Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding

Die ständige Weiterentwicklung der Computer-Hardware und die daraus resultierende Steigerung der Rechenleistung ermöglicht heutzutage eine erfolgreiche Modellierung von chemischen und biologischen Prozessen, die vor 20 Jahren noch undenkbar war. Als Beispiele sind Molekulardynamik-Simulationen grosser Biomoleküle, die Berechnung freier Bindungsenergien von Protein-Ligand-Komplexen oder auch Untersuchungen von Reaktionswegen in Enzymen zu nennen. In einem Bereich mangelt es jedoch weiterhin an akkuraten Methoden: die Abschätzung von Protonierungszuständen in Protein-Ligand-Komplexen. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Entwicklung einer neuen Methode der Ladungszuweisung, genannt PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimiert für Poisson-Boltzmann Rechnungen). Diese Methode stellt eine konsistente Ladungszuweisung sowohl für Proteine als auch für kleine organische Moleküle dar. Die Ladungen sind entscheidende Parameter bei Poisson-Boltzmann (PB)- Rechnungen. PB-Rechnungen stellen eine etablierte Methode bei der Bestimmung von pKa-Werten in Proteinen dar. Die Entwicklung von PEOE_PB-Ladungen ist notwendig geworden, da es keine generische Methode gibt, PB-basierte pKa-Berechnungen in Protein-Ligand-Komplexen durchzufÃ�hren. Der PEOE-Ansatz wurde gewählt, um zunächst die freien Solvatationsenergien kleiner organischer Moleküle bestmöglich vorherzusagen. Modifikationen wurden heuristisch, d.h. ergebnisorientiert vorgenommen, wobei Änderungen lediglich den Parameter a des PEOE-Polynoms betreffen. Bei unserer Optimierung versuchten wir zunächst, die experimentell bestimmten freien Solvatationsenergien polarer AminosÃ�uren (r2 = 0.94, RMSD = 0.84) und anschliessend eines Datensatzes von 80 kleinen organischen MolekÃ�ulen (r2 = 0.78, RMSD = 1.57) zu reproduzieren. Die Verwendung des letztgenannten Datensatzes zeigt den generischen Charakter unserer PEOE_PB-Ladungen. Abschliessend führten wir Rechnungen an einem Datensatz von neun (apo-)Proteinen mit 132 experimentell bestimmten pKa-Werten durch und erzielten einen RMSD von 0.88. Die Dielektrizitätskonstante im Protein war hierbei auf 20 gesetzt. Aminosäurereste in Bindetaschen mit stark verschobenen pKa-Werten lagen bei zwei Enzymen des Datensatzes vor, in diesen FÃ�llen wurden folgende Beobachtungen gemacht: * Die Dielektrizitätskonstante wurde von 20 auf 4 gesenkt, was teilweise durch die Vergrabenheit der Bindetasche erklärt werden kann. * Die Orientierung der Hydroxylgruppe des Tyrosins hatte einen beachtlichen Einfluss auf den pKa-Wert eines Aminosäurerestes in der Bindetasche (ein Glutamat mit einem stark erhöhten pKa-Wert). Diese Tatsache unterstreicht den entscheidenden Einfluss der Orientierung polarer Wasserstoffatome. Im letzten Schritt unserer PEOE_PB-Validierung führten wir pKa-Berechnungen für drei Protein-Ligand-Komplexe (die im Experiment einen Protonentransfer zeigten) durch: in allen Fällen stimmten unsere Berechnungen mit dem Experiment überein. In einer folgenden reinen Anwendungstudie führten wir pKa-Berechnungen für eine Serie von Liganden, die an die Serin-Proteasen Trypsin und Thrombin binden, durch. An diesen Komplexen waren bereits ausführliche ITC- und Kristallographie-Studien gemacht worden und für vier dieser Komplexe konnten Ã�nderungen in den ProtonierungszustÃ�nden detektiert werden [Dullweber et al., J. Mol. Biol. 313 (2001), 593] . Da ITC-Experimente jedoch nur gesamtheitliche Ã�nderungen in der Protonierung messen, konnten diese Experimente keinen Aufschluss darüber geben, welche funktionellen Gruppen tatsächlich am Protonentransfer beteiligt sind. Um diese Gruppen identifizieren zu können, führten wir Poisson-Boltzmann-Rechnungen, basierend auf unseren PEOE_PB-Ladungen, durch. Die resultierenden pKa-Werte zeigen, dass His57 (einer der drei katalytisch aktiven Reste) für die wichtigsten pKa-Änderungen, die sich im Experiment als Ã�nderungen im Protonierungszustand zeigen, verantwortlich ist. Dies steht im Widerspruch zu unserer frÃ�heren Annahme, dass die Ã�nderungen im Protonierugszustand an der Carboxylgruppe der Liganden ablaufen. Der neuentdeckte Protonenakzeptor wurde für die Refaktorisierung der ITC-Daten eingesetzt; dies ist wichtig für Fälle, in denen sich die Protonierung während der Komplexbildung ändert. Die pKa-Werte von Komplexen, die im ITC-Experiment keine Änderung im Protonierungszustand zeigen, werden in den meisten Fällen verlässlich vorhergesagt, während dies in Fällen stark koppelnder Systeme schwierig bleibt. Solche Fälle treten auf, wenn zwei (oder mehr) interagierende titrierbare Gruppen räumlich nahe beiander liegen. Die HIV-Protease (HIVP) ist ein bekanntes Beispiel für erfolgreiches strukturbasiertes Wirkstoffdesign und ist ein gut untersuchtes System, bei dem Änderungen des Protonierungszustandes während der Ligandenbindung auftreten, wie im Experiment gezeigt wurde. Das System der HIVP stellt einen Ausgangspunkt für eine weitere Anwendungsstudie unserer PEOE_PB-Ladungen dar. Bei dem Apo-Enzym befindet sich die zwei katalytisch aktiven Reste (Aspartate) im monoprotonierten Zustand. Dieser kann sich ändern, wenn Liganden binden, die eine cylische Harnstoff-Gruppe enthalten. Unser PEOE_PB-Modell reproduziert den experimentell bestimmten Protonierungszustand. Ferner führten wir pKa-Berechnungen für zwei HIVP-Komplexe mit neuartigen Inhibitoren, die unserer Gruppe entwickelt und synthetisiert wurden [Specket et al, J. Med. Chem., 48 (2005) 6607], durch. In diesen Fällen gibt es keinerlei experimentelle Daten für die Protonierungszustände. Einer der Inhibitoren enthält ein Pyrrolidin-Ring: hier sagten die Berechnungen voraus, dass beide katalytisch aktiven Aspartate nach Ligandenbindung deprotoniert vorliegen. Solch ein Protonierungsmuster wurde bisher in keinem HIVP-Komplex beobachtet, weder experimentell noch mittels einer Berechnungsmethode. Neben den experimentellen Trypsin/Thrombin-Studien wurden auch kombinierte kristallographische und thermodynamische Untersuchungen der Ligandenbindung an humaner Aldose-Reduktase (hAR) in unserer Gruppe vorgenommen [Steuber, Doktorarbeit in Vorbereitung]. Die ITC-Messungen zeigten einen durch die Ligandenbindung induzierten Protonentransfer. Unsere Berechnungen lassen darauf schliessen, dass ein Tyrosin-Rest der Bindetasche (Tyr48) als Protonenakzeptor fungiert, was bedeutet, dass das Tyrosin im Holo-Enzym deprotoniert vorliegt. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von ITC-Messungen an Tyr48Phe-Mutanten. Während bei hAR-Komplexen von Inhibitoren mit einer Carboxyl-Kopfgruppe die Berechnungen gut im Einklang mit den ITC-Experimenten waren, zeigten sich Ungenauigkeiten bei der Vorhersage von Inhibitoren mit einer cyclischen Hydantoin-Gruppe. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ligand und den Tyrosin bzw. Lysin-Resten der Bindetasche. Ferner liegen die pKa-Werte in wässriger LÃ�sung nahe dem physiologischen pH-Bereich, was das System sehr anfälig für kleine Ã�nderungen des pKa-Wertes macht. Ein limitierender Faktor für die breite Anwendung unserer PEOE_PB Ladungsmethode bei pKa-Rechnungen stellt die vorangehende Prozessierung der Liganden dar. Zu diesem Zweck implementierten wir den PEOE_PB-Algorithmus in das PDB2PQR-Programm (dieses erzeugt Input-Dateien für das Poisson-Boltzmann-Programm APBS). Liganden wurden in der PDB2PQR-Umgebung als voll flexibel betrachtet, und es wurde eine Suchprozedur für gemeinsame Substrukturen eingeführt. Mit dieser Technik ist es möglich, titrierbare Gruppen des Liganden automatisch zu erkennen und ihnen pKa-Werte zuzuweisen. Diese pKa-Werte stammen aus einer Datenbank, die momentan 348 Moleküle mit experimentell bestimmten pKa-Werten enthält

PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations

Real-world observable physical and chemical characteristics are increasingly being calculated from the 3D structures of biomolecules. Methods for calculating pKa values, binding constants of ligands, and changes in protein stability are readily available, but often the limiting step in computational biology is the conversion of PDB structures into formats ready for use with biomolecular simulation software. The continued sophistication and integration of biomolecular simulation methods for systems- and genome-wide studies requires a fast, robust, physically realistic and standardized protocol for preparing macromolecular structures for biophysical algorithms. As described previously, the PDB2PQR web server addresses this need for electrostatic field calculations (Dolinsky et al., Nucleic Acids Research, 32, W665–W667, 2004). Here we report the significantly expanded PDB2PQR that includes the following features: robust standalone command line support, improved pKa estimation via the PROPKA framework, ligand parameterization via PEOE_PB charge methodology, expanded set of force fields and easily incorporated user-defined parameters via XML input files, and improvement of atom addition and optimization code. These features are available through a new web interface (http://pdb2pqr.sourceforge.net/), which offers users a wide range of options for PDB file conversion, modification and parameterization

Structure-based optimization of potent, selective, and orally bioavailable CDK8 inhibitors discovered by high-throughput screening

The mediator complex-associated cyclin dependent kinase CDK8 regulates beta-catenin-dependent transcription following activation of WNT signaling. Multiple lines of evidence suggest CDK8 may act as an oncogene in the development of colorectal cancer. Here we describe the successful optimization of an imidazo-thiadiazole series of CDK8 inhibitors that was identified in a high-throughput screening campaign and further progressed by structure-based design. In several optimization cycles, we improved the microsomal stability, potency, and kinase selectivity. The initial imidazo-thiadiazole scaffold was replaced by a 3-methyl-1H-pyrazolo[3,4-b]-pyridine which resulted in compound 25 (MSC2530818) that displayed excellent kinase selectivity, biochemical and cellular potency, microsomal stability, and is orally bioavailable. Furthermore, we demonstrated modulation phospho-STAT1, a pharmacodynamic biomarker of CDK8 activity, and tumor growth inhibition in an APC mutant SW620 human colorectal carcinoma xenograft model after oral administration. Compound 25 demonstrated suitable potency and selectivity to progress into preclinical in vivo efficacy and safety studies

2,8-Disubstituted-1,6-Naphthyridines and 4,6-Disubstituted-Isoquinolines with Potent, Selective Affinity for CDK8/19

We demonstrate a designed scaffold-hop approach to the discovery of 2,8-disubstituted-1,6-naphthyridine- and 4,6-disubstituted-isoquinoline-based dual CDK8/19 ligands. Optimized compounds in both series exhibited rapid aldehyde oxidase-mediated metabolism, which could be abrogated by introduction of an amino substituent at C5 of the 1,6-naphthyridine scaffold or at C1 of the isoquinoline scaffold. Compounds 51 and 59 were progressed to in vivo pharmacokinetic studies, and 51 also demonstrated sustained inhibition of STAT1SER727 phosphorylation, a biomarker of CDK8 inhibition, in an SW620 colorectal carcinoma human tumor xenograft model following oral dosing

Search for dark matter produced in association with bottom or top quarks in √s = 13 TeV pp collisions with the ATLAS detector

A search for weakly interacting massive particle dark matter produced in association with bottom or top quarks is presented. Final states containing third-generation quarks and miss- ing transverse momentum are considered. The analysis uses 36.1 fb−1 of proton–proton collision data recorded by the ATLAS experiment at √s = 13 TeV in 2015 and 2016. No significant excess of events above the estimated backgrounds is observed. The results are in- terpreted in the framework of simplified models of spin-0 dark-matter mediators. For colour- neutral spin-0 mediators produced in association with top quarks and decaying into a pair of dark-matter particles, mediator masses below 50 GeV are excluded assuming a dark-matter candidate mass of 1 GeV and unitary couplings. For scalar and pseudoscalar mediators produced in association with bottom quarks, the search sets limits on the production cross- section of 300 times the predicted rate for mediators with masses between 10 and 50 GeV and assuming a dark-matter mass of 1 GeV and unitary coupling. Constraints on colour- charged scalar simplified models are also presented. Assuming a dark-matter particle mass of 35 GeV, mediator particles with mass below 1.1 TeV are excluded for couplings yielding a dark-matter relic density consistent with measurements