Optimized detection of circulating anti-nuclear envelope autoantibodies by immunofluorescence

BACKGROUND: Antinuclear antibodies are useful diagnostic tools in several autoimmune diseases. However, the routine detection of nuclear envelope autoantibodies using immunofluorescence (IF) is not always easy to perform in patients' sera because of the presence of autoantibodies to other nuclear and cytoplasmic components which could mask the characteristic rim-like pattern of nuclear envelope autoantibodies. This is particularly common in sera from patients with primary biliary cirrhosis (PBC), which generaly have high titres of anti-mitochondrial antibodies. Therefore, we have assayed a number of commercial slides and alternative fixation conditions to optimize the detection of anti-nuclear envelope antibodies (ANEA) in PBC sera. METHODS: We have explored the presence of ANEA in 33 sera from patients with established PBC using three different Hep2 commercial slides and home-made slides with HeLa and Hep2 cells fixed with methanol, ethanol, 1% or 4% formaldehyde. RESULTS: We observed that the IF pattern was related to the cell type used (Hep2 or HeLa), the manufacturer and the cell fixation scheme. When both cell lines were fixed with 1% formaldehyde, the intensity of the cytoplasmic staining was considerably decreased regardless to the serum sample, whereas the prevalence of cytoplasmic autoantibodies was significantly lowered, as compared to any of the Hep2 commercial slide and fixation used. In addition, the prevalence of ANEA was importantly increased in formaldehyde-fixed cells. CONCLUSION: Immunofluorescence using appropriately fixed cells represent an easy, no time-consuming and low cost technique for the routine screening of sera for ANEA. Detection of ANEA is shown to be more efficient using formaldehyde-fixed cells instead of commercially available Hep2 cells

Intrabody-mediated diverting of HP1β to the cytoplasm induces co-aggregation of H3-H4 histones and lamin-B receptor

Diverting a protein from its intracellular location is a unique property of intrabodies. To interfere with the intracellular traffic of heterochromatin protein 1β (HP1β) in living cells, we have generated a cytoplasmic targeted anti-HP1β intrabody, specifically directed against the C-terminal portion of the molecule. HP1β is a conserved component of mouse and human constitutive heterochromatin involved in diverse nuclear functions including gene silencing, DNA repair and nuclear membrane assembly. We found that the anti-HP1β intrabody sequesters HP1β into cytoplasmic aggregates, inhibiting its traffic to the nucleus. Lamin B receptor (LBR) and a subset of core histones (H3/H4) are also specifically co-sequestered in the cytoplasm of anti-HP1β intrabody-expressing cells. Methylated histone H3 at K9 (Me9H3), a marker of constitutive heterochromatin, is not affected by the anti-HP1β intrabody expression. Hyper-acetylating conditions completely dislodge H3 from HP1β:LBR containing aggregates. The expression of anti-HP1β scFv fragments induces apoptosis, associated with an alteration of nuclear morphology. Both these phenotypes are specifically rescued either by overexpression of recombinant full length HP1β or by HP1β mutant containing the chromoshadow domain, but not by recombinant LBR protein. The HP1β-chromodomain mutant, on the other hand, does not rescue the phenotypes, but does compete with LBR for binding to HP1β. These findings provide new insights into the mode of action of cytoplasmic-targeted intrabodies and the interaction between HP1β and its binding partners involved in peripheral heterochromatin organisation

Hypophosphorylation of the architectural chromatin protein DEK in death-receptor-induced apoptosis revealed by the isotope coded protein label proteomic platform

During apoptosis nuclear morphology changes dramatically due to alterations of chromatin architecture and cleavage of structural nuclear proteins. To characterize early events in apoptotic nuclear dismantling we have performed a proteomic study of apoptotic nuclei. To this end we have combined a cell-free apoptosis system with a proteomic platform based on the differential isotopic labeling of primary amines with N -nicotinoyloxy-succinimide. We exploited the ability of this system to produce nuclei arrested at different stages of apoptosis to analyze proteome alterations which occur prior to or at a low level of caspase activation. We show that the majority of proteins affected at the onset of apoptosis are involved in chromatin architecture and RNA metabolism. Among them is DEK, an architectural chromatin protein which is linked to autoimmune disorders. The proteomic analysis points to the occurrence of multiple PTMs in early apoptotic nuclei. This is confirmed by showing that the level of phosphorylation of DEK is decreased following apoptosis induction. These results suggest the unexpected existence of an early crosstalk between cytoplasm and nucleus during apoptosis. They further establish a previously unrecognized link between DEK and cell death, which will prove useful in the elucidation of the physiological function of this protein.Peer Reviewedhttp://deepblue.lib.umich.edu/bitstream/2027.42/55852/1/5758_ftp.pd

Mesenchymal Stromal Cells Primed with Paclitaxel Provide a New Approach for Cancer Therapy

