Neue Signalwege in Myxococcus xanthus : Die Entdeckung des SgmT/DigR-Regulons und die Untersuchung der zellulären Rolle von c-di-GMP

Die extrazelluläre Matrix von Myxococcus xanthus ist ein essentieller Bestandteil für ein funktionelles Typ-IV-Pili-abhängiges Bewegungssystem sowie für den kontrollierten Ablauf des charakteristischen Entwicklungs-programms in nährstoffarmer Umgebung. Die korrekte Zusammensetzung der extrazellulären Matrix wird über Proteine von Zwei-Komponenten-Systemen einschließlich des verwaisten Antwortregulators DigR reguliert. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die verwaiste Hybrid-Histidinkinase SgmT charakterisiert und als korrespondierender Partner von DigR identifiziert. Neben einer Kinase- und einer Empfängerdomäne besitzt SgmT eine N-terminale GAF-Domäne und eine C-terminale GGDEF-Domäne. Mit Hilfe genetischer und biochemischer Analysen wurde die Funktion der einzelnen Domänen von SgmT untersucht, wobei die GAF-Domäne als sensorische Haupteinheit fungiert und die Kinaseaktivität von SgmT steuert. Die GGDEF-Domäne ist ein Rezeptor für den sekundären Botenstoffs c-di-GMP, der SgmT abhängig von dessen Bindung zellulär lokalisiert. Desweiteren wurde eine DigR-Bindestelle im Promoter von fibA identifiziert, einem Gen, das für eine extrazelluläre Matrixprotease kodiert. Die Identifikation weiterer DigR-Bindestellen in den Promotorregionen von signifikant-regulierten Genen aus vergleichenden Transkriptomstudien lässt vermuten, dass das SgmT/DigR-Regulon aus Genen besteht, die für sekretierte Proteine sowie für Enzyme des Sekundärmetabolismus kodieren. Diese Beobachtungen geben Grund zur Annahme, dass SgmT und DigR die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix direkt regulieren, und dass die Funktion von SgmT über zwei sensorische Domänen gesteuert wird, wobei die Kinaseaktivität durch Ligandenbindung an die GAF-Domäne und die zelluläre Lokalisierung von SgmT über die Bindung von c-di-GMP an die GGDEF-Domäne reguliert wird. Desweiteren wurden konservierte c-di-GMP-abhängige Proteine in M. xanthus identifiziert und damit begonnen deren Einfluss auf wichtige zelluläre Prozesse hin zu untersuchen. Darüber hinaus wurden erste Erkenntnisse gewonnen, dass c-di-GMP möglicherweise an der Koordination des Entwicklungsprogramms beteiligt sein könnte

A Minimal Threshold of c-di-GMP Is Essential for Fruiting Body Formation and Sporulation in Myxococcus xanthus

Generally, the second messenger bis-(3’-5’)-cyclic dimeric GMP (c-di-GMP) regulates the switch between motile and sessile lifestyles in bacteria. Here, we show that c-di-GMP is an essential regulator of multicellular development in the social bacterium Myxococcus xanthus. In response to starvation, M. xanthus initiates a developmental program that culminates in formation of spore-filled fruiting bodies. We show that c-di-GMP accumulates at elevated levels during development and that this increase is essential for completion of development whereas excess c-di-GMP does not interfere with development. MXAN3735 (renamed DmxB) is identified as a diguanylate cyclase that only functions during development and is responsible for this increased c-di-GMP accumulation. DmxB synthesis is induced in response to starvation, thereby restricting DmxB activity to development. DmxB is essential for development and functions downstream of the Dif chemosensory system to stimulate exopolysaccharide accumulation by inducing transcription of a subset of the genes encoding proteins involved in exopolysaccharide synthesis. The developmental defects in the dmxB mutant are non-cell autonomous and rescued by co-development with a strain proficient in exopolysaccharide synthesis, suggesting reduced exopolysaccharide accumulation as the causative defect in this mutant. The NtrC-like transcriptional regulator EpsI/Nla24, which is required for exopolysaccharide accumulation, is identified as a c-diGMP receptor, and thus a putative target for DmxB generated c-di-GMP. Because DmxB can be—at least partially—functionally replaced by a heterologous diguanylate cyclase, these results altogether suggest a model in which a minimum threshold level of c-di-GMP is essential for the successful completion of multicellular development in M. xanthus

Neue Signalwege in Myxococcus xanthus : Die Entdeckung des SgmT/DigR-Regulons und die Untersuchung der zellulären Rolle von c-di-GMP

Die extrazelluläre Matrix von Myxococcus xanthus ist ein essentieller Bestandteil für ein funktionelles Typ-IV-Pili-abhängiges Bewegungssystem sowie für den kontrollierten Ablauf des charakteristischen Entwicklungs-programms in nährstoffarmer Umgebung. Die korrekte Zusammensetzung der extrazellulären Matrix wird über Proteine von Zwei-Komponenten-Systemen einschließlich des verwaisten Antwortregulators DigR reguliert. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die verwaiste Hybrid-Histidinkinase SgmT charakterisiert und als korrespondierender Partner von DigR identifiziert. Neben einer Kinase- und einer Empfängerdomäne besitzt SgmT eine N-terminale GAF-Domäne und eine C-terminale GGDEF-Domäne. Mit Hilfe genetischer und biochemischer Analysen wurde die Funktion der einzelnen Domänen von SgmT untersucht, wobei die GAF-Domäne als sensorische Haupteinheit fungiert und die Kinaseaktivität von SgmT steuert. Die GGDEF-Domäne ist ein Rezeptor für den sekundären Botenstoffs c-di-GMP, der SgmT abhängig von dessen Bindung zellulär lokalisiert. Desweiteren wurde eine DigR-Bindestelle im Promoter von fibA identifiziert, einem Gen, das für eine extrazelluläre Matrixprotease kodiert. Die Identifikation weiterer DigR-Bindestellen in den Promotorregionen von signifikant-regulierten Genen aus vergleichenden Transkriptomstudien lässt vermuten, dass das SgmT/DigR-Regulon aus Genen besteht, die für sekretierte Proteine sowie für Enzyme des Sekundärmetabolismus kodieren. Diese Beobachtungen geben Grund zur Annahme, dass SgmT und DigR die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix direkt regulieren, und dass die Funktion von SgmT über zwei sensorische Domänen gesteuert wird, wobei die Kinaseaktivität durch Ligandenbindung an die GAF-Domäne und die zelluläre Lokalisierung von SgmT über die Bindung von c-di-GMP an die GGDEF-Domäne reguliert wird. Desweiteren wurden konservierte c-di-GMP-abhängige Proteine in M. xanthus identifiziert und damit begonnen deren Einfluss auf wichtige zelluläre Prozesse hin zu untersuchen. Darüber hinaus wurden erste Erkenntnisse gewonnen, dass c-di-GMP möglicherweise an der Koordination des Entwicklungsprogramms beteiligt sein könnte

The orphan histidine protein kinase SgmT is a c-di-GMP receptor and regulates composition of the extracellular matrix together with the orphan DNA binding response regulator DigR in Myxococcus xanthus

In Myxococcus xanthus the extracellular matrix is essential for type IV pili-dependent motility and starvation-induced fruiting body formation. Proteins of two-component systems including the orphan DNA binding response regulator DigR are essential in regulating the composition of the extracellular matrix. We identify the orphan hybrid histidine kinase SgmT as the partner kinase of DigR. In addition to kinase and receiver domains, SgmT consists of an N-terminal GAF domain and a C-terminal GGDEF domain. The GAF domain is the primary sensor domain. The GGDEF domain binds the second messenger bis-(3'-5')-cyclic-dimeric-GMP (c-di-GMP) and functions as a c-di-GMP receptor to spatially sequester SgmT. We identify the DigR binding site in the promoter of the fibA gene, which encodes an abundant extracellular matrix metalloprotease. Whole-genome expression profiling experiments in combination with the identified DigR binding site allowed the identification of the DigR regulon and suggests that SgmT/DigR regulates the expression of genes for secreted proteins and enzymes involved in secondary metabolite synthesis. We suggest that SgmT/DigR regulates extracellular matrix composition and that SgmT activity is regulated by two sensor domains with ligand binding to the GAF domain resulting in SgmT activation and c-di-GMP binding to the GGDEF domain resulting in spatial sequestration of SgmT

c-di-GMP regulates <i>epsABD</i> transcription.

<p>Total RNA was isolated at the indicated time points from cells of WT (closed circles) and the Δ<i>dmxB</i> mutant (open squares) developed in submerged culture. Transcript levels are shown as mean ± standard deviation from two biological replicates with each three technical replicates relative to WT at 0 hrs.</p

c-di-GMP levels in cells of the indicated mutants during starvation.

<p>(A, B) c-di-GMP levels in cells of the indicated genotypes were determined from three biological replicates as described in <a href="http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1006080#pgen.1006080.g001" target="_blank">Fig 1</a>. Note that the data for the WT are the same as in <a href="http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1006080#pgen.1006080.g001" target="_blank">Fig 1</a> and in (B) the data for the WT and Δ<i>dmxB</i> strains are the same as in (A) and are shown again for the indicated time points for comparison. Note the different scale in (B) and for the Δ<i>dmxB/dmxB</i>^R210A strain. * p < 0.05, ** p < 0.001 in Student’s t-test comparing the different mutants to the WT at the same time points.</p

<i>In vitro</i> assay for enzyme activity and c-di-GMP binding.

<p>(A) DGC assay of DmxB variants. The indicated His6-tagged full-length DmxB variants were incubated with [α-³²P]-GTP for the indicated periods of time followed by separation of nucleotides by TLC. Full-length DgcA^WT was used as a positive control. GTP and c-di-GMP are indicated. The intermediate product indicated was described as a product formed during the DGC-dependent synthesis of c-di-GMP [<a href="http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1006080#pgen.1006080.ref049" target="_blank">49</a>]. Numbers at the bottom indicate levels of c-di-GMP in % of the total signal in each lane. (B) PDE activity assay of PmxA. The indicated PmxA variants were incubated with [α-³²P]-labeled c-di-GMP for the indicated periods of time followed by separation of nucleotides by TLC. pGpG and c-di-GMP are indicated. Numbers at the bottom indicate levels of pGpG in % of the total signal in each lane. (C) DRaCALA to detect c-di-GMP binding. The indicated full-length DmxB variants were incubated with [α-³²P]-c-di-GMP with or without unlabeled c-di-GMP or GTP as competitors as indicated. 10 μl of the reaction mixtures were transferred to a nitrocellulose filter, dried and imaged.</p

Complementation experiments with Δ<i>dmxB</i>, Δ<i>pmxA</i> and Δ<i>tmoK</i> mutants.

<p>(A) Domain structure of DmxB, PmxA and TmoK. The primary sequences of the indicated proteins were analyzed for domain structure using [<a href="http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1006080#pgen.1006080.ref047" target="_blank">47</a>]. (B) Fruiting body formation and sporulation under two different starvation conditions. Cells were treated and spores enumerated as described in <a href="http://www.plosgenetics.org/article/info:doi/10.1371/journal.pgen.1006080#pgen.1006080.g002" target="_blank">Fig 2B</a>. Scale bars: TPM agar 500 μm, submerged culture 100 μm. (C) Immunoblot detection of DmxB in total cell extracts. Total cell lysates from cells of the indicated genotypes were harvested from starvation agar at 24 hrs of development, separated by SDS-PAGE and probed with rabbit, polyclonal α-DmxB serum. Protein from the same calculated number of cells was loaded per lane. DmxB has a calculated molecular mass of 35.3 kDa. Molecular mass marker is indicated on the left. The non-specific band above the band corresponding to DmxB serves as an internal loading control.</p