Development of a Reverse Genetic System to Generate Recombinant Chimeric Tacaribe Virus that Expresses Junín Virus Glycoproteins

Mammarenaviruses are enveloped and segmented negative-stranded RNA viruses that comprise several pathogenic members associated with severe human hemorrhagic fevers. Tacaribe virus (TCRV) is the prototype for the New World group of mammarenaviruses and is not only naturally attenuated but also phylogenetically and antigenically related to all South American pathogenic mammarenaviruses, particularly the Junín virus (JUNV), which is the etiological agent of Argentinian hemorrhagic fever (AHF). Moreover, since TCRV protects guinea pigs and non-human primates from lethal challenges with pathogenic strains of JUNV, it has already been considered as a potential live-attenuated virus vaccine candidate against AHF. Here, we report the development of a reverse genetic system that relies on T7 polymerase-driven intracellular expression of the complementary copy (antigenome) of both viral S and L RNA segments. Using this approach, we successfully recovered recombinant TCRV (rTCRV) that displayed growth properties resembling those of authentic TCRV. We also generated a chimeric recombinant TCRV expressing the JUNV glycoproteins, which propagated similarly to wild-type rTCRV. Moreover, a controlled modification within the S RNA 5′ non-coding terminal sequence diminished rTCRV propagation in a cell-type dependent manner, giving rise to new perspectives where the incorporation of additional attenuation markers could contribute to develop safe rTCRV-based vaccines against pathogenic mammarenaviruses.Fil: Foscaldi, Sabrina Andrea. Ministerio de Produccion y Trabajo. Secretaria de Gobierno de Agroindustria. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. Centro de Virologia Animal. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Virologia Animal.; ArgentinaFil: Loureiro, Maria Eugenia. Ministerio de Produccion y Trabajo. Secretaria de Gobierno de Agroindustria. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. Centro de Virologia Animal. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Virologia Animal.; ArgentinaFil: Sepúlveda, Claudia Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Palacios, Carlos Adolfo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein". Fundación Pablo Cassará. Instituto de Ciencia y Tecnología "Dr. César Milstein"; ArgentinaFil: Forlenza, María Belén. Ministerio de Produccion y Trabajo. Secretaria de Gobierno de Agroindustria. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. Centro de Virologia Animal. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Virologia Animal.; ArgentinaFil: Lopez, Nora Mabel. Ministerio de Produccion y Trabajo. Secretaria de Gobierno de Agroindustria. Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria. Centro de Virologia Animal. - Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Ciudad Universitaria. Centro de Virologia Animal.; Argentin

Early events in Junin Virus replication cycle: virus interaction with C-type lectins

El virus Junín (JUNV) es el agente etiológico de la fiebre hemorrágica argentina (FHA), una enfermedad zoonótica que afecta el área central de la Pampa húmeda de la República Argentina. Distintos mecanismos de endocitosis son utilizados en las infecciones virales. En la línea celular Vero, el complejo glicoproteico presente en los viriones es el responsable de las interacciones iniciales con el receptor celular de transferrina 1 (TfR1) y la entrada a la célula es por endocitosis mediada por vesículas recubiertas de clatrina. En varias familias de virus envueltos, su entrada y diseminación pueden estar mediadas por lectinas de tipo C. Las mismas son proteínas transmembrana tipo 2, constituyen una amplia familia de receptores que reconocen estructuras específicas de carbohidratos presentes en patógenos y se encuentra presente principalmente en células dendríticas inmaduras, macrófagos y células endoteliales. Una de ellas, DC-SIGN posee un rol importante en los estadios iniciales de la respuesta inmune, reconoce estructuras internas ramificadas de manosas y posee funciones de receptor para varios virus. DC-SIGN se compone por un dominio extracelular de reconocimiento a carbohidratos (DRC) que une residuos con carbohidratos de alta manosa y una cola citoplasmática con motivos conservados de dileucinas (LL) y un cluster triacídico (EEE). Debido a que JUNV presenta proteínas altamente glicosiladas, y que en los estadíos de la infección temprana interactuaría con células dendríticas y otras del sistema inmune, en este trabajo se estudió la interacción de JUNV con DC-SIGN y el mecanismo endocítico asociado a la misma. Los resultados demuestran que DC-SIGN actúa como un auténtico receptor para JUNV en las células que la expresan y que la entrada a las mismas es a través de endocitosis utilizando vesículas recubiertas de clatrina con dependencia de colesterol y filamentos de actina corticales intactos.Junin Virus (JUNV) is a member of the Arenaviridae family and the etiologic agent of Argentine Hemorrhagic fever (AHF), a zoonotic illness affecting the farming land of Argentina. Several endocytic pathways are used during viral infections. In Vero cell line, the glycoprotein complex present in virions is responsible of interaction with Transferrin receptor type I (TfR1) and internalization is clathrin mediated. Entry and dissemination of several envelope viruses are mediated by C-type lectins. These are transmembrane proteins that are expressed in immature dendritic, macrophages and endothelial cells, integrating a family of receptors which recognize specific carbohydrates present in pathogens. One of them, Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing Nonintegrin (DC-SIGN) has an important role during the initial stages of the immune response, recognizes high mannose residues and is considered as a receptor for several viruses. DC-SIGN is composed by an extracellular carbohydrate recognition domain (CRD) and a cytoplasmic tail containing conserved motives as dileucine (LL) and triacidic cluster (EEE). As JUNV presents highly glycosylated proteins and that during initial steps of the infection, JUNV would interact with dendritic cells and others belonging to the immune system, in this work we studied the interaction between JUNV and DC-SIGN and the entry pathway associated with this. Taken together our results demonstrate that DC-SIGN is a real receptor for JUNV and that the main entry pathway involved is clathrin mediated endocytosis and it depends on cholesterol and intact cortical actin filaments.Fil:Forlenza, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Entry studies of new world arenaviruses

Identification of cell moieties involved in viral binding and internalization is essential since their expression would render a cell susceptible. Further steps that allow the uncoating of the viral particle at the right subcellular localization have been intensively studied. These “entry” steps could determine cell permissiveness and often define tissue and host tropism. Therefore applying the right and, when possible, straightforward experimental approaches would shorten avenues to the complete knowledge of this first and key step of any viral life cycle. Mammarenaviruses are enveloped viruses that enter the host cell via receptor-mediated endocytosis. In this chapter we present a set of customized experimental approaches and tools that were used to describe the entry of Junín virus (JUNV), and other New World mammarenavirus members, into mammalian cells.Fil: Martinez, María Guadalupe. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Albert Einstein College of Medicine; Estados UnidosFil: Forlenza, María Belén Forlenza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Candurra, Nélida Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Cordo, Sandra Myriam. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin

Human transferrin receptor triggers an alternative Tacaribe virus internalization pathway

Tacaribe virus (TCRV) entry occurs by receptor-mediated endocytosis. To explore the entry mechanism used by TCRV, the inhibitory effects of drugs and dominant negative (DN) constructions affecting the main endocytic pathways were analyzed. In cells lacking the human transferrin receptor (hTfR), compounds and DN proteins that impair clathrin-mediated endocytosis were shown to reduce virus internalization without affecting virion binding. In contrast, in cells expressing the hTfR, compounds that affect clathrin-mediated endocytosis did not affect TCRV infection. Destabilization of cholesterol-rich plasma membrane microdomains by treatment with nystatin was not able to block virus entry in the presence of hTfR. However methyl-β-cyclodextrin, which extracts cholesterol from cell membranes, reduced virus internalization in cells expressing the hTfR. Inhibition of dynamin and neutralization of the pH of intracellular vesicles reduced virus internalization in all cell lines tested. Taken together, these results demonstrate that in cells expressing the hTfR, TCRV internalization depends on the presence of cholesterol, dynamin and acidic intracellular vesicles, while in the rest of the cell lines analyzed, clathrin-mediated endocytosis is the main TCRV entry pathway and, as expected, depends on dynamin and acidic intracellular vesicles. These results represent an important contribution to the characterization of the arenavirus replication cycle.Fil: Roldan, Julieta Suyay. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Martinez, Maria g.. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Albert Einstein School Of Medicine; Estados Unidos. Cornell University; Estados UnidosFil: Forlenza, María Belén Forlenza. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; ArgentinaFil: Whittaker, Gary R.. Cornell University; Estados UnidosFil: Candurra, Nélida Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentin

A direct high-throughput in Cell-ELISA for measuring infectivity of cytopathic and non-cytopathic bovine viral diarrhoea virus strains applied to the assessment of antiviral activity

Low-cost high-throughput methods applicable to any virus strain are required for screening antiviral compounds against multiple field strains. Colorimetric cell-viability assays are used for this purpose as long as the viruses are cytopathic (CP) in cell culture. However, bovine viral diarrhoea virus (BVDV) strains circulating in the field are mostly non-cytopathic (NCP). An In Cell-ELISA aimed to measure viral infectivity by detecting a conserved protein produced during viral replication (non-structural protein 3, “NS3”) was developed. The ELISA is performed without harvesting the cells, directly on the 96-wells culture plate. NS3 In Cell-ELISA was tested for its ability to assess BVDV-specific antiviral activity of recombinant bovine type I and III IFNs. Results correlated to those measured by qRT-PCR and virus titration. NS3 In Cell-ELISA was also efficient in estimating the IC50 of two compounds with different antiviral activity. Estimation of the 50% inhibition dose of each IFN using six BVDV strains of different biotype and genotype showed that CP strains were more susceptible to both IFNs than NCP, while type 2 NCP viruses were more sensitive to IFN-I. The In Cell-ELISA format using a detector antibody against a conserved non-structural protein can be potentially applied to accurately measure infectivity of any viral strain.Instituto de VirologíaFil: Quintana, María Eugenia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas; Argentina.Fil: Barone, Lucas. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina.Fil: Forlenza, María Belén. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina.Fil: Trotta, Myrian Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina.Fil: Turco, Cecilia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina.Fil: Mansilla, Florencia Celeste. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina.Fil: Cardoso, Nancy Patricia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas; Argentina.Fil: Capozzo, Alejandra Victoria. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas; Argentina