Production of sulphated glycans by metabolic engineering

La partie oligosaccharidique des glycoconjugués, présents à la surface des cellules eucaryotes, intervient dans de nombreux processus biologiques de reconnaissance et d'adhésion cellulaire. L'essor de la glycobiologie au cours des vingt dernières années a permis de définir, à partir de l'implication de ces structures glycaniques, de nombreuses applications thérapeutiques potentielles. Cependant la fabrication de nouveaux médicaments à partir d'oligosaccharidiques requiert leur disponibilité en grande quantité mais leurs obtentions par purification ou par méthode de synthèse chimique et enzymatique restent difficiles et couteuses et donnent un rendement faible. Le laboratoire CERMAV a récemment développé une technologie cellulaire, non polluante, capable de produire rapidement et en grande quantité un certain nombre d'oligosaccharides d'intérêt biologique. Le procédé baptisé « usine cellulaire » repose sur la co-expression de glycosyltransférases recombinantes chez la bactérie Escherichia coli. La sulfatation des glycanes est un élément important de leurs propriétés biologiques. Celle-ci dépend de l'activité de sulfotransférases, dont l'activité chez Escherichia coli a été peu étudiée. Par contre, ces enzymes utilisent des accepteurs oligosaccharidiques dont la synthèse est maîtrisée par le procédé d'usine cellulaire. Nous avons exprimé des gènes de sulfotransférases afin de permettre in vivo la sulfatation d'accepteurs oligosaccharidiques endogènes produits dans la bactérie. Les familles de molécules synthétisées dériveront des motifs GlcAlac, Lacto-N-néotétraose, et LewisX dont la synthèse in vivo est maîtrisée. Nous avons également réalisé une synthèse combinée chimio-enzymatique d'une néoglycoprotéine porteuse d'un analogue de l'épitope HNK-1, déterminant sulfaté impliqué notamment dans la régénération des motoneurones. Finalement nous avons entrepris une étude préliminaire d'adaptation du procédé d'« usine cellulaire » à la synthèse de glycanes sulfatés chez Saccharomyces cerevisiae.The oligosaccharide moety of glycoconjugates, present on the eukaryotic cell surface, is involved in many biological processes of recognition and cell adhesion. The rise of glycobiology over the last twenty years has helped to define, from the involvement of these glycan structures, many potential therapeutic applications. However, the manufacture of new drugs from oligosaccharide requires their availability in large quantities but their varieties by purification or by method of chemical and enzymatic synthesis remain difficult and expensive and lead to low yield. CERMAV has recently developed a clean and fast cell technology, which is able of producing large quantities of several oligosaccharides of biological interest. The process called "cell factory" is based on the co-expression of recombinant glycosyltransferases in Escherichia coli. Sulfation of glycans is an important part of their biological properties and depends on the activity of sulfotransferase, whose activity in Escherichia coli has not been well studied. But these enzymes use oligosaccharide acceptor whose synthesis is controlled by the process of cell factory. We expressed genes of sulfotransferase to allow the in vivo sulfation of endogenous oligosaccharide acceptor produced in the bacterium. Families of molecules synthesized drift patterns of GlcAlac, Lacto-N-neotetraose, and Lewisx whose synthesis in vivo is controlled. We also performed a combined chemo-enzymatic synthesis of a neoglycoprotein bearing an analogue of the epitope HNK-1, involved particularly in the regeneration of motoneurons. Finally we tried to adapt the method of "cell factory” for the synthesis of sulfated glycans in a eukaryotic organism such as yeast Saccharomyces cerevisiae

Synthèse de glycannes sulfatés par le procédé d'"usine cellulaire"

The oligosaccharide moety of glycoconjugates, present on the eukaryotic cell surface, is involved in many biological processes of recognition and cell adhesion. The rise of glycobiology over the last twenty years has helped to define, from the involvement of these glycan structures, many potential therapeutic applications. However, the manufacture of new drugs from oligosaccharide requires their availability in large quantities but their varieties by purification or by method of chemical and enzymatic synthesis remain difficult and expensive and lead to low yield. CERMAV has recently developed a clean and fast cell technology, which is able of producing large quantities of several oligosaccharides of biological interest. The process called "cell factory" is based on the co-expression of recombinant glycosyltransferases in Escherichia coli. Sulfation of glycans is an important part of their biological properties and depends on the activity of sulfotransferase, whose activity in Escherichia coli has not been well studied. But these enzymes use oligosaccharide acceptor whose synthesis is controlled by the process of cell factory. We expressed genes of sulfotransferase to allow the in vivo sulfation of endogenous oligosaccharide acceptor produced in the bacterium. Families of molecules synthesized drift patterns of GlcAlac, Lacto-N-neotetraose, and Lewisx whose synthesis in vivo is controlled. We also performed a combined chemo-enzymatic synthesis of a neoglycoprotein bearing an analogue of the epitope HNK-1, involved particularly in the regeneration of motoneurons. Finally we tried to adapt the method of "cell factory” for the synthesis of sulfated glycans in a eukaryotic organism such as yeast Saccharomyces cerevisiae.La partie oligosaccharidique des glycoconjugués, présents à la surface des cellules eucaryotes, intervient dans de nombreux processus biologiques de reconnaissance et d'adhésion cellulaire. L'essor de la glycobiologie au cours des vingt dernières années a permis de définir, à partir de l'implication de ces structures glycaniques, de nombreuses applications thérapeutiques potentielles. Cependant la fabrication de nouveaux médicaments à partir d'oligosaccharidiques requiert leur disponibilité en grande quantité mais leurs obtentions par purification ou par méthode de synthèse chimique et enzymatique restent difficiles et couteuses et donnent un rendement faible. Le laboratoire CERMAV a récemment développé une technologie cellulaire, non polluante, capable de produire rapidement et en grande quantité un certain nombre d'oligosaccharides d'intérêt biologique. Le procédé baptisé « usine cellulaire » repose sur la co-expression de glycosyltransférases recombinantes chez la bactérie Escherichia coli. La sulfatation des glycanes est un élément important de leurs propriétés biologiques. Celle-ci dépend de l'activité de sulfotransférases, dont l'activité chez Escherichia coli a été peu étudiée. Par contre, ces enzymes utilisent des accepteurs oligosaccharidiques dont la synthèse est maîtrisée par le procédé d'usine cellulaire. Nous avons exprimé des gènes de sulfotransférases afin de permettre in vivo la sulfatation d'accepteurs oligosaccharidiques endogènes produits dans la bactérie. Les familles de molécules synthétisées dériveront des motifs GlcAlac, Lacto-N-néotétraose, et LewisX dont la synthèse in vivo est maîtrisée. Nous avons également réalisé une synthèse combinée chimio-enzymatique d'une néoglycoprotéine porteuse d'un analogue de l'épitope HNK-1, déterminant sulfaté impliqué notamment dans la régénération des motoneurones. Finalement nous avons entrepris une étude préliminaire d'adaptation du procédé d'« usine cellulaire » à la synthèse de glycanes sulfatés chez Saccharomyces cerevisiae

Évaluation du rôle pronostique des mutations somatiques des gènes de la famille FGFR chez les patients porteurs d'un carcinome urothélial métastatique

Introduction : le carcinome urothélial représente > 90% des cas des carcinomes invasifs de l’appareil excréteur urinaire. Les mutations des oncogènes de la famille FGFR, principalement FGFR3, sont retrouvées dans 9 à 20% des cas selon les séries, mais leur rôle pronostique sur la survie reste encore à définir clairement en phase métastatique, d’autant plus que les développements récents de thérapies ciblées anti-FGFR en font une cible de choix dans la prise en charge de ces carcinomes.Méthode : une cohorte rétrospective cas-témoins de patients pris en charge entre le 1er Janvier 2018 et le 30 juin 2021 au sein des hôpitaux de l’AP-HM et/ou de l’Institut Paoli-Calmettes de Marseille, répartis selon leur statut NGS, a été étudiée. Les critères d’inclusion était un âge ≥ 18 ans et avoir bénéficié d’une prise en charge pour un carcinome de l’appareil urinaire excréteur invasif métastatique au sein de l’AP-HM et/ou de l’IPC. Les critères d’exclusion étaient : carcinome non urothélial, absence de métastase ou caractère locorégionalement avancé opérable, absence d’analyse en NGS de l’ADN tumoral incluant les gènes de la famille FGFR, absence de suivi disponible. L’OSm était le CJP, la PFS1, la PFS2 et la SSM étaient les CJS. Des analyses concernant les facteurs pronostiques habituels, l’âge ou le traitement de première ligne ont également été effectuées. Résultats : 131patients ont été inclus, dont 28 (21,4%) étaient FGFR-mutés. Il n’y a pas de différence significative d’OSm entre les deux populations (HR 0,866 ; IC 95% (0,517 ; 1,451) ; p = 0,517), ni de PFS1 (HR 1,18 ; IC95% (0,70 ; 2,01) ; p = 0,530), de PFS2 (HR 0,64 ; IC95% (0,30 ; 1,35), p = 0,239) ou de SSM (18,234 chez les patients mutés vs 13,207 mois chez les non-mutés, p=0,26). L’Hb < 10g/dL et le PS au diagnostic apparaissent comme des facteurs pronostiques sur l’OSm, mais pas la présence de métastases viscérales. Il n’y a pas de différences de PFS1 sur ces critères, ni de différence d’OSm ni de PFS1 en fonction du traitement de première ligne choisi entre les deux sous-groupes. Discussion : le statut FGFR-muté ne présente pas un impact pronostique évident sur l’OSm en comparaison des critères clinicobiologiques que sont l’état général et le taux d’hémoglobine au diagnostic. Il existe un signal en faveur d’une meilleure chimiosensibilité de ce groupe de patients, tandis que l’efficacité de l’immunothérapie semble moins évidente. Les études en cours sur les nouvelles thérapeutiques anti-FGFR conduiront à une évolution de leur place dans l’arsenal thérapeutique et à la nécessité d’une recherche de plus en plus précoce du statut mutationnel de ces tumeurs. Conclusion : les mutations de la famille des gènes FGR n’entrainent pas de différence significative sur l’OSm, ni sur la PFS1, la PFS2 ou la SSM des carcinomes urothéliaux invasifs des voies excrétrices

Synthèse de glycannes sulfatés par le procédé d'"usine cellulaire"

La partie oligosaccharidique des glycoconjugués, présents à la surface des cellules eucaryotes, intervient dans de nombreux processus biologiques de reconnaissance et d'adhésion cellulaire. L'essor de la glycobiologie au cours des vingt dernières années a permis de définir, à partir de l'implication de ces structures glycaniques, de nombreuses applications thérapeutiques potentielles. Cependant la fabrication de nouveaux médicaments à partir d'oligosaccharidiques requiert leur disponibilité en grande quantité mais leurs obtentions par purification ou par méthode de synthèse chimique et enzymatique restent difficiles et couteuses et donnent un rendement faible. Le laboratoire CERMAV a récemment développé une technologie cellulaire, non polluante, capable de produire rapidement et en grande quantité un certain nombre d'oligosaccharides d'intérêt biologique. Le procédé baptisé usine cellulaire repose sur la co-expression de glycosyltransférases recombinantes chez la bactérie Escherichia coli. La sulfatation des glycanes est un élément important de leurs propriétés biologiques. Celle-ci dépend de l'activité de sulfotransférases, dont l'activité chez Escherichia coli a été peu étudiée. Par contre, ces enzymes utilisent des accepteurs oligosaccharidiques dont la synthèse est maîtrisée par le procédé d'usine cellulaire. Nous avons exprimé des gènes de sulfotransférases afin de permettre in vivo la sulfatation d'accepteurs oligosaccharidiques endogènes produits dans la bactérie. Les familles de molécules synthétisées dériveront des motifs GlcAlac, Lacto-N-néotétraose, et LewisX dont la synthèse in vivo est maîtrisée. Nous avons également réalisé une synthèse combinée chimio-enzymatique d'une néoglycoprotéine porteuse d'un analogue de l'épitope HNK-1, déterminant sulfaté impliqué notamment dans la régénération des motoneurones. Finalement nous avons entrepris une étude préliminaire d'adaptation du procédé d' usine cellulaire à la synthèse de glycanes sulfatés chez Saccharomyces cerevisiae.The oligosaccharide moety of glycoconjugates, present on the eukaryotic cell surface, is involved in many biological processes of recognition and cell adhesion. The rise of glycobiology over the last twenty years has helped to define, from the involvement of these glycan structures, many potential therapeutic applications. However, the manufacture of new drugs from oligosaccharide requires their availability in large quantities but their varieties by purification or by method of chemical and enzymatic synthesis remain difficult and expensive and lead to low yield. CERMAV has recently developed a clean and fast cell technology, which is able of producing large quantities of several oligosaccharides of biological interest. The process called "cell factory" is based on the co-expression of recombinant glycosyltransferases in Escherichia coli. Sulfation of glycans is an important part of their biological properties and depends on the activity of sulfotransferase, whose activity in Escherichia coli has not been well studied. But these enzymes use oligosaccharide acceptor whose synthesis is controlled by the process of cell factory. We expressed genes of sulfotransferase to allow the in vivo sulfation of endogenous oligosaccharide acceptor produced in the bacterium. Families of molecules synthesized drift patterns of GlcAlac, Lacto-N-neotetraose, and Lewisx whose synthesis in vivo is controlled. We also performed a combined chemo-enzymatic synthesis of a neoglycoprotein bearing an analogue of the epitope HNK-1, involved particularly in the regeneration of motoneurons. Finally we tried to adapt the method of "cell factory for the synthesis of sulfated glycans in a eukaryotic organism such as yeast Saccharomyces cerevisiae.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF

Screening of a Library of Oligosaccharides Targeting Lectin LecB of <i>Pseudomonas Aeruginosa</i> and Synthesis of High Affinity Oligoglycoclusters

The Gram negative bacterium Pseudomonas aeruginosa (PA) is an opportunistic bacterium that causes severe and chronic infection of immune-depressed patients. It has the ability to form a biofilm that gives a selective advantage to the bacteria with respect to antibiotherapy and host defenses. Herein, we have focused on the tetrameric soluble lectin which is involved in bacterium adherence to host cells, biofilm formation, and cytotoxicity. It binds to l-fucose, d-mannose and glycan exposing terminal fucose or mannose. Using a competitive assay on microarray, 156 oligosaccharides and polysaccharides issued from fermentation or from the biomass were screened toward their affinity to LecB. Next, the five best ligands (Lewisa, Lewisb, Lewisx, siayl-Lewisx and 3-fucosyllactose) were derivatized with a propargyl aglycon allowing the synthesis of 25 trivalent, 25 tetravalent and 5 monovalent constructions thanks to copper catalyzed azide alkyne cycloaddition. The 55 clusters were immobilized by DNA Directed immobilization leading to the fabrication of a glycocluster microarray. Their binding to LecB was studied. Multivalency improved the binding to LecB. The binding structure relationship of the clusters is mainly influenced by the carbohydrate residues. Molecular simulations indicated that the simultaneous contact of both binding sites of monomer A and D seems to be energetically possible

Synthesis and screening of Oligisaccharides Clusters Targeting Lectins from Pseudomonas aeruginosa

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Synthesis and screening of Oligisaccharides Clusters Targeting Lectins from Pseudomonas aeruginosa

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Therapeutic Challenges in Patients with Gynecologic Carcinosarcomas: Analysis of a Multicenter National Cohort Study from the French Prospective TMRG Network

International audienceBackground: Gynecological carcinosarcomas are rare and aggressive diseases, with a poor prognosis. The rarity of these tumors explains the lack of robust and specific data available in the literature. The objective of this study was to investigate the impact of initial adjuvant treatment and recurrent therapeutic strategies. Patients and methods: A multicentric cohort study within the French national prospective Rare Malignant Gynecological Tumors (TMRG) network was conducted. Data from all included carcinosarcomas diagnosed between 2011 and 2018 were retrospectively collected. Results: 425 cases of uterine and ovarian carcinosarcomas (n = 313 and n = 112, respectively) were collected and analyzed from 12 participating centers. At diagnosis, 140 patients (48%) had a FIGO stage III–IV uterine carcinosarcoma (UCS) and 88 patients (83%) had an advanced ovarian carcinosarcoma (OCS) (FIGO stage ≥ III). Two hundred sixty-seven patients (63%) received adjuvant chemotherapy, most preferably carboplatin-paclitaxel regimen (n = 227, 86%). After a median follow-up of 47.4 months, the median progression-free survival (mPFS) was 15.1 months (95% CI 12.3–20.6) and 14.8 months (95% CI 13.1–17.1) for OCS and UCS, respectively. The median overall survival for OCS and UCS was 37.1 months (95% CI 22.2–49.2) and 30.6 months (95% CI 24.1–40.9), respectively. With adjuvant chemotherapy followed by radiotherapy, mPFS was 41.0 months (95% CI 17.0–NR) and 18.9 months (95% CI 14.0–45.6) for UCS stages I–II and stages III–IV, respectively. In the early stage UCS subgroup (i.e., stage IA, n = 86, 30%), mPFS for patients treated with adjuvant chemotherapy (n = 24) was not reached (95% CI 22.2–NR), while mPFS for untreated patients (n = 62) was 19.9 months (95% IC 13.9–72.9) (HR 0.44 (0.20–0.95) p = 0.03). At the first relapse, median PFS for all patients was 4.2 months (95% CI 3.5–5.3). In the first relapse, mPFS was 6.7 months (95% CI 5.1–8.5) and 2.2 months (95% CI 1.9–2.9) with a combination of chemotherapy or monotherapy, respectively (p < 0.001). Conclusions: Interestingly, this vast prospective cohort of gynecological carcinosarcoma patients from the French national Rare Malignant Gynecological Tumors network (i) highlights the positive impact of adjuvant CT on survival in all localized stages (including FIGO IA uterine carcinosarcomas), (ii) confirms the importance of platinum-based combination as an option for relapse setting, and (iii) reports median PFS for various therapeutic strategies in the relapse setting