Caracterización celular y molecular de la sialiltransferasa ST3GAL-II : rol del disialogangliosido GD1a en la unión y endocitosis de anticuerpos asociados a Neuropatologías experimentales

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017Los gangliósidos, una gran familia de glicoesfingolípidos ácidos, se componen de un segmento hidrofóbico, la ceramida, y un oligosacárido mono o polisialilado de longitud y composición variable. En las células, los gangliósidos se encuentran principalmente en la hemicapa externa de la membrana plasmática a la cual se insertan a través del residuo ceramida exponiendo el oligosacárido hacia el medioambiente extracelular. Estos glicolípidos han sido implicados en numerosos procesos fisiológicos que incluyen, crecimiento, diferenciación, migración y apoptosis entre otros, a través de la modulación de la actividad de receptores de membrana y de interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular. Además de su rol fisiológico, los gangliósidos también han sido asociados a un amplio espectro de procesos patológicos siendo receptores de virus, toxinas, lectinas y anticuerpos. Durante el presente trabajo de tesis se abordó el estudio de la unión y comportamiento endocítico de diferentes anticuerpos anti-glicolípidos (AGAb), particularmente de inmunoglobulinas que reconocen a los gangliósidos GD1a y GM1 en varias líneas celulares en cultivo. En primera instancia se caracterizó la unión, endocitosis y destino intracelular de diferentes anticuerpos monoclonales de isotipo IgG que unen con alta afinidad al gangliósido GD1a en células epiteliales derivadas de ovario de hámster chino (CHO-K1) y en células derivadas de neuroblastoma murino (Neuro-2a). Luego de unirse a membrana plasmática, una fracción minoritaria de un anticuerpo anti-GD1a (Ab1-GD1a) fue rápidamente endocitada a 37°C en células epiteliales mediante un mecanismo independiente de dinamina-2 y dependiente de Arf-6 colocalizando en una región yuxtanuclear principalmente con marcadores de endosomas de reciclado. Mientras que la cantidad asociada a la fracción celular fue mínima (20-25%) una fracción mayoritaria del anticuerpo inicialmente unida a membrana plasmática, fue recuperada en el medio de cultivo. Este anticuerpo permaneció principalmente localizado en la superficie celular en experimentos de endocitosis a 16°C, contrastando con la eficiente endocitosis de la proteína transferrina y de otro complejo gangliósido-anticuerpo (GD3-R24) a esta temperatura. Esta evidencia experimental sugiere la presencia de mecanismos selectivos de internalización celular de complejos gangliósidos-anticuerpos. Para determinar si la unión a membrana, endocitosis y destino intracelular es una característica compartida por los anticuerpos anti-GD1a, se incluyó en el estudio otro anticuerpo monoclonal anti-GD1a de diferente isotipo (Ab2-GD1a). Los resultados obtenidos muestran una mínima endocitosis de este anticuerpo en células epiteliales que involucra un mecanismo dependiente de Arf-6, junto con una drástica y rápida reducción de los niveles totales de Ab2-GD1a y localización del anticuerpo endocitado en una región yuxtanuclear. Esto indica un comportamiento comparable de ambos anticuerpos que reconocen GD1a sugiriendo que comparten procesos similares de unión y endocitosis en células epiteliales. Ab2-GD1a se une eficientemente a la superficie de células derivadas de neuroblastoma y se registra un moderado descenso de los niveles totales del anticuerpo comparado con la drástica reducción observada en las células epiteliales. Esto sugiere que el procesamiento endocítico de los anticuerpos anti-GD1a analizados también depende del tipo celular. Los estudios de unión y endocitosis fueron también investigados para un anticuerpo monoclonal contra el gangliósido GM1 (Ab2-GM1). Este anticuerpo se unió eficientemente a la membrana plasmática de células CHO-K1 y una fracción mayoritaria (60-70%) fue rápidamente endocitada a 37°C y acumulada en un compartimiento yuxtanuclear contrastando con la mínima endocitosis descripta para los anticuerpos que reconocen GD1a. Además, los niveles de Ab2-GM1 permanecieron inalterados y principalmente asociados a la membrana plasmática cuando los experimentos de endocitosis se realizaron a 37°C en células Neuro-2a, contrastando con lo observado para los anticuerpos anti-GD1a en esta línea celular. Por lo tanto, se observó que bajo idénticas condiciones experimentales, el tiempo de residencia en membrana plasmática y la fracción endocitada de anticuerpos anti-GD1a y anti-GM1 fueron notoriamente diferentes. En su conjunto, los datos experimentales sugieren que el comportamiento endocítico y procesamiento celular de cada anticuerpo anti-gangliósido puede variar en función del tipo de anticuerpo y del tipo celular, lo cual representa un aspecto clave a considerar en el estudio de sus roles patogénicos en neuropatías así como también en su uso como herramientas terapéuticas. Los gangliósidos son sintetizados por un conjunto de enzimas glicosiltransferasas y sialiltransferasas residentes de retículo endoplásmico (RE) y del complejo de Golgi. Éstas enzimas, en muchos casos organizadas como complejos multienzimáticos, utilizan como sustrato de partida ceramida (Cer) e incorporan monosacáridos de forma secuencial de manera que el producto de una enzima es sustrato de la siguiente en la vía biosintética (Fig. I-1). Como parte de este trabajo de tesis se caracterizó por primera vez la expresión, localización subcelular y modificaciones postraduccionales de la sialiltransferasa humana ST3Gal-II. Ésta es la principal enzima responsable de la biosíntesis in vivo del gangliósido GD1a a partir de GM1, ambos gangliósidos blanco de los anticuerpos anti-glicolípidos estudiados en la segunda parte de esta tesis. II es una proteína transmembrana tipo-II con un corto segmento citoplasmático N-terminal, un fragmento transmembrana y un gran dominio C-terminal orientado hacia el lumen del complejo de Golgi que contiene el sitio catalítico. La secuencia primaria de aminoácidos revela dos sitios potenciales de N-glicosilación, asparagina 92 y asparagina 211 (Asn92 y Asn211). Mediante ensayos bioquímicos, farmacológicos, de microscopía confocal y mutagénesis sitio dirigida se caracterizó la expresión, localización subcelular, ocupación y relevancia de los sitios de N-glicosilación en la localización y actividad in vitro de la enzima. ST3Gal-II se localiza en el complejo de Golgi de células CHO-K1 con predominio en compartimientos proximales y se expresa en similar proporción de monómero y dímero sensible al tratamiento con agentes reductores. La enzima se encuentra N-glicosilada principalmente en Asn211 y el glicano no es del tipo complejo, sino que contiene una alta proporción de residuos de manosa. La presencia del N-glicano en dicha posición es necesaria para la salida de la enzima del RE y su transporte y localización en el complejo de Golgi. La carencia del N-glicano en posición 211 influencia de manera negativa la actividad sialiltransferasa in vitro utilizando como aceptor un gangliósido (GM1) o una glicoproteína (asialofetuina), mientras que la falta del mismo en la posición 92 no afecta la actividad hacia la glicoproteína e influencia de manera positiva la actividad hacia el gangliósido. Una versión quimérica conteniendo el dominio N-terminal (NtD) de ST3Gal-II (aminoácidos 1-51) fusionada a la proteína fluorescente mCherry (ST3Gal-II-1-51-mCherry) se expresa en células CHO-K1 y se localiza en el complejo de Golgi. Esto sugiere que el NtD es necesario para el transporte desde el RE y retención de ST3Gal-II en el complejo de Golgi. Además, indicaría que el dominio C-terminal de ST3Gal-II depende de la N-glicosilación para alcanzar un estado conformacional óptimo de plegamiento que le permita salir del RE para localizarse adecuadamente en el aparato de Golgi, probablemente como un requerimiento del control de calidad de plegamiento de proteínas en RE, pero no sería un requerimiento excluyente para la retención de la enzima en el complejo de Golgi. Asimismo, el residuo cisteína presente en el NtD de ST3Gal-II tendría un rol en la formación y estabilización de la forma dimérica.Ruggiero, Fernando Miguel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Cuadra, Gabriel Ricardo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina.D´Alessio, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina

Glycosylation of glycolipids in cancer: basis for development of novel therapeutic approaches

Altered networks of gene regulation underlie many pathologies, including cancer. There are several proteins in cancer cells that are turned either on or off, which dramatically alters the metabolism and the overall activity of the cell, with the complex machinery of enzymes involved in the metabolism of glycolipids not being an exception. The aberrant glycosylation of glycolipids on the surface of the majority of cancer cells, associated with increasing evidence about the functional role of these molecules in a number of cellular physiological pathways, has received considerable attention as a convenient immunotherapeutic target for cancer treatment. This has resulted in the development of a substantial number of passive and active immunotherapies, which have shown promising results in clinical trials. More recently, antibodies to glycolipids have also emerged as an attractive tool for the targeted delivery of cytotoxic agents, thereby providing a rationale for future therapeutic interventions in cancer. This review first summarizes the cellular and molecular bases involved in the metabolic pathway and expression of glycolipids, both in normal and tumor cells, paying particular attention to sialosylated glycolipids (gangliosides). The current strategies in the battle against cancer in which glycolipids are key players are then described.Fil: Daniotti, Jose Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Vilcaes, Aldo Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Torres Demichelis, Vanina Andrea. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Ruggiero, Fernando Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Rodríguez Walker, Macarena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Métodos y técnicas de monitoreo y predicción temprana en los escenarios de riesgos socionaturales

Esta obra concentra los métodos y las técnicas fundamentales para el seguimiento y monitoreo de las dinámicas de los escenarios de riesgos socionaturales (geológicos e hidrometeorológicos) y tiene como objetivo general orientar, apoyar y acompañar a los directivos y operativos de protección civil en aterrizar las acciones y políticas públicas enfocadas a la gestión del riesgo local de desastre

New genetic loci link adipose and insulin biology to body fat distribution.

Body fat distribution is a heritable trait and a well-established predictor of adverse metabolic outcomes, independent of overall adiposity. To increase our understanding of the genetic basis of body fat distribution and its molecular links to cardiometabolic traits, here we conduct genome-wide association meta-analyses of traits related to waist and hip circumferences in up to 224,459 individuals. We identify 49 loci (33 new) associated with waist-to-hip ratio adjusted for body mass index (BMI), and an additional 19 loci newly associated with related waist and hip circumference measures (P < 5 × 10(-8)). In total, 20 of the 49 waist-to-hip ratio adjusted for BMI loci show significant sexual dimorphism, 19 of which display a stronger effect in women. The identified loci were enriched for genes expressed in adipose tissue and for putative regulatory elements in adipocytes. Pathway analyses implicated adipogenesis, angiogenesis, transcriptional regulation and insulin resistance as processes affecting fat distribution, providing insight into potential pathophysiological mechanisms

Elective cancer surgery in COVID-19-free surgical pathways during the SARS-CoV-2 pandemic: An international, multicenter, comparative cohort study

PURPOSE As cancer surgery restarts after the first COVID-19 wave, health care providers urgently require data to determine where elective surgery is best performed. This study aimed to determine whether COVID-19–free surgical pathways were associated with lower postoperative pulmonary complication rates compared with hospitals with no defined pathway. PATIENTS AND METHODS This international, multicenter cohort study included patients who underwent elective surgery for 10 solid cancer types without preoperative suspicion of SARS-CoV-2. Participating hospitals included patients from local emergence of SARS-CoV-2 until April 19, 2020. At the time of surgery, hospitals were defined as having a COVID-19–free surgical pathway (complete segregation of the operating theater, critical care, and inpatient ward areas) or no defined pathway (incomplete or no segregation, areas shared with patients with COVID-19). The primary outcome was 30-day postoperative pulmonary complications (pneumonia, acute respiratory distress syndrome, unexpected ventilation). RESULTS Of 9,171 patients from 447 hospitals in 55 countries, 2,481 were operated on in COVID-19–free surgical pathways. Patients who underwent surgery within COVID-19–free surgical pathways were younger with fewer comorbidities than those in hospitals with no defined pathway but with similar proportions of major surgery. After adjustment, pulmonary complication rates were lower with COVID-19–free surgical pathways (2.2% v 4.9%; adjusted odds ratio [aOR], 0.62; 95% CI, 0.44 to 0.86). This was consistent in sensitivity analyses for low-risk patients (American Society of Anesthesiologists grade 1/2), propensity score–matched models, and patients with negative SARS-CoV-2 preoperative tests. The postoperative SARS-CoV-2 infection rate was also lower in COVID-19–free surgical pathways (2.1% v 3.6%; aOR, 0.53; 95% CI, 0.36 to 0.76). CONCLUSION Within available resources, dedicated COVID-19–free surgical pathways should be established to provide safe elective cancer surgery during current and before future SARS-CoV-2 outbreaks

Elective Cancer Surgery in COVID-19-Free Surgical Pathways During the SARS-CoV-2 Pandemic: An International, Multicenter, Comparative Cohort Study.

PURPOSE: As cancer surgery restarts after the first COVID-19 wave, health care providers urgently require data to determine where elective surgery is best performed. This study aimed to determine whether COVID-19-free surgical pathways were associated with lower postoperative pulmonary complication rates compared with hospitals with no defined pathway. PATIENTS AND METHODS: This international, multicenter cohort study included patients who underwent elective surgery for 10 solid cancer types without preoperative suspicion of SARS-CoV-2. Participating hospitals included patients from local emergence of SARS-CoV-2 until April 19, 2020. At the time of surgery, hospitals were defined as having a COVID-19-free surgical pathway (complete segregation of the operating theater, critical care, and inpatient ward areas) or no defined pathway (incomplete or no segregation, areas shared with patients with COVID-19). The primary outcome was 30-day postoperative pulmonary complications (pneumonia, acute respiratory distress syndrome, unexpected ventilation). RESULTS: Of 9,171 patients from 447 hospitals in 55 countries, 2,481 were operated on in COVID-19-free surgical pathways. Patients who underwent surgery within COVID-19-free surgical pathways were younger with fewer comorbidities than those in hospitals with no defined pathway but with similar proportions of major surgery. After adjustment, pulmonary complication rates were lower with COVID-19-free surgical pathways (2.2% v 4.9%; adjusted odds ratio [aOR], 0.62; 95% CI, 0.44 to 0.86). This was consistent in sensitivity analyses for low-risk patients (American Society of Anesthesiologists grade 1/2), propensity score-matched models, and patients with negative SARS-CoV-2 preoperative tests. The postoperative SARS-CoV-2 infection rate was also lower in COVID-19-free surgical pathways (2.1% v 3.6%; aOR, 0.53; 95% CI, 0.36 to 0.76). CONCLUSION: Within available resources, dedicated COVID-19-free surgical pathways should be established to provide safe elective cancer surgery during current and before future SARS-CoV-2 outbreaks

Reducing the environmental impact of surgery on a global scale: systematic review and co-prioritization with healthcare workers in 132 countries

Abstract Background Healthcare cannot achieve net-zero carbon without addressing operating theatres. The aim of this study was to prioritize feasible interventions to reduce the environmental impact of operating theatres. Methods This study adopted a four-phase Delphi consensus co-prioritization methodology. In phase 1, a systematic review of published interventions and global consultation of perioperative healthcare professionals were used to longlist interventions. In phase 2, iterative thematic analysis consolidated comparable interventions into a shortlist. In phase 3, the shortlist was co-prioritized based on patient and clinician views on acceptability, feasibility, and safety. In phase 4, ranked lists of interventions were presented by their relevance to high-income countries and low–middle-income countries. Results In phase 1, 43 interventions were identified, which had low uptake in practice according to 3042 professionals globally. In phase 2, a shortlist of 15 intervention domains was generated. In phase 3, interventions were deemed acceptable for more than 90 per cent of patients except for reducing general anaesthesia (84 per cent) and re-sterilization of ‘single-use’ consumables (86 per cent). In phase 4, the top three shortlisted interventions for high-income countries were: introducing recycling; reducing use of anaesthetic gases; and appropriate clinical waste processing. In phase 4, the top three shortlisted interventions for low–middle-income countries were: introducing reusable surgical devices; reducing use of consumables; and reducing the use of general anaesthesia. Conclusion This is a step toward environmentally sustainable operating environments with actionable interventions applicable to both high– and low–middle–income countries

Exploiting the internalization feature of an antibody against the glycosphingolipid SSEA-4 to deliver immunotoxins in breast cancer cells

The stage-specific embryonic antigen-4 (SSEA-4) is a cell surface glycosphingolipid antigen expressed in early stages of human development. This surface marker is downregulated during the differentiation process but is found re-expressed in several types of tumors, including breast cancer. This feature makes SSEA-4 an attractive target for the development of therapeutic antibodies against tumors. In this work, we first studied the binding and intracellular fate of the monoclonal antibody MC-813-70 directed against SSEA-4. MC-813-70 was found to be rapidly internalized into triple-negative breast cancer cells following binding to its target at the plasma membrane, and to accumulate in acidic organelles, most likely lysosomes. Given the internalization feature of MC-813-70, we next tested whether the antibody was able to selectively deliver the saporin toxin inside SSEA-4-expressing cells. Results show that the immunotoxin complex was properly endocytosed and able to reduce cell viability of breast cancer cells in vitro, either alone or in combination with chemotherapeutic drugs. Our findings indicate that the MC813-70 antibody has the potential to be developed as an alternative targeted therapeutic agent for cancer cells expressing the SSEA-4 glycolipid.Fil: Ruggiero, Fernando Miguel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Rodríguez Walker, Macarena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Daniotti, Jose Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentin

Membrane binding, endocytic trafficking and intracellular fate of high-affinity antibodies to gangliosides GD1a and GM1

Gangliosides are glycolipids embedded in the outer leaflets of the plasma membrane. Antibodies against GM1 and GD1a gangliosides are associated with selective dysfunction of motor axons in peripheral neuropathies, and differential endocytic processing of antibodies to gangliosides represent a critical modulator of site-specific injury in Guillain-Barré syndrome. In addition, antibodies to glycolipids have emerged as an attractive tool for therapeutic interventions in cancer. In this work, we have investigated the binding, endocytosis and intracellular fate of high-affinity antibodies to gangliosides GD1a and GM1 both in epithelial and neuronal-like cells. Live cell imaging and fluorometric analysis showed that, after specific plasma membrane binding, a fraction of antibody to GD1a was slightly but rapidly internalized by a dynamin 2-independent pathway and then accumulated in the endocytic recycling compartment. We also show that internalization of antibody to GD1a is regulated by ADP-ribosylation factor 6. Surprisingly, experiment of cellular antibody uptake performed at 16 °C, widely used to accumulate the endocytic cargo in sorting endosomes, showed that the antibody to GD1a remained mostly localized at the plasma membrane, supporting the presence of selective mechanisms for cell internalization of antibody-ganglioside complex. In contrast, antibody to GM1 was endocyted in epithelial cells but remained at the plasma membrane of neuronal-like cells. Together, these results provide additional evidences about the molecular mechanisms that operate in the uptake and intracellular trafficking dynamics of antibodies to glycolipids and have significant translational implications for the understanding of clinical characteristics of anti-ganglioside antibody-mediated neuropathies and for the development of novel therapeutics targeting.Fil: Ruggiero, Fernando Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Vilcaes, Aldo Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Yuki, Nobuhiro. Department Of Neurology, Mishima Hospital; JapónFil: Daniotti, Jose Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Critical role of evolutionarily conserved glycosylation at Asn211in the intracellular trafficking and activity of sialyltransferase ST3Gal-II

ST3Gal-II, a type II transmembrane protein, is the main mammalian sialyltransferase responsible for GD1a and GT1b ganglioside biosynthesis in brain. It contains two putative N-glycosylation sites (Asn92 and Asn211). Whereas Asn92 is only conserved in mammalian species, Asn211 is highly conserved in mammals, birds and fish. The present study explores the occupancy and relevance for intracellular trafficking and enzyme activity of these potential N-glycosylations in human ST3Gal-II. We found that ST3Gal-II distributes along the Golgi complex, mainly in proximal compartments. By pharmacological, biochemical and site-directed mutagenesis, we observed that ST3Gal-II is mostly N-glycosylated at Asn211 and that this co-translational modification is critical for its exit from the endoplasmic reticulum and proper Golgi localization. The individual N-glycosylation sites had different effects on ST3Gal-II enzymatic activity. Whereas the N-glycan at position Asn211 seems to negatively influence the activity of the enzyme using both glycolipid and glycoprotein as acceptor substrates, the single N-glycan mutant at Asn92 had only a moderate effect. Lastly, we demonstrated that the N-terminal ST3Gal-II domain containing the cytosolic, transmembrane and stem region (amino acids 1-51) is able to drive a protein reporter out of the endoplasmic reticulum and to retain it in the Golgi complex. This suggests that the C-terminal domain of ST3Gal-II depends on N-glycosylation to attain an optimum conformation for proper exit from the endoplasmic reticulum, but it does not represent an absolute requirement for Golgi complex retention of the enzyme.Fil: Ruggiero, Fernando Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Vilcaes, Aldo Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Iglesias Bartolome, Ramiro. National Institutes of Health; Estados UnidosFil: Daniotti, Jose Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin