plantas de importancia económica, como tomate son desconocidos. Por lo anterior, en esta tesis se propuso estudiar los efectos de la sobreexpresión de un gen SNARE-like, denominado SlSLSP6, en plantas de Solanum lycopersicum sometidas a condiciones de alta salinidad. Se realizó una búsqueda de putativos genes homólogos al SNARE-like de S. brachiata en el genoma de S. lycopersicum, identificándose aquellos que tienen expresión diferencial bajo estrés salino y se seleccionó aquel que mostró una mejor respuesta, tanto en hojas como en raíces. El análisis in silico de SlSLSP6 permitió la predicción de un dominio Longin-like, que la categorizó como una SNARE-like. Además, mediante análisis filogenético se determinó una relación de SlSLSP6 con proteínas SNARE-like de S. brachiata, Zostera marina y Solanum pennelli, plantas tolerantes a la salinidad. Junto con esto, se predijo un putativo dominio de un complejo adaptador de clatrinas y un sitio de palmitoilación. La localización subcelular indicó que SlSLSP6 se ubica en la membrana plasmática, manifestando su posible participación en la endocitosis. Los efectos de la sobreexpresión de SlSLSP6 en plantas de tomate frente a estrés salino fueron evidentes al observarse una mejora de los parámetros fisiológicos y bioquímicos, tales como un mayor contenido de clorofila, índice de rendimiento, eficiencia del fotosistema II y contenido relativo de agua, y un menor contenido de MDA, mejorando la tolerancia de estas plantas bajo estrés salino. La sobreexpresión de SlSLSP6 también aumentó la tasa endocítica, aumentando el tráfico vesicular. Además, se observó una disminución en la acumulación de especies reactivas de oxígeno, lo que se correlacionaría con el aumento de la compartimentación del sodio en las vacuolas de células de raíces de tomate. Estos resultados contribuyen a comprender el rol de esta proteína SNARE-like durante el estrés salino. Se espera que esta investigación sirva de base para el uso de estos genes en programas de mejoramiento genético de la tolerancia a estrés salino en tomate. // ABSTRACT: Intracellular vesicular traffic ensures the exchange of lipids and proteins between the membranous compartments. Under saline stress, this becomes very important, since both the removal of transporters and ion channels from the plasma membrane and the compartmentalization of toxic ions require the formation of vesicles, which can be maintained as multivesicular bodies, or be fused to the central vacuole. One of the participating components includes the family of genes encoding SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment receptor) proteins, which act in the vesicle fusion process, giving specificity to their destination. For this reason, SNAREs are an interesting research target that would allow us to understand the role they have during saline stress in plants. The evidence described to date in Arabidopsis thaliana shows that the overexpression of certain SNAREs leads to an increase in tolerance to salt stress. This effect could be the consequence of an increase in the accumulation of sodium in the vacuole or that a compartmentalization of reactive oxygen species occurs in multivesicular bodies, thereby avoiding alkalization and loss of viability of the vacuole. On the other hand, the analysis of plant genomes has revealed a superfamily of proteins called SNARE-like, which, like SNAREs, seem to be participating in vesicular trafficking with similar functions. The participation of these proteins during abiotic stress is practically unknown, except for the recently described studies with the overexpression in tobacco of a SNARE-like gene from the halophytic plant Salicornia brachiata, which is capable of granting tolerance to multiple types of abiotic stress, including salt stress. Studies of the participation of SNARE-like in plants of economic importance, such as tomato are unknown. Therefore, in this work it was proposed to study the effects of the overexpression of a SNARE-like gene, called SlSLSP6, in Solanum lycopersicum plants subjected to high salinity conditions. A search was carried out for putative genes homologous to the SNARE-like of S. brachiata in the genome of S. lycopersicum, identifying those that have differential expression under saline stress and the one that showed a better response, both in leaves and roots, was selected. The in-silico analysis of SlSLSP6 allowed the prediction of a Longin-like domain, which categorized it as a SNARE-like. In addition, by phylogenetic analysis, a relationship of SlSLSP6 with SNARE-like proteins from S. brachiata, Zostera marina and Solanum pennelli, salinity- tolerant plants, was determined. Along with this, a putative domain of a clathrin adapter complex and a palmitoylation site were predicted. The subcellular location indicated that SlSLSP6 is in the plasma membrane, showing its possible participation in endocytosis. The effects of SlSLSP6 overexpression in tomato plants against saline stress were evident when an improvement in physiological and biochemical parameters was observed, such as a higher chlorophyll content and performance index, higher photosystem II efficiency and relative water content and a lower content of MDA, improving the tolerance of these plants under saline stress. SlSLSP6 overexpression also increased the endocytic rate, increasing vesicular traffic. In addition, a decrease in the accumulation of reactive oxygen species was observed, which would correlate with the increase in sodium compartmentation in the vacuoles of tomato roots cells. These results contribute to understanding the role of this SNARE-like protein during salt stress. It is expected that this research will serve as the basis for the use of these genes in programs for the genetic improvement of tolerance to salt stress in tomato

Evaluación de la participación de RabGDI1 de Solanum chilense en el tráfico vesicular y en la tolerancia al estrés salino en Arabidopsis thaliana

101 p.Bajo situaciones de estrés las plantas desarrollan estrategias que le permiten incrementar sus niveles basales de tolerancia. Algunas de las estrategias identificadas contemplan la activación de genes implicados en las vías de tráfico vesicular, este argumento encuentra sustento en investigaciones que demuestran un aumento en las dinámicas endocíticas cuando las plantas se someten a estrés salino. Adicionalmente se ha comprobado que la expresión constitutiva de algunos genes del tráfico vesicular en plantas modelo mostraron resultados satisfactorios en el incremento de la tolerancia a la salinidad. Investigaciones preliminares en la especie de tomate silvestre Solanum chilense (Dunal) Reiche, tolerante a la salinidad, han permitido la identificación de un transcrito que es inducido en respuesta al estrés salino. Análisis informáticos revelaron que la secuencia nucleotídica de este transcrito poseía un alto grado de identidad con el gen que codifica para la proteína del inhibidor de la disociación de GDP (GDI), del tipo Rab-GDI y debido a su homología con el gen de Arabidopsis (AtGDI1), se denominó Solanum chilense RabGDI1 (SchRabGDI1). La funcionalidad de esta proteína se relaciona con los procesos de tráfico vesicular, permitiendo la extracción de las RabGTPasas desde la membrana de destino y luego manteniéndolas solubles en el citoplasma, como una reserva, para un próximo movimiento de vesículas. Para desarrollar esta investigación se propusieron los siguientes objetivos; (1) determinar el perfil transcripcional órgano específico de SchRabGDI1 y durante el estrés salino, (2) identificar las características estructurales y filogenéticas de la proteína codificada por SchRabGDI1. (3) determinación de la identidad funcional del producto génico de SchRabGDI1. (4) determinar la capacidad de interacción de SchRabGDI1 y una RabGTPasa involucrada en el tráfico de membranas entre el endosoma y la vacuola. (5) determinar el efecto de la expresión heteróloga de SchRabGDI1 sobre los parámetros fisiológicos en plantas transgénicas de A. thaliana durante el estrés salino. Adicionalmente, se (6) determino el efecto de la expresión heteróloga de este gen sobre la endocitosis en condiciones no estresantes y sobre la (7) distribución intracelular del sodio en raíces de plantas de A. thaliana control y heterólogas para SchRabGDI1 durante el estrés salino. Nuestros resultados muestran que SchRabGDI1 tiene un mayor nivel de acumulación de transcritos en tejido radicular y que comparte las características filogenéticas y los dominios estructurales característicos presente en este grupo de proteínas. Además, la complementación de la levadura mutante sec19-1 con SchRabGDI1 permitió corregir el fenotipo termosensible, demostrando la actividad funcional de SchRabGDI1. Mediante los estudios de BiFC se logró comprobar que SchRabGDI1 es capaz de interactuar in-vivo con una RabGTPasa clave de la ruta endosoma-vacuola. Adicionalmente, la sobreexpresión de SchRabGDI1 evidencio una mejora en parámetros fisiológicos como, la disminución en la acumulación de especies reactivas de oxígeno (EROs), mayor peso fresco de las plántulas, lo cual estaba acompañado de un aumento en la tasa de endocitosis y un aumento en el contenido de Na+ en sus vacuolas comparado a lo exhibido por las plantas silvestres, bajo las mismas condiciones de estrés salino. Este trabajo aporta nuevas evidencias acerca del papel del tráfico vesicular intracelular, y su participación durante el estrés salino, en relación con la expresión heteróloga de SchRabGDI1 en la planta modelo Arabidopsis thaliana. // ABSTRACT: Under stress situations, plants develop strategies which allow them to increase their basal tolerance levels. Some strategies include the activation of genes involved in the vesicular traffic routes. This argument is supported by researches that show an increase in vesicular dynamics when plants are subjected to salt stress. Additionally, it has been proved that the constitutive expression of some vesicular trafficking genes in model plants showed satisfactory results in the increasing of salt tolerance. Previous researches (of our team) on the wild tomato species Solanum chilense (Dunal) Reiche, high tolerant to salinity, have permitted the identification of a transcript which it is induced in response to salt stress. Databases analysis revealed that the nucleotide sequence of this transcript had a high identity degree with the gene that codifies for a GDP dissociation inhibitor (GDI) protein, of Rab-GDI type and due to its homology with the gene of Arabidopsis (AtGDI1), it was named SchRabGDI1.The functionality of this codified protein is related to the vesicular trafficking processes, allowing the RabGTPases extraction from the target membrane and afterwards keeping them soluble in cytoplasm, like a reservory, for a future vesicles movement. To carry out this research, following objectives were set: (1) to determinate organspecific transcriptional profile and (2) to identify the structural and phylogenetic characteristics of the codified protein by SChRabGDI1. (3) to determine the functional identity of SchRabGDI1 gene product. (4) to determinate the in vivo interaction capacity of SchRabGDI1 and a RabGTPase involved in membrane trafficking between the endosome and the vacuole. (5) to determine the variation of physiological parameters in SchRabGDI1 A. thaliana heterologous plants during salt stress. In adition it was (6) determined the effect of heterologous expression of this gene on endocytosis under non-stressful conditions and on the (7) intracellular distribution of sodium in roots of A. thaliana control and SchRabGDI1 heterologous plants during salt stress Our results show that SchRabGDI1 has a higher-level accumulation of transcripts in root tissue and it shares the phylogenetic characteristics and characteristic structural domains present in this group of proteins. Furthermore, the complementation of mutant yeast sec19- 1 strain with SchRabGDI1 allowed to correct the thermosensitive phenotype, demonstrating the functional activity of SchRabGDI1. Due to the BiFC studies, it was possible to verify that SchRabGDI1 can interact in-vivo with a SchRabGTPasa, key protein of the endosome-vacuole pathway. Additionally, the overexpression of SchRabGDI1 showed an improvement in physiological parameters such as the decrease in the accumulation of reactive oxygen species (O2-), higher seedlings fresh weight together with an increase in the endocytosis rate and increase in the of Na+ content in its vacuoles compared to what control plants exhibited under the same conditions of salt stress. This research provides with new evidence about the role of intracellular vesicular trafficking, as well as its participation during saline stress, in relation to the heterologous expression of SchRabGDI1 in the Arabidopsis thaliana model plant

Evaluación del rol funcional del gen VviPSZ3 en el desarrollo reproductivo de Vitis vinífera L. cv. Carménère. Análisis mediante complementación del mutante zat4 de Arabidopsis thaliana

136 p.Vitis vinifera L. es un importante cultivo frutal a nivel mundial. Por esta razón, es esencial comprender el desarrollo reproductivo de esta especie. Sin embargo, en la actualidad se tiene escaso conocimiento sobre su control genético. Algunos cultivares de vides, como Carménère, presentan alta incidencia en el desarrollo de frutos partenocárpicos, los cuales se forman sin el proceso de doble fecundación, por consiguiente, no presentan semillas, permaneciendo pequeños y verdes hasta la maduración. El polen desempeña un papel fundamental en la fertilidad de la planta, a través de la entrega de los gametos masculinos al saco embrionario, para que ocurra la doble fecundación. En especies modelos, se han descrito factores de transcripción del tipo C2H2 zinc-finger (C2H2-ZF) involucrados en diferentes estadios del desarrollo y maduración del polen. En la vid, VviPSZ3 es un C2H2-ZF que estaría involucrado en el desarrollo del polen y semillas. En este trabajo, se posicionó a VviPSZ3 en la red regulatoria del desarrollo de polen y semillas. Primero, se determinó el patrón temporal del desarrollo floral y del polen en la vid, posicionando el desarrollo del polen entre los estadios 13 y 15 del sistema E-L. Con estos antecedentes, se determinó que VviPSZ3 se expresa tardíamente en el desarrollo de anteras y polen. Luego, se expresó VviPSZ3 en el genotipo mutante de Atzat4, un putativo ortólogo en Arabidopsis thaliana. Se caracterizó fenotípicamente el mutante Atzat4 (+/-), como putativo ortólogo de VviPSZ3, observándose defectos en la línea germinal masculina, mostrando defectos en la germinación y elongación del tubo polínico. Además, Atzat4 (+/-) presentó una reducida fertilidad, con un menor número de semillas por silicua, las cuales, además, mostraron una reducida viabilidad y germinación; de igual manera mostró un tamaño de silicua menor al compararse con el WT. La expresión de VviPSZ3 en Atzat4 restableció el fenotipo silvestre, mostrando corrección de los defectos en el desarrollo del polen y semillas, previamente caracterizados en el mutante, sugiriendo que ambos factores de transcripción son ortólogos. Finalmente, se identificaron putativos genes blanco de VviPSZ3, en plantas transgénicas de A. thaliana, los cuales estarían involucrados en procesos del desarrollo y maduración del grano de polen, fundamentalmente, durante la formación de la pared y la cubierta del polen; además, durante el proceso de polinización y doble fecundación. Asimismo, se identificaron genes blancos de VviPSZ3, que participan en el desarrollo del embrión y las semillas. Con estos resultados, se puede concluir que VviPSZ3 estaría involucrado en procesos reproductivos de V. vinifera cv. Carménère, asociado al desarrollo del polen y semillas. // ABSTRACT: Vitis vinifera L. is an important fruit crop worldwide. For this reason, it is essential to understand its reproductive development. However, currently there is little knowledge about its genetic control. Some grapevine cultivars, such as cv. Carménère, have a high incidence in the development of parthenocarpic fruits, which forms without the double fertilization process, and consequently, do not present seeds, remaining small and green until maturation. Pollen plays a fundamental role in plant fertility, through the delivery of male gametes to the embryo sac, to double fertilization occurs. In model species, C2H2-type zinc-finger transcription factors (C2H2-ZF) have been involved in different pollen development and maturation stages. In grapevine, VviPSZ3 is a C2H2-ZF that would be involved in pollen and seeds development. In this work, VviPSZ3 was positioned in the pollen and seed development regulatory network. First, the flower and pollen development timing on the grapevine, was determined, positioning pollen development between stages 13 and 15, in the E-L system. With this background, it was determined that VviPSZ3 was expressed late in the anther and pollen development. Then, VviPSZ3 was introduced in the mutant genotype of Atzat4, a putative ortholog in Arabidopsis thaliana. The mutant Atzat4 (+/-) was characterized phenotypically, as a putative orthologue of VviPSZ3, observing defects in the male germline, and showing defects in the pollen tube germination and elongation. Furthermore, Atzat4 (+/-) presented reduced fertility, with a lower number of seeds per silique, which also, showed reduced viability and germination. It also exhibited a smaller silique size than the WT. The expression of VviPSZ3 in Atzat4 restored the wild phenotype corrected the defects in pollen and seeds development, previously characterized in the mutant, suggesting that both transcription factors are orthologous. Finally, VviPSZ3 target genes were identified in A. thaliana transgenic plants, which would be involved in processes of pollen grain development and maturation, fundamentally, during the pollen wall and coat formation; moreover, during pollination and double fertilization process. Besides VviPSZ3 target genes were identified, involved in the embryo and seeds development. With these results, it is concluded that VviPSZ3 would be involved in V. vinifera cv. Carménère reproductive processes, related to pollen and seed development

Identificación y caracterización de factores de transcripción del tipo C2H2-ZFP involucrados en el desarrollo del polen de Vitis vinifera

142 p.En la vid (Vitis vinifera L.) se ha sugerido que malformaciones generadas en el desarrollo del polen, reduce el potencial de germinación y la entrega de células espermáticas a los óvulos, aumentando la incidencia del desarrollo de frutos partenocárpicos (DFP), con un impacto negativo en la calidad del vino. Los mecanismos reguladores que controlan la formación de polen siguen siendo desconocidos en la vid. Sin embargo, en otras plantas se ha revelado una red que involucra varios tipos de factores de transcripción través del modelo (A)B(C) del desarrollo floral y se han asignado roles clave a los miembros de la familia de proteínas con dedos de zinc del tipo C2H2 (ZFP). Factores de este tipo han sido asociados a la regulación del desarrollo del polen en petunia, arabidopsis, y otras especies. El silenciamiento de algunos de estos genes provoca alteraciones morfológicas y funcionales en los granos de polen, en las diferentes etapas del desarrollo de estos. La identificación en el genoma de la vid tanto de genes homólogos a aquellos que regulan el desarrollo de anteras y polen en Arabidopsis thaliana, así como genes homólogos a la familia EPF de petunia, permite sugerir que los mecanismos moleculares similares a los descritos en estas especies modelo, regulan el desarrollo del polen en la vid. Basado en ello se planteó como hipótesis de trabajo: “La regulación del desarrollo del polen involucra la participación de proteínas factores de transcripción del tipo C2H2-ZFP en Vitis vinifera L.” Para comprender mejor el papel de las ZFP en el desarrollo del polen se realizó una búsqueda de genoma amplio identificando un grupo de 98 genes que codifican para ZFP (familia VviZFP), ampliamente distribuidos en el genoma de la vid. Luego de una caracterización general, se seleccionó un grupo de genes VviZFPs presumiblemente implicados en el desarrollo del polen, de acuerdo con su perfil de expresión in silico y homología con ZFP que regulan el desarrollo del polen, informado en otras plantas modelo. Posteriormente, se posicionaron eventos del desarrollo del polen dentro de la escala del desarrollo floral/frutal en vid (Sistema E-L), con análisis de microscopía y de expresión relativa de genes relacionados en el cultivar ‘Carmenere’. En este cultivar, la especificación de células madre del polen es visible a partir del estadio E-L13 y el desarrollo del polen ocurre entre el estadio E-L13 y E-L16. Luego, se determinó la expresión temporal de un set de genes VviZFP candidatos durante un periodo de la segunda temporada del desarrollo floral de la vid, se identificaron elementos de respuesta en las regiones promotoras de estos genes (2000 pb desde el codón de inicio de la transcripción) y finalmente se determinó la actividad órgano específica de la región promotora de VviZFP11 y VviZFP67. Todos los genes VviZFP seleccionados mostraron dinámicas de expresión a lo largo del desarrollo floral, lo que sugiere una posible participación de estos en el desarrollo de la vid. Las regiones promotoras presentaron diferentes niveles de enriquecimiento con elementos reguladores cis de respuesta a factores de transcripción, de señalización hormonal y elementos de expresión específicos del polen. Se observaron diferencias en la actividad espacio/temporal de los promotores entre VviZFP68 y el ortólogo propuesto PhMEZ1, sugiriendo roles diferentes para ambos genes. Por otro lado, el promotor del gen VviZFP13 presenta actividad similar a lo observado en AtDAZ1/2, además de actividad específica en tejido estigmático, haciéndolo interesante para estudios posteriores. Sin embargo, los perfiles de expresión indican que estos genes están siendo transcritos durante el momento del desarrollo del polen en vid. Finalmente, los resultados generados en esta tesis permiten generar una fuente de información importante que será útil a la hora de desarrollar trabajos posteriores que persigan comprender la participación de un grupo reducido de VviZFPs en eventos del desarrollo del polen en la vid. // ABSTRACT: In grapevine (Vitis vinifera L.) it has been suggested that malformations generated in the development of pollen, reduces the potential for germination and the delivery of sperm cells to the ovules, increasing the incidence of parthenocarpic fruit development (DFP), with an impact negative on the wine quality. The regulatory mechanisms that control pollen formation remains unknown in grapevine. However, in other plants a network involving various types of transcription factors has been revealed through the (A)B(C) model of flower development and key roles have been assigned to members of the C2H2 type zinc finger protein family (ZFP). Factors of this type have been associated with the regulation of pollen development in petunia, arabidopsis, and other species. The silencing of some of these genes causes morphological and functional alterations in pollen grains, at different stages of their development. The identification in the grapevine genome of genes homologous to those that regulate the development of anthers and pollen in Arabidopsis thaliana as well as genes homologous to the EPF family of petunia, allows us to suggest, that molecular mechanisms similar to those described in these model species regulate the pollen development in grapevine. Based on this, it is proposed as a working hypothesis: "The regulation of pollen development involves the participation of C2H2-ZFP-type transcription factor proteins in Vitis vinifera L." To better understand the role of ZFPs in pollen development, a genome-wide search was carried out identifying a group of 98 genes that code for ZFP (VviZFP family), widely distributed in the grapevine genome. After a general characterization, a group of VviZFPs genes presumably involved in pollen development was selected according to their in silico expression profile and homology with ZFP that regulate pollen development reported in other model plants. Subsequently, pollen development events were positioned within the scale of floral/fruit development in grapevine (E-L System), with microscopy analysis and relative expression of related genes in the ‘Carmenere’ cultivar. In this cultivar, the pollen stem cell specification is visible from stage E-L13 and pollen development occurs between stage E-L13 and E-L16. Then, the temporal expression of a set of candidate VviZFP genes were determined during a period of the second season of floral development in grapevines, response elements were identified in the promoter regions of these genes (2000 bp from the start codon) and finally the specific activity of the promoter region of VviZFP11 and VviZFP67 were determined. All the VviZFP genes showed these expression dynamics throughout flower development, suggesting a possible participation in grapevine development. The promoter regions present different levels of enrichment with cis regulatory elements of response to transcription factors, hormonal signaling, and pollen-specific expression elements. Differences in the spatial/temporal activity of the promoters are observed between VviZFP68 and the proposed PhMEZ1 ortholog, suggesting different roles for both genes. On the other hand, the promoter of the VviZFP13 gene presents activity similar to that observed in AtDAZ1/2, in addition to specific activity in stigmatic tissue, making it interesting for subsequent studies. However, the expression profiles indicate that these genes are being transcribed during the time of pollen development in grapevine. Finally, the results generated in this thesis allow generating an important source of information that will be useful when developing subsequent works that seek to understand the participation of a small group of VviZFPs in grapevine pollen development events

Overexpression of a SDD1-Like Gene From Wild Tomato Decreases Stomatal Density and Enhances Dehydration Avoidance in Arabidopsis and Cultivated Tomato

Stomata are microscopic valves formed by two guard cells flanking a pore, which are located on the epidermis of most aerial plant organs and are used for water and gas exchange between the plant and the atmosphere. The number, size and distribution of stomata are set during development in response to changing environmental conditions, allowing plants to minimize the impact of a stressful environment. In Arabidopsis, STOMATAL DENSITY AND DISTRIBUTION 1 (AtSDD1) negatively regulates stomatal density and optimizes transpiration and water use efficiency (WUE). Despite this, little is known about the function of AtSDD1 orthologs in crop species and their wild stress-tolerant relatives. In this study, SDD1-like from the stress-tolerant wild tomato Solanum chilense (SchSDD1-like) was identified through its close sequence relationship with SDD1-like from Solanum lycopersicum and AtSDD1. Both Solanum SDD1-like transcripts accumulated in high levels in young leaves, suggesting that they play a role in early leaf development. Arabidopsis sdd1-3 plants transformed with SchSDD1-like under a constitutive promoter showed a significant reduction in stomatal leaf density compared with untransformed sdd1-3 plants. Additionally, a leaf dehydration shock test demonstrated that the reduction in stomatal abundance of transgenic plants was sufficient to slow down dehydration. Overexpression of SchSDD1-like in cultivated tomato plants decreased the stomatal index and density of the cotyledons and leaves, and resulted in higher dehydration avoidance. Taken together, these results indicate that SchSDD1-like functions in a similar manner to AtSDD1 and suggest that Arabidopsis and tomatoes share this component of the stomatal development pathway that impinges on water status

Post-Franco Theatre

In the multiple realms and layers that comprise the contemporary Spanish theatrical landscape, “crisis” would seem to be the word that most often lingers in the air, as though it were a common mantra, ready to roll off the tongue of so many theatre professionals with such enormous ease, and even enthusiasm, that one is prompted to wonder whether it might indeed be a miracle that the contemporary technological revolution – coupled with perpetual quandaries concerning public and private funding for the arts – had not by now brought an end to the evolution of the oldest of live arts, or, at the very least, an end to drama as we know it