BACKGROUND: Mesenchymal stromal cells may represent an ideal candidate to deliver anti-cancer drugs. In a previous study, we demonstrated that exposure of mouse bone marrow derived stromal cells to Doxorubicin led them to acquire anti-proliferative potential towards co-cultured haematopoietic stem cells (HSCs). We thus hypothesized whether freshly isolated human bone marrow Mesenchymal stem cells (hMSCs) and mature murine stromal cells (SR4987 line) primed in vitro with anti-cancer drugs and then localized near cancer cells, could inhibit proliferation. METHODS AND PRINCIPAL FINDINGS: Paclitaxel (PTX) was used to prime culture of hMSCs and SR4987. Incorporation of PTX into hMSCs was studied by using FICT-labelled-PTX and analyzed by FACS and confocal microscopy. Release of PTX in culture medium by PTX primed hMSCs (hMSCsPTX) was investigated by HPLC. Culture of Endothelial cells (ECs) and aorta ring assay were used to test the anti-angiogenic activity of hMSCsPTX and PTX primed SR4987(SR4987PTX), while anti-tumor activity was tested in vitro on the proliferation of different tumor cell lines and in vivo by co-transplanting hMSCsPTX and SR4987PTX with cancer cells in mice. Nevertheless, despite a loss of cells due to chemo-induced apoptosis, both hMSCs and SR4987 were able to rapidly incorporate PTX and could slowly release PTX in the culture medium in a time dependent manner. PTX primed cells acquired a potent anti-tumor and anti-angiogenic activity in vitro that was dose dependent, and demonstrable by using their conditioned medium or by co-culture assay. Finally, hMSCsPTX and SR4987PTX co-injected with human cancer cells (DU145 and U87MG) and mouse melanoma cells (B16) in immunodeficient and in syngenic mice significantly delayed tumor takes and reduced tumor growth. CONCLUSIONS: These data demonstrate, for the first time, that without any genetic manipulation, mesenchymal stromal cells can uptake and subsequently slowly release PTX. This may lead to potential new tools to increase efficacy of cancer therapy

Protein kinases that phosphorylates histone H3

Στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου εντοπίζονται ένζυμα που τροποποιούν τις πρωτεΐνες της εσωτερικής πυρηνικής μεμβράνης όπως είναι η κινάση του LBR. Τα τελευταία χρόνια στα στοιχεία του πυρηνικού φακέλου έχει προστεθεί και η περιφερική ετεροχρωματίνη. Η ετεροχρωματινική πρωτεΐνη 1 (ΗΡ1) αποτελεί κύριο καταστολέα του φαινομένου επίδρασης θέσης και ενέχεται στη δημιουργία και διατήρηση της δομής της χρωματίνης. Παλαιότερες μελέτες του εργαστηρίου μας, έχουν δείξει ότι η ΗΡ1 συνδέεται στον πυρηνικό φάκελο. Η σύνδεση αυτή πραγματοποιείται μέσω του σχηματισμού συμπλόκου ανάμεσα στον LBR τις νουκλεοσωμικές ιστόνες Η3/Η4 και την ΗΡ1.Η ΗΡ1 συνδέεται με ένζυμα όπως η μεθυλοτρανσφεράση Suvar 3-9, η οποία μεθυλιώνει την ιστόνη Η3 στη λυσίνη 9. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω θεωρήσαμε ενδιαφέρον να διερευνήσουμε την ύπαρξη πρωτεϊνικών κινασών που φωσφορυλιώνουν ιστόνες της ετεροχρωματίνης που συνδέονται με τον πυρηνικό φάκελο. Χρησιμοποιώντας την μέθοδο συγκατακρίμνησης πρωτεϊνών με σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης (GST pull-down) διαπιστώσαμε ότι μαζί με την ανασυνδιασμένη Μ31 (ΗΡ1β) συγκατακριμνίζεται εκτός από τις νουκλεοσωμικές ιστόνες και μια κινάση που φωσφορυλιώνει την Η3 στη θρεονίνη 3. Η κινάση συνδέεται με την Μ31 και όχι με τα νουκλεοσώματα. Για να μελετήσουμε την ύπαρξη και κατανομή της φωσφορυλιωμένης στη θρεονίνη 3 Η3 παράγαμε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που αναγνωρίζει την συγκεκριμένη τροποποίηση. Το αντίσωμα χαρακτηρίστηκε ως προς την ικανότητα του να αναγνωρίζει ειδικά τη φωσφορυλιωμένη στη θρεονίνη 3 Η3 με ELISA, ανοσοφθορισμό και ανοσοαποτύπωση. Δείξαμε την ύπαρξη της συγκεκριμένης τροποποίησης in vivo η οποία ανιχνεύθηκε σε όλες τις καρκινικές σειρές (τραχήλου της μήτρας, μαστού, προστάτη, λευχαιμικές) που εξετάσαμε καθώς και σε φυσιολογικά κύτταρα (πολυδύναμα μεσεγχυματικά και μυελού των οστών, ενεργοποιημένα λεμφοκύτταρα ποντικού). Η κατανομή της φωσφορυλιωμένης στη θρεονίνη 3 Η3 είναι παρόμοια για όλα τα είδη κυττάρων που μελετήσαμε.Όπως οι περισσότερες φωσφρορυλιώσεις των ιστονών έτσι και η συγκεκριμένη εντοπίζεται στη μίτωση. Η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 αρχίζει στην πρόφαση και σταματάει να υφίσταται στο τέλος της ανάφασης. Κατά την πρόφαση εντοπίζεται γύρω από τον πυρηνικό φάκελο ενώ συνεχίζοντας στην προμετάφαση-μετάφαση παρατηρείται σε κεντρικές περιοχές των χρωμοσωμάτων καθώς και κατά μήκος των χρωμοσωμάτων. Τέλος κατά στην αρχή της ανάφασης ανιχνεύεται στα άκρα των χρωμοσωμάτων, ενώ δεν εντοπίζεται στην τελόφαση.Η καλύτερα μελετημένη φωσφορυλίωση της ιστόνης Η3 είναι η φωσφορυλίωση στην σερίνη 10. Σύγκριση των δύο τροποποιήσεων έδειξε διαφορές στην κατανομή τους. Αναλυτικότερα, η φωσφορυλίωση στη σερίνη 10 αρχίζει στη μεσόφαση (G2) και συνεχίζεται μέχρι το τέλος της μίτωσης όπου ανιχνεύεται στην περιφέρεια των νεοσχηