Synthese, Charakterisierung und Anwendungen photospaltbarer Fluoreszenzfarbstoff-Dyaden mit intramolekularer Energieübertragung

Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung neuer photospaltbarer Fluoreszenzfarbstoff-Dyaden. Der Fokus lag dabei in der Anwendung für materialwissenschaftliche Fragestellungen. Bei den hier beschriebenen Fluoreszenzfarbstoff-Dyaden handelt es sich um ein System aus zwei Fluoreszenzfarbstoffen, die über einen photolabilen Linker verbunden sind. Mittels einer durch UV-Licht induzierten Photoreaktion kann der Linker gespalten werden. Die Farbstoffe der Dyade sind so gewählt, dass zwischen ihnen Förster-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) auftreten kann. Es wurden Dyaden mit intramolekularer Energieübertragung synthetisiert, photophysikalisch charakterisiert und in Einzelmolekülexperimenten angewandt.Zunächst wurden Vorversuche für FRET-Messungen an Systemen, in denen Donor und Akzeptor einen wohldefinierten Abstand besitzen, durchgeführt. Als Modellsysteme dienten ein markierter, hybridisierter Oligonukleotidstrang und ein markierter Oligonukleotid-Einzelstrang. Die über FRET-Messungen im Ensemble bestimmten Abstände zwischen Donor- und Akzeptorfarbstoff der hybridisierten Probe wurden mit den theoretisch berechneten Abständen sowie mit dem über FRET gemessenen Abstand der beiden Farbstoffe am Einzelstrang verglichen. Es konnten Rückschlüsse auf bevorzugte Farbstofforientierungen, die sich auf Wechselwirkungen mit dem Phosphatrückgrat zurückführen ließen, und auf die relativ starke Krümmung des Einzelstrangs gezogen werden.Daraufhin wurde eine PDI-Carbonsäure sowie drei Fluoreszenzfarbstoff-Dyaden synthetisiert: Pyrrolopyrrolcyanin-Cumarin-Perylendiimid (SCP), Perylendiimid-Methylphen-acyl-Terrylendiimid (PAT) und Perylendiimid-Methylphenacyl-Pyrrolopyrrolcyanin (PAS).Die Dyaden wurden in Ensemblemessungen photophysikalisch charakterisiert. In allen drei Dyaden konnte eine quantitative Energieübertragung des Donors auf den Akzeptor beobachtet werden. Für das FRET-Paar PDI/PPCy ergab sich ein Försterradius von 5,4 nm, für PDT/TDI wurden 6,8 nm ermittelt. Mit der Dyade PAT konnten in Spaltungsexperimenten unter UV-Bestrahlung gute Ergebnisse erzielt werden. Eine Spaltungsquantenausbeute von 3% wurde dabei beobachtet.Die Anwendung der Dyade PAT in Einzelmolekülmessungen bestand unter anderem in der Bestimmung von niedrigen Diffusionskoeffizienten (D Nach UV-Bestrahlung war die Beobachtung des schwächer werdenden Energietransfers in Intensitätszeitspuren einzelner Moleküle möglich. Aus den PDI- und FRET-Intensitätszeitspuren wurden Diffusionskoeffizienten bei den unterschiedlichen Temperaturen ermittelt. Die so erhaltenen Diffusionskoeffizienten wurden mit denen aus Einzelmolekülverfolgungs-Experimenten verglichen und die Gültigkeit beider Methoden in unterschiedlichen Viskositätsbereichen diskutiert. Es zeigte sich außerdem beim Vergleich mit einem theoretischen Modell (Vogel-Fulcher-Tammann-Hesse-Gleichung), dass die FRET-Methode für 2*10-19 m2s-1 > D > 1*10-21 m2s-1 zuverlässige Werte liefert, während die Einzelmolekülverfolgung erst ab D > 2*10-18 m2s-1 zuverlässig ist. Durch die FRET-Methode sind nun erstmals Diffusionskoeffizienten aus Bereichen höherer Viskosität mittels Fluoreszenzmikroskopie zugänglich.Darüber hinaus konnte erstmals eine unabhängige Einzelmolekülverfolgung von Donor und Akzeptor nach Photospaltung gezeigt werden. In einen PEA-Film (MW(PEA) = 100000 g/mol) wurde dafür die Dyade PAT eingebettet und ebenfalls am Weitfeldmikroskop untersucht.In dieser Arbeit wurde außerdem eine Möglichkeit der Hochauflösung durch Einsatz der apolaren Fluoreszenzfarbstoff-Dyade PAT entwickelt. Die Grundlage hierfür ist die Photoschaltbarkeit des Donors PDI. Innerhalb der intakten Dyade wurde zunächst bei Anregung des PDI die Emission des TDI und nach Photobleichen des TDI die PDI-Fluoreszenz beobachtet. Daraufhin folgte das Photobleichen des PDI. Erste grundlegende Untersuchungen der Dyade für Anwendungen in der hochaufgelösten Mikroskopie wurden durchgeführt. Dabei wurden die Zeiten bis zum Photobleichen des PDI innerhalb der Dyade beobachtet. Außerdem wurde der Verlauf der Gesamtzahl der fluoreszierenden PDI innerhalb der Bilderserien analysiert. Somit konnte der Anteil an fluoreszierenden PDI-Molekülen pro Bild bestimmt werden, welcher entscheidend für die Eignung der Dyade für die hochauflösende Mikroskopie ist. Es zeigte sich, dass der Anteil an fluoreszierenden PDI-Molekülen pro Bild zwischen 3,3 und 6% liegt und somit nicht niedrig genug ist. Damit kann zwar eine 1D-Auflösung von etwa 50 nm erzielt werden, für eine 2D-Auflösung ist der Anteil an fluoreszierenden PDI-Molekülen jedoch zu hoch

Enhanced accuracy of single-molecule diffusion measurements with a photocleavable energy-transfer dyad

A photocleavable energy-transfer dyad was synthesized, characterized, and applied to single-molecule fluorescence microscopy. After photocleavage, a combination of independent two-color single-molecule tracking and analysis of single-molecule energy-transfer efficiencies allows the determination of the temporal evolution of the relative distances between both fragments from the nm to the μm scale. This gives access to a broad range of diffusion coefficients