Altimetry for the future: Building on 25 years of progress

In 2018 we celebrated 25 years of development of radar altimetry, and the progress achieved by this methodology in the fields of global and coastal oceanography, hydrology, geodesy and cryospheric sciences. Many symbolic major events have celebrated these developments, e.g., in Venice, Italy, the 15th (2006) and 20th (2012) years of progress and more recently, in 2018, in Ponta Delgada, Portugal, 25 Years of Progress in Radar Altimetry. On this latter occasion it was decided to collect contributions of scientists, engineers and managers involved in the worldwide altimetry community to depict the state of altimetry and propose recommendations for the altimetry of the future. This paper summarizes contributions and recommendations that were collected and provides guidance for future mission design, research activities, and sustainable operational radar altimetry data exploitation. Recommendations provided are fundamental for optimizing further scientific and operational advances of oceanographic observations by altimetry, including requirements for spatial and temporal resolution of altimetric measurements, their accuracy and continuity. There are also new challenges and new openings mentioned in the paper that are particularly crucial for observations at higher latitudes, for coastal oceanography, for cryospheric studies and for hydrology. The paper starts with a general introduction followed by a section on Earth System Science including Ocean Dynamics, Sea Level, the Coastal Ocean, Hydrology, the Cryosphere and Polar Oceans and the ‘‘Green” Ocean, extending the frontier from biogeochemistry to marine ecology. Applications are described in a subsequent section, which covers Operational Oceanography, Weather, Hurricane Wave and Wind Forecasting, Climate projection. Instruments’ development and satellite missions’ evolutions are described in a fourth section. A fifth section covers the key observations that altimeters provide and their potential complements, from other Earth observation measurements to in situ data. Section 6 identifies the data and methods and provides some accuracy and resolution requirements for the wet tropospheric correction, the orbit and other geodetic requirements, the Mean Sea Surface, Geoid and Mean Dynamic Topography, Calibration and Validation, data accuracy, data access and handling (including the DUACS system). Section 7 brings a transversal view on scales, integration, artificial intelligence, and capacity building (education and training). Section 8 reviews the programmatic issues followed by a conclusion

Altimetry for the future: building on 25 years of progress

In 2018 we celebrated 25 years of development of radar altimetry, and the progress achieved by this methodology in the fields of global and coastal oceanography, hydrology, geodesy and cryospheric sciences. Many symbolic major events have celebrated these developments, e.g., in Venice, Italy, the 15th (2006) and 20th (2012) years of progress and more recently, in 2018, in Ponta Delgada, Portugal, 25 Years of Progress in Radar Altimetry. On this latter occasion it was decided to collect contributions of scientists, engineers and managers involved in the worldwide altimetry community to depict the state of altimetry and propose recommendations for the altimetry of the future. This paper summarizes contributions and recommendations that were collected and provides guidance for future mission design, research activities, and sustainable operational radar altimetry data exploitation. Recommendations provided are fundamental for optimizing further scientific and operational advances of oceanographic observations by altimetry, including requirements for spatial and temporal resolution of altimetric measurements, their accuracy and continuity. There are also new challenges and new openings mentioned in the paper that are particularly crucial for observations at higher latitudes, for coastal oceanography, for cryospheric studies and for hydrology. The paper starts with a general introduction followed by a section on Earth System Science including Ocean Dynamics, Sea Level, the Coastal Ocean, Hydrology, the Cryosphere and Polar Oceans and the “Green” Ocean, extending the frontier from biogeochemistry to marine ecology. Applications are described in a subsequent section, which covers Operational Oceanography, Weather, Hurricane Wave and Wind Forecasting, Climate projection. Instruments’ development and satellite missions’ evolutions are described in a fourth section. A fifth section covers the key observations that altimeters provide and their potential complements, from other Earth observation measurements to in situ data. Section 6 identifies the data and methods and provides some accuracy and resolution requirements for the wet tropospheric correction, the orbit and other geodetic requirements, the Mean Sea Surface, Geoid and Mean Dynamic Topography, Calibration and Validation, data accuracy, data access and handling (including the DUACS system). Section 7 brings a transversal view on scales, integration, artificial intelligence, and capacity building (education and training). Section 8 reviews the programmatic issues followed by a conclusion

Nurses' perceptions of aids and obstacles to the provision of optimal end of life care in ICU

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