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Prediction of protonation states in ligand-protein complexes upon ligand binding
Die stĂ€ndige Weiterentwicklung der Computer-Hardware und die daraus resultierende Steigerung der Rechenleistung ermöglicht heutzutage eine erfolgreiche Modellierung von chemischen und biologischen Prozessen, die vor 20 Jahren noch undenkbar war. Als Beispiele sind Molekulardynamik-Simulationen grosser BiomolekĂŒle, die Berechnung freier Bindungsenergien von Protein-Ligand-Komplexen oder auch Untersuchungen von Reaktionswegen in Enzymen zu nennen. In einem Bereich mangelt es jedoch weiterhin an akkuraten Methoden: die AbschĂ€tzung von ProtonierungszustĂ€nden in Protein-Ligand-Komplexen.
In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Entwicklung einer neuen Methode der Ladungszuweisung, genannt PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimiert fĂŒr Poisson-Boltzmann Rechnungen). Diese Methode stellt eine konsistente Ladungszuweisung sowohl fĂŒr Proteine als auch fĂŒr kleine organische MolekĂŒle dar. Die Ladungen sind entscheidende Parameter bei Poisson-Boltzmann (PB)- Rechnungen. PB-Rechnungen stellen eine etablierte Methode bei der Bestimmung von pKa-Werten in Proteinen dar. Die Entwicklung von PEOE_PB-Ladungen ist notwendig geworden, da es keine generische Methode gibt, PB-basierte pKa-Berechnungen in Protein-Ligand-Komplexen durchzufĂïżœhren.
Der PEOE-Ansatz wurde gewĂ€hlt, um zunĂ€chst die freien Solvatationsenergien kleiner organischer MolekĂŒle bestmöglich vorherzusagen. Modifikationen wurden heuristisch, d.h. ergebnisorientiert vorgenommen, wobei Ănderungen lediglich den Parameter a des PEOE-Polynoms betreffen. Bei unserer Optimierung versuchten wir zunĂ€chst, die experimentell bestimmten freien Solvatationsenergien polarer AminosĂïżœuren (r2 = 0.94, RMSD = 0.84) und anschliessend eines Datensatzes von 80 kleinen organischen MolekĂïżœulen (r2 = 0.78, RMSD = 1.57) zu reproduzieren. Die Verwendung des letztgenannten Datensatzes zeigt den generischen Charakter unserer PEOE_PB-Ladungen. Abschliessend fĂŒhrten wir Rechnungen an einem Datensatz von neun (apo-)Proteinen mit 132 experimentell bestimmten pKa-Werten durch und erzielten einen RMSD von 0.88. Die DielektrizitĂ€tskonstante im Protein war hierbei auf 20 gesetzt. AminosĂ€urereste in Bindetaschen mit stark verschobenen pKa-Werten lagen bei zwei Enzymen des Datensatzes vor, in diesen FĂïżœllen wurden folgende Beobachtungen gemacht:
* Die DielektrizitÀtskonstante wurde von 20 auf 4 gesenkt, was teilweise durch die Vergrabenheit der Bindetasche erklÀrt werden kann.
* Die Orientierung der Hydroxylgruppe des Tyrosins hatte einen beachtlichen Einfluss auf den pKa-Wert eines AminosÀurerestes in der Bindetasche (ein Glutamat mit einem stark erhöhten pKa-Wert). Diese Tatsache unterstreicht den entscheidenden Einfluss der Orientierung polarer Wasserstoffatome.
Im letzten Schritt unserer PEOE_PB-Validierung fĂŒhrten wir pKa-Berechnungen fĂŒr drei Protein-Ligand-Komplexe (die im Experiment einen Protonentransfer zeigten) durch: in allen FĂ€llen stimmten unsere Berechnungen mit dem Experiment ĂŒberein.
In einer folgenden reinen Anwendungstudie fĂŒhrten wir pKa-Berechnungen fĂŒr eine Serie von Liganden, die an die Serin-Proteasen Trypsin und Thrombin binden, durch. An diesen Komplexen waren bereits ausfĂŒhrliche ITC- und Kristallographie-Studien gemacht worden und fĂŒr vier dieser Komplexe konnten Ăïżœnderungen in den ProtonierungszustĂïżœnden detektiert werden [Dullweber et al., J. Mol. Biol. 313 (2001), 593] . Da ITC-Experimente jedoch nur gesamtheitliche Ăïżœnderungen in der Protonierung messen, konnten diese Experimente keinen Aufschluss darĂŒber geben, welche funktionellen Gruppen tatsĂ€chlich am Protonentransfer beteiligt sind. Um diese Gruppen identifizieren zu können, fĂŒhrten wir Poisson-Boltzmann-Rechnungen, basierend auf unseren PEOE_PB-Ladungen, durch. Die resultierenden pKa-Werte zeigen, dass His57 (einer der drei katalytisch aktiven Reste) fĂŒr die wichtigsten pKa-Ănderungen, die sich im Experiment als Ăïżœnderungen im Protonierungszustand zeigen, verantwortlich ist. Dies steht im Widerspruch zu unserer frĂïżœheren Annahme, dass die Ăïżœnderungen im Protonierugszustand an der Carboxylgruppe der Liganden ablaufen. Der neuentdeckte Protonenakzeptor wurde fĂŒr die Refaktorisierung der ITC-Daten eingesetzt; dies ist wichtig fĂŒr FĂ€lle, in denen sich die Protonierung wĂ€hrend der Komplexbildung Ă€ndert. Die pKa-Werte von Komplexen, die im ITC-Experiment keine Ănderung im Protonierungszustand zeigen, werden in den meisten FĂ€llen verlĂ€sslich vorhergesagt, wĂ€hrend dies in FĂ€llen stark koppelnder Systeme schwierig bleibt. Solche FĂ€lle treten auf, wenn zwei (oder mehr) interagierende titrierbare Gruppen rĂ€umlich nahe beiander liegen.
Die HIV-Protease (HIVP) ist ein bekanntes Beispiel fĂŒr erfolgreiches strukturbasiertes Wirkstoffdesign und ist ein gut untersuchtes System, bei dem Ănderungen des Protonierungszustandes wĂ€hrend der Ligandenbindung auftreten, wie im Experiment gezeigt wurde. Das System der HIVP stellt einen Ausgangspunkt fĂŒr eine weitere Anwendungsstudie unserer PEOE_PB-Ladungen dar. Bei dem Apo-Enzym befindet sich die zwei katalytisch aktiven Reste (Aspartate) im monoprotonierten Zustand. Dieser kann sich Ă€ndern, wenn Liganden binden, die eine cylische Harnstoff-Gruppe enthalten. Unser PEOE_PB-Modell reproduziert den experimentell bestimmten Protonierungszustand. Ferner fĂŒhrten wir pKa-Berechnungen fĂŒr zwei HIVP-Komplexe mit neuartigen Inhibitoren, die unserer Gruppe entwickelt und synthetisiert wurden [Specket et al, J. Med. Chem., 48 (2005) 6607], durch. In diesen FĂ€llen gibt es keinerlei experimentelle Daten fĂŒr die ProtonierungszustĂ€nde. Einer der Inhibitoren enthĂ€lt ein Pyrrolidin-Ring: hier sagten die Berechnungen voraus, dass beide katalytisch aktiven Aspartate nach Ligandenbindung deprotoniert vorliegen. Solch ein Protonierungsmuster wurde bisher in keinem HIVP-Komplex beobachtet, weder experimentell noch mittels einer Berechnungsmethode.
Neben den experimentellen Trypsin/Thrombin-Studien wurden auch kombinierte kristallographische und thermodynamische Untersuchungen der Ligandenbindung an humaner Aldose-Reduktase (hAR) in unserer Gruppe vorgenommen [Steuber, Doktorarbeit in Vorbereitung]. Die ITC-Messungen zeigten einen durch die Ligandenbindung induzierten Protonentransfer. Unsere Berechnungen lassen darauf schliessen, dass ein Tyrosin-Rest der Bindetasche (Tyr48) als Protonenakzeptor fungiert, was bedeutet, dass das Tyrosin im Holo-Enzym deprotoniert vorliegt. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von ITC-Messungen an Tyr48Phe-Mutanten. WĂ€hrend bei hAR-Komplexen von Inhibitoren mit einer Carboxyl-Kopfgruppe die Berechnungen gut im Einklang mit den ITC-Experimenten waren, zeigten sich Ungenauigkeiten bei der Vorhersage von Inhibitoren mit einer cyclischen Hydantoin-Gruppe. Eine mögliche ErklĂ€rung hierfĂŒr ist die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ligand und den Tyrosin bzw. Lysin-Resten der Bindetasche. Ferner liegen die pKa-Werte in wĂ€ssriger LĂïżœsung nahe dem physiologischen pH-Bereich, was das System sehr anfĂ€lig fĂŒr kleine Ăïżœnderungen des pKa-Wertes macht.
Ein limitierender Faktor fĂŒr die breite Anwendung unserer PEOE_PB Ladungsmethode bei pKa-Rechnungen stellt die vorangehende Prozessierung der Liganden dar. Zu diesem Zweck implementierten wir den PEOE_PB-Algorithmus in das PDB2PQR-Programm (dieses erzeugt Input-Dateien fĂŒr das Poisson-Boltzmann-Programm APBS). Liganden wurden in der PDB2PQR-Umgebung als voll flexibel betrachtet, und es wurde eine Suchprozedur fĂŒr gemeinsame Substrukturen eingefĂŒhrt. Mit dieser Technik ist es möglich, titrierbare Gruppen des Liganden automatisch zu erkennen und ihnen pKa-Werte zuzuweisen. Diese pKa-Werte stammen aus einer Datenbank, die momentan 348 MolekĂŒle mit experimentell bestimmten pKa-Werten enthĂ€lt
Light-activatable TET-dioxygenases reveal dynamics of 5-Methylcytosine oxidation and transcriptome reorganization
Ten-eleven-translocation (TET) dioxygenases
catalyze the oxidation of 5-methylcytosine (5mC), the central
epigenetic regulator of mammalian DNA. This activity dy-
namically reshapes epigenome and transcriptome by deposit-
ing oxidized 5mC derivatives, and initiating active DNA de-
methylation. However, studying this dynamic is hampered by
the inability to selectively activate individual TETs with tem-
poral control in cells. We report activation of TETs in mam-
malian cells by incorporation of genetically encoded 4,5-
dimethoxy-2-nitrobenzyl-L-serine as transient active site
block, and its subsequent deprotection with light. Our ap-
proach enables precise insights into the impact of cancer-
associated TET2 mutations on the kinetics of TET2 catalysis
in vivo, and allows time-resolved monitoring of target gene
activation and transcriptome reorganization. This sets a basis
for dissecting the order and kinetics of chromatin-associated
events triggered by TET catalysis, ranging from DNA de-
methylation to chromatin and transcription regulation
Light-Activatable TET-Dioxygenases Reveal Dynamics of 5-Methylcytosine Oxidation and Transcriptome Reorganization
Ten-eleven-translocation (TET) dioxygenases catalyze the oxidation of 5-methylcytosine (5mC), the central epigenetic regulator of mammalian DNA. This activity dynamically reshapes the epigenome and transcriptome by depositing oxidized 5mC derivatives and initiating active DNA demethylation. However, studying this dynamic is hampered by the inability to selectively activate individual TETs with temporal control in cells. We report activation of TETs in mammalian cells by incorporation of genetically encoded 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-l-serine as a transient active-site block, and its subsequent deprotection with light. Our approach enables precise insights into the impact of cancer-associated TET2 mutations on the kinetics of TET2 catalysis in vivo, and allows time-resolved monitoring of target gene activation and transcriptome reorganization. This sets a basis for dissecting the order and kinetics of chromatin-associated events triggered by TET catalysis, ranging from DNA demethylation to chromatin and transcription regulation
PDB2PQR: expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations
Real-world observable physical and chemical characteristics are increasingly being calculated from the 3D structures of biomolecules. Methods for calculating pKa values, binding constants of ligands, and changes in protein stability are readily available, but often the limiting step in computational biology is the conversion of PDB structures into formats ready for use with biomolecular simulation software. The continued sophistication and integration of biomolecular simulation methods for systems- and genome-wide studies requires a fast, robust, physically realistic and standardized protocol for preparing macromolecular structures for biophysical algorithms. As described previously, the PDB2PQR web server addresses this need for electrostatic field calculations (Dolinsky et al., Nucleic Acids Research, 32, W665âW667, 2004). Here we report the significantly expanded PDB2PQR that includes the following features: robust standalone command line support, improved pKa estimation via the PROPKA framework, ligand parameterization via PEOE_PB charge methodology, expanded set of force fields and easily incorporated user-defined parameters via XML input files, and improvement of atom addition and optimization code. These features are available through a new web interface (http://pdb2pqr.sourceforge.net/), which offers users a wide range of options for PDB file conversion, modification and parameterization
Targeting oncogenic KRasG13C with nucleotide-based covalent inhibitors
Mutations within Ras proteins represent major drivers in human cancer. In this study, we report the structure-based design, synthesis, as well as biochemical and cellular evaluation of nucleotide-based covalent inhibitors for KRasG13C, an important oncogenic mutant of Ras that has not been successfully addressed in the past. Mass spectrometry experiments and kinetic studies reveal promising molecular properties of these covalent inhibitors, and X-ray crystallographic analysis has yielded the first reported crystal structures of KRasG13C covalently locked with these GDP analogues. Importantly, KRasG13C covalently modified with these inhibitors can no longer undergo SOS-catalysed nucleotide exchange. As a final proof-of-concept, we show that in contrast to KRasG13C, the covalently locked protein is unable to induce oncogenic signalling in cells, further highlighting the possibility of using nucleotide-based inhibitors with covalent warheads in KRasG13C-driven cancer
Structure-based optimization of potent, selective, and orally bioavailable CDK8 inhibitors discovered by high-throughput screening
The mediator complex-associated cyclin dependent kinase CDK8 regulates beta-catenin-dependent transcription following activation of WNT signaling. Multiple lines of evidence suggest CDK8 may act as an oncogene in the development of colorectal cancer. Here we describe the successful optimization of an imidazo-thiadiazole series of CDK8 inhibitors that was identified in a high-throughput screening campaign and further progressed by structure-based design. In several optimization cycles, we improved the microsomal stability, potency, and kinase selectivity. The initial imidazo-thiadiazole scaffold was replaced by a 3-methyl-1H-pyrazolo[3,4-b]-pyridine which resulted in compound 25 (MSC2530818) that displayed excellent kinase selectivity, biochemical and cellular potency, microsomal stability, and is orally bioavailable. Furthermore, we demonstrated modulation phospho-STAT1, a pharmacodynamic biomarker of CDK8 activity, and tumor growth inhibition in an APC mutant SW620 human colorectal carcinoma xenograft model after oral administration. Compound 25 demonstrated suitable potency and selectivity to progress into preclinical in vivo efficacy and safety studies
2,8-Disubstituted-1,6-Naphthyridines and 4,6-Disubstituted-Isoquinolines with Potent, Selective Affinity for CDK8/19
We demonstrate a designed scaffold-hop approach to the discovery of 2,8-disubstituted-1,6-naphthyridine- and 4,6-disubstituted-isoquinoline-based dual CDK8/19 ligands. Optimized compounds in both series exhibited rapid aldehyde oxidase-mediated metabolism, which could be abrogated by introduction of an amino substituent at C5 of the 1,6-naphthyridine scaffold or at C1 of the isoquinoline scaffold. Compounds 51 and 59 were progressed to in vivo pharmacokinetic studies, and 51 also demonstrated sustained inhibition of STAT1SER727 phosphorylation, a biomarker of CDK8 inhibition, in an SW620 colorectal carcinoma human tumor xenograft model following oral dosing
Search for dark matter produced in association with bottom or top quarks in âs = 13 TeV pp collisions with the ATLAS detector
A search for weakly interacting massive particle dark matter produced in association with bottom or top quarks is presented. Final states containing third-generation quarks and miss- ing transverse momentum are considered. The analysis uses 36.1 fbâ1 of protonâproton collision data recorded by the ATLAS experiment at âs = 13 TeV in 2015 and 2016. No significant excess of events above the estimated backgrounds is observed. The results are in- terpreted in the framework of simplified models of spin-0 dark-matter mediators. For colour- neutral spin-0 mediators produced in association with top quarks and decaying into a pair of dark-matter particles, mediator masses below 50 GeV are excluded assuming a dark-matter candidate mass of 1 GeV and unitary couplings. For scalar and pseudoscalar mediators produced in association with bottom quarks, the search sets limits on the production cross- section of 300 times the predicted rate for mediators with masses between 10 and 50 GeV and assuming a dark-matter mass of 1 GeV and unitary coupling. Constraints on colour- charged scalar simplified models are also presented. Assuming a dark-matter particle mass of 35 GeV, mediator particles with mass below 1.1 TeV are excluded for couplings yielding a dark-matter relic density consistent with measurements
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