Таблеткові суміші, що містять іммобілізований лізоцим і кверцетин: отримання, властивості

Introduction. Lysozyme (EC 3.2.1.17), which has antibacterial, anti-inflammatory, immunomodulatory actions is increasingly used in medicine in a different dosage forms: tablets, wound coatings, capsules, gels, etc. Tablet is a convenient dosage form for usage of lysozyme in combination with other biologically active substances. The targeted stabilization of enzyme by immobilization into polymeric matrices determines the relevance of tablet form development of complex compositions of lysozyme and quercetin.The aim of the study – development of tablet blends of complex preparation of immobilized lysozyme and quercetin, their quantitative determination and the study of the properties of active substances.Methods of the research. Lysozyme activity was determined by bacteriolytic method. The protein content was controlled according to Lowry-Hartree, quercetin – using zirconium chloride.Results and Discussion. Using the earlier obtained data about the interaction of lysozyme with polymeric supports of different origin and structure, for the development of tableting mixtures with lysozyme and quercetin, as polymeric binders the poly-N-vinylpyrrolidone, sodium salt of carboxymethyl cellulose and gelatin were chosen. The comparative analysis of physico-chemical properties of immobilized in polymers lysozyme had shown prospects of gelatin usage as a matrice, which promotes widening of pH-profile of enzyme activity both in areas of acidic and alkaline pH values, stability in acidic media. For making the lysozyme and quercetin – containing tableting mixtures, the fillers, disintegrants, flavours and wet granulation method were chosen. The total preservation of lysozyme activity and quercetin content in obtained granules was shown.conclusions. Tablet mixtures with lysozyme and quercetin with usage of polymeric carriers of different origin and structure were developed. The analysis of biochemical and physico-chemical properties of immobilized lysozyme had shown prospects of gelatin usage as a matrice. Immobilization promotes widening of pH-profile of enzyme activity both in areas of acidic and alkaline pH values, stability in acidic media. Вступление. Лизоцим (КФ 3.2.1.17), обладающий антибактериальным, противовоспалительным, иммуномодулирующим действиями, все чаще используют в медицине в различных лекарственных формах (таблетки, раневые покрытия, капсулы, гели и пр.). Таблетки являются удобной лекарственной формой для применения лизоцима в сочетании с другими биологически активными веществами. Целенаправленная стабилизация энзима иммобилизацией в полимерные матрицы определяет актуальность разработки таблеточной формы сложных композиций лизоцима и кверцетина.Цель исследования – разработка таблеточных смесей комплексного препарата иммобилизованного лизоцима и кверцетина, количественное определение и изучение свойств действующих веществ.Методы исследования. Активность лизоцима определяли бактериолитическим методом. Содержание белка контролировали методом Лоури–Хартри, кверцетина – с использованием хлорида циркония.Результаты и обсуждение. На основе ранее полученных данных о взаимодействии лизоцима с полимерными носителями различного происхождения и структуры для разработки таблеточных смесей с лизоцимом и кверцетином в качестве полимерных носителей были выбраны поли-N-винилпирролидон, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и желатин. Сравнительный анализ физико-химических свойств иммобилизованного в полимеры лизоцима показал перспективность использования желатина в качестве матрицы, что способствует расширению рН-профиля активности энзима в области кислых и щелочных значений рН, стабильности в кислой среде. Для приготовления лизоцима и кверцетинсодержащих таблеточных смесей были выбраны наполнители, разрыхлители, ароматизаторы и метод влажной грануляции. Показано полное сохранение активности лизоцима и содержания кверцетина в полученных гранулах.Выводы. Разработаны таблеточные смеси с лизоцимом и кверцетином с использованием полимерных носителей различного происхождения и структуры. Анализ биохимических и физико-химических свойств иммобилизованного лизоцима показал перспективность использования желатина в качестве матрицы. Иммобилизация способствует расширению рН-профиля активности энзима как в области кислотных и щелочных значений pH, так и в кислой среде.Вступ. Лізоцим (КФ 3.2.1.17), що має антибактеріальну, протизапальну, імуномодулюючу дії, все частіше використовують у медицині в різних лікарських формах (таблетки, ранові покриття, капсули, гелі та ін.). Таблетки є зручною лікарською формою для застосування лізоциму в поєднанні з іншими біологічно активними речовинами. Цілеспрямована стабілізація ензиму іммобілізацією в полімерні матриці визначає актуальність розробки таблеткової форми складних композицій лізоциму і кверцетину.Мета дослідження – розробка таблеткових сумішей комплексного препарату іммобілізованого лізоциму і кверцетину, кількісне визначення та вивчення властивостей діючих речовин.Методи дослідження. Активність лізоциму визначали бактеріолітичним методом. Вміст білка контролювали методом Лоурі–Хартрі, кверцетину – з використанням хлориду цирконію.Результати й обговорення. На основі раніше отриманих даних про взаємодію лізоциму з полімерними носіями різного походження та структури для розробки таблеткових сумішей з лізоцимом і кверцетином як полімерні носії було обрано полі-N-вінілпіролідон, натрієву сіль карбоксиметилцелюлози та желатин. Порівняльний аналіз фізико-хімічних властивостей іммобілізованого в полімери лізоциму показав перспективність використання желатину як матриці, що сприяє розширенню рН-профілю активності ензиму в ділянці кислих та лужних значень рН, стабільності в кислому середовищі. Для приготування лізоциму і кверцетиновмісних сумішей було обрано наповнювачі, розпушувачі, ароматизатори і метод вологої грануляції. Показано повне збереження активності лізоциму і вмісту кверцетину в отриманих гранулах.Висновки. Розроблено таблеткові суміші з лізоцимом і кверцетином із використанням полімерних носіїв різного походження та структури. Аналіз біохімічних і фізико-хімічних властивостей іммобілізованого лізоциму показав перспективність використання желатину як матриці. Іммобілізація сприяє розширенню рН-профілю активності ензиму як у ділянці кислих та лужних значень pH, так і в кислому середовищі

