Clomeleon Biosensor-Mauslinien zur optophysiologischen Bestimmung der intrazellulären Chloridkonzentration in Nervenzellen

Chlorid hat eine weitreichende Bedeutung für die neuronale Signalverarbeitung. Seine intrazelluläre Konzentration entscheidet, ob GABA oder Glyzin eine erregende oder hemmende Wirkung auf Nervenzellen haben. Entgegen seiner physiologischen Bedeutung stehen nur wenige, mit Problemen in der Anwendung behaftete Techniken zur Verfügung, um intrazelluläre Chloridkonzentrationen messen zu können. Clomeleon ist ein ratiometrischer, genetisch kodierter Chloridindikator bestehend aus einer Fusion von cyan- und gelb-fluoreszierendem Protein, der nichtinvasive Chloridmessungen an lebendem Gewebe erlaubt. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit Strategien diesen Indikator in Biosensor-Mauslinien nutzbar zu machen und deren Anwendbarkeit anhand der Frage nach der Entwicklungsabhängigkeit der Chloridkonzentration von Neuronen zu testen. Es wurden sieben Linien transgener Mäuse generiert, die den Indikator unter Kontrolle des Thy1-Promotors exprimieren. Die Linien unterschieden sich in dem Expressionsmuster von Clomeleon. Generell wurde in diesen Linien eine weitverbreitete und hohe Expression des Indikators gefunden. Diese Mauslinien sind für Populations-Imaging gut geeignet. Einzelzell-Imaging ist durch die dichte Expression anspruchsvoll und verlangt nach einem quantitativen Ansatz, der unter definierten Messbedingungen die Ermittlung eines Hintergrundes erlaubt. Unter Beachtung dieser Einschränkung konnte an akuten Hirnschnitten dieser Linie der postulierte Abfall intrazellulärer Chloridkonzentrationen in Nervenzellen nach der Geburt gezeigt werden. Ausgehend von einer Konzentration von 21 mM bei P5 fällt die Chloridkonzentration bis auf 6 mM bei P20. Daraus folgt eine Umpolung der GABAergen Antwort bei P14. Darüberhinaus wurde eine universelle Clomeleon-Indikatormauslinie auf Basis des ubiquitär aktiven ROSA26-Promotors und einer loxP-flankierten Stopp-Kassette erzeugt. Durch Verpaarung mit einer Cre-Aktivatormauslinie erlaubt diese Linie die Expression des Indikators in genetisch definierten Zellpopulationen. Dieses Konzept birgt enorme Möglichkeiten zur Verbesserung der Imagingbedingungen. Einerseits stammt alles gesammelte Licht aus derselben genetisch identifizierten Zellpopulation, was die Aussagekraft von Populationssignalen erhöht. Andererseits besteht für das Einzelzell-Imaging die Chance vereinzelt stehende markierte Zellen zu erhalten, was die für quantitatives Imaging notwendige Hintergrundsbestimmung vereinfacht. Durch die niedrige Expression von Clomeleon in Nervengewebe sind intensitätsbasierte Imagingmethoden nur sehr eingeschränkt möglich, die Verwendung von 2P FLIM bietet jedoch eine sehr erfolgversprechende Möglichkeit, quantitative Messungen trotz der niederen Fluoreszenz durchführen zu können. Ein vergleichbares Konzept verfolgten wir durch Kombination von viralen Gentransfer und Techniken konditionaler Genaktivierung. Hier gelang es durch Infektion mit dem für Zellen völlig untoxischen rekombinanten AAV1/2-Virus in transgenen Aktivator-Mauslinien eine ausserordentlich hohe Expression von Clomeleon in genetisch definierten Nervenzellen zu erhalten. Diese Situation schafft ideale Voraussetzungen für das Imaging einzelner Zellen. Es konnte gezeigt werden, dass die chronische Expression von Clomelon in Biosensor-Mauslinien erfolgreich zur nichtinvasiven, optophysiologischen Darstellung der intrazellulären Chloridkonzentration eingesetzt werden können. Damit steht ein neues Werkzeug zur Verfügung, mit welchem viele, bisher experimentell nicht zugängliche biologische Fragestellungen nunmehr untersucht werden können

Four-level and two-qubit systems, sub-algebras, and unitary integration

Four-level systems in quantum optics, and for representing two qubits in quantum computing, are difficult to solve for general time-dependent Hamiltonians. A systematic procedure is presented which combines analytical handling of the algebraic operator aspects with simple solutions of classical, first-order differential equations. In particular, by exploiting $su(2) \oplus su(2)$ and $su(2) \oplus su(2) \oplus u(1)$ sub-algebras of the full SU(4) dynamical group of the system, the non-trivial part of the final calculation is reduced to a single Riccati (first order, quadratically nonlinear) equation, itself simply solved. Examples are provided of two-qubit problems from the recent literature, including implementation of two-qubit gates with Josephson junctions.Comment: 1 gzip file with 1 tex and 9 eps figure files. Unpack with command: gunzip RSU05.tar.g

Imaging synaptic inhibition throughout the brain via genetically targeted Clomeleon.

Here we survey a molecular genetic approach for imaging synaptic inhibition. This approach is based on measuring intracellular chloride concentration ([Cl(-)](i)) with the fluorescent chloride indicator protein, Clomeleon. We first describe several different ways to express Clomeleon in selected populations of neurons in the mouse brain. These methods include targeted viral gene transfer, conditional expression controlled by Cre recombination, and transgenesis based on the neuron-specific promoter, thy1. Next, we evaluate the feasibility of using different lines of thy1::Clomeleon transgenic mice to image synaptic inhibition in several different brain regions: the hippocampus, the deep cerebellar nuclei (DCN), the basolateral nucleus of the amygdala, and the superior colliculus (SC). Activation of hippocampal interneurons caused [Cl(-)](i) to rise transiently in individual postsynaptic CA1 pyramidal neurons. [Cl(-)](i) increased linearly with the number of electrical stimuli in a train, with peak changes as large as 4 mM. These responses were largely mediated by GABA receptors because they were blocked by antagonists of GABA receptors, such as GABAzine and bicuculline. Similar responses to synaptic activity were observed in DCN neurons, amygdalar principal cells, and collicular premotor neurons. However, in contrast to the hippocampus, the responses in these three regions were largely insensitive to antagonists of inhibitory neurotransmitter receptors. This indicates that synaptic activity can also cause Cl(-) influx through alternate pathways that remain to be identified. We conclude that Clomeleon imaging permits non-invasive, spatiotemporally precise recordings of [Cl(-)](i) in a large variety of neurons, and provides new opportunities for imaging synaptic inhibition and other forms of neuronal chloride signaling