Лізоцимвмісний препарат для сльозозамінної терапії: фармакотерапевтична ефективність

Introduction. The prospective method of dry eye syndrome (DES) is the tear-substitutive therapy with the help of eye drops, among which there are absent such with enzyme lysozyme (EC 3.2.1.17), possessing bacteriolytic,immunostimulating, anti-inflammatory, regenerating, analgetic activity and have the protective function of lacrimal liquid. Because we had developed the preparation with lysozyme, timely for application in such direction and itsophthalmosafety was shown, the investigation of it’s pharmacotherapeutic effectiveness was advisable.The aim of the study – investigation of the pharmaco-therapeutic effectiveness of eye drops “artificial tear” with lysozyme as a potential drug for the dry eye syndrome treatment.Research Methods. The study of the anti-inflammatory and regenerative properties of the produced eye drops with lysozyme was conducted on 6 sexually mature healthy rabbits of the Chinchilla strain with modelled traumatickeratitis.Results and Discussion. Basing on the previously obtained experimental data, the stable, highly active, sterile eye drops “artificial tear” with lysozyme were made for their pharmaco-therapeutic effectiveness investigation on the Chinchilla rabbits with modelled traumatic keratitis. It was shown, that instillations of eye drops "artificial tear" with lysozyme in the treatment of traumatic keratitis have an anti-inflammatory and regenerative effect, helping the more quick liquidation of the inflammation and acceleration of the epithelization process compared with control.Conclusions. For conduction of preclinical research, the highly-active, stable, sterile eye drops “artificial tear” with lysozyme were made. The instillations of the obtained eye drops at treatment of traumatic keratitis renders anti-inflammatory and regenerative effect, helping the more quick liquidation of inflammation and the acceleration of the epithelization process.Вступление. Перспективным методом лечения синдрома сухого глаза является слезозаменительная терапия с помощью глазных капель, среди которых отсутствуют таковые с энзимом лизоцимом (КФ 3.2.1.17), имеющим бактериолитическое, иммуностимулирующее, противовоспалительное, регенерирующее, обезболивающее действие и выполняющим защитную функцию слезной жидкости. Поскольку мы разработали препарат с лизоцимом, актуальный для использования в данном направлении, показали его офтальмобезвредность, целесообразно изучить его  фармакотерапевтическую эффективность.Цель исследования – изучить фармакотерапевтическую эффективность глазных капель “искусственная слеза” с лизоцимом как потенциального препарата для лечения синдрома сухого глаза.Методы исследования. Противовоспалительные и регенераторные свойства изготовленных глазных капель с лизоцимом изучали на 6 половозрелых здоровых кроликах породы Шиншилла с моделированнымтравматическим кератитом.Результаты и обсуждение. На основе ранее полученных экспериментальных данных были изготовлены стабильные, высокоактивные, стерильные глазные капли “искусственная слеза” с лизоцимом для исследования их фармакотерапевтической эффективности на кроликах породы Шиншилла с моделированным травматическим кератитом. Показано, что инстилляции глазных капель “искусственная слеза” с лизоцимом при лечении травматического кератита оказывают противовоспалительное и регенера торное действие, способствуя более быстрой ликвидации воспаления и ускорению процесса эпителизации по сравнению с контролем.Выводы. Для проведения доклинических исследований изготовлены стабильные, высокоактивные, стерильные глазные капли “искусственная слеза” с лизоцимом. Инстилляции полученных глазных капель при лечении травматического кератита оказывают противовоспалительное и регенераторное действие, способствуя более быстрой ликвидации воспаления и ускорению процесса эпителизации.Вступ. Перспективним методом лікування синдрому сухого ока є сльозозамінна терапія за допомогою очних крапель, серед яких відсутні такі з ензимом лізоцимом (КФ 3.2.1.17), що має бактеріолітичну, імуностимулювальну, протизапальну, регенерувальну, знеболювальну дію і виконує захисну функцію слізної рідини. Оскільки ми розробили препарат з лізоцимом, актуальний для використання в даному напрямку, показали його офтальмобезпечність, доцільно вивчити його фармакотерапевтичну ефективність.Мета дослідження – вивчити фармакотерапевтичну ефективність очних крапель “штучна сльоза” з лізоцимом як потенційного препарату для лікування синдрому сухого ока. Методи дослідження. Протизапальні та регенераторні властивості виготовлених очних крапель з лізоцимом вивчали на 6 статевозрілих здорових кролях породи Шиншила з модельованим травматичнимкератитом. Результати й обговорення. На основі раніше отриманих експериментальних даних було виготовлено стабільні, високоактивні, стерильні очні краплі “штучна сльоза” з лізоцимом для дослідження їх фармакотерапевтичної ефективності на кролях породи Шиншила з модельованим травматичним кератитом. Показано, що інстиляції очних крапель “штучна сльоза” з лізоцимом при лікуванні травматичного кератиту чинять протизапальну і регенераторну дію, сприяючи більш швидкій ліквідації запалення таприскоренню процесу епітелізації порівняно з контролем.Висновки. Для проведення доклінічних досліджень виготовлено стабільні, високоактивні, стерильні очні краплі “штучна сльоза” з лізоцимом. Інстиляції отриманих очних крапель при лікуванні травматичного кератиту чинять протизапальну і регенераторну дію, сприяючи більш швидкій ліквідації запалення та прискоренню процесу епітелізації

Дослідження складу і властивостей виділеного з хрону препарату пероксидази

Using the precipitation of proteins by zinc and ammonium sulfates, then by polymer and subsequent dialysis, the peroxidase preparation from horseradish roots was isolated (RZ=0.7), with yield by protein 1.7 % and specific peroxidative activity 7.6 U. By SDS-electrophoresis method it was verified the obtaining of partially purified peroxidase preparation with molecular mass (43±0.5) kDa. By the native electrophoresis method it was determined, that 80.8 % of the total preparation protein possesses expressed peroxidase activity. Из корней хрена способом осаждения белков сульфатами цинка и аммония, путем использования полимера и диализа выделен препарат пероксидазы (RZ 0,70), с выходом по белку 1,7 %, удельной окислительно-восстановительной активностью 7,6 Ед. С применением SDS‑электрофореза показано получение частично очищенного препарата пероксидазы с молекулярной массой основной фракции (43±0,5) кДа. Методом нативного электрофореза установлено, что 80,8 % общего белка препарата обладают выраженной пероксидазной активностью.З коренів хрону способом осадження білків сульфатами цинку й амонію, шляхом використання полімеру і діалізу виділено препарат пероксидази (RZ 0,70) з виходом по білку 1,7 %, питомою окисно-відновною активністю 7,6 Од. Із застосуванням SDS-електрофорезу показано отримання частково очищеного препарату пероксидази з молекулярною масою основної фракції (43±0,5) кДа. Методом нативного електрофорезу встановлено, що 80,8 % загального білка препарату мають виражену пероксидазну активність.

Окисление фенола ковалентно иммобилизованной пероксидазой хрена

За модифікованим методом Баха виділено частково очищений препарат пероксидази хрону (RZ = 1,0; активність 100 Од/мг протеїну). Молекулярну масу виділеної пероксидази хрону (42 972 Да) підтверджено методом мас спектрометрії – матрично активованої лазерної десорбції/іонізації. Одержаний препарат був ковалентно іммобілізований шляхом періодатного окиснення полісахаридної мембрани «Діацел» з наступним відновленням боргідридом натрію у масовому відношенні ензим:носій 0,2:1. Отримано біокаталізатор з кількісним зв’язуванням протеїну, зі збереженням 88% активності (масове відношення ензим:носій 0,2:1), розширеними значеннями рН і термооптимумів активності, збільшеною термостабільністю, стійкістю під час зберігання (8 міс). Кінетичні дослідження показали збільшення значень K м за пероксидом водню і пірогалолом, зменшення значень Vmax реакції, яка каталізується іммобілізованою пероксидазою хрону. Розроблений біокаталізатор у реакторі періодичної дії сприяв кількісному окисненню фенолу (1 мМ) упродовж 7 циклів використання та високому рівню його біоконверсії (95–50%) у наступні 15 циклів. Методом лазерної десорбціїї/іонізації вперше визначено молекулярну масу (близько 2 021 Да) нерозчинного у воді і більшості органічних розчинників полімерного продукту пероксидазного окиснення фенолу – поліоксифенілену (розмір частинок 15–75 мкм), що складається з 21 залишку.According to modified Bakh’s method, partially purified horseradish peroxidase preparation (RZ = 1,0; activity 100 U/mg of protein) was isolated. Molecular mass of obtained HPR (42 972 Da) was confirmed by massspectrometry: matrix activated laser desorption/ ionization. The enzyme was covalently immobilized by periodate oxidation of polysaccharide membrane «Diacell», followed by sodium borohydride reduction, at mass ratio enzyme: support 0.2:1. The biocatalyst with quantitative protein coupling, 88% of activity’s pH- and thermooptima, increased termostability, stable at storage (8 months) was obtained. Kinetic studies had shown the increasing of hydrogen peroxide and pyrogallol Kм values and decreasing of Vmax values during immobilized HPR catalyzed reactions. In the batch reactor the biocatalyst developed promoted the quantitative phenol oxidation (1 mmol/dm3) during 7 cycles of usage and high level of it’s bioconversion (95–50%) during the next 15 cycles. Molecular weight (about 2021 Da) of polymer product, insoluble in water and most organic solvent, of peroxidase oxidation of phenol – polioxyfenilene (particle size is from 15 to 75 mm) consisting of 21 units was first determined by laser desorption/ionization.По модифицированному методу Баха выделен частично очищенный препарат пероксидазы хрена (RZ = 1,0; активность 100 Ед/мг протеина). Молекулярная масса выделенной пероксидазы хрена (42 972 Да) подтверждена методом масс спектрометрии – матрично активированной лазерной десорбции / ионизации. Полученный препарат был ковалентно иммобилизован путем перйодатного окисления полисахаридной мембраны «Диацелл» с последующим восстановлением боргидридом натрия в массовом отношении энзим: носитель 0,2:1. Получен биокатализатор с количественным связыванием протеина, с сохранением 88% активности (массовое отношение энзим: носитель 0,2:1), расширенными значениями рН- и термооптимумов активности, увеличенной термостабильностью, устойчивостью при хранении (8 мес). Кинетические исследования показали увеличение значений Kм по пероксиду водорода и пирогаллолу; уменьшение значений V max реакции, которая катализируется иммобилизованной ПОХ. Разработанный биокатализатор в реакторе периодического действия способствовал количественному окислению фенола (1 мМ) в течение 7 циклов использования и высокому уровню его биоконверсии (95–50%) в последующие 15 циклов. Методом лазерной десорбции/ионизации впервые определена молекулярная масса (около 2 021 Да) нерастворимого в воде и большинстве органических растворителей полимерного продукта пероксидазного окисления фенола – полиоксифенилена (размер частиц 15–75 мкм), состоящего из 21 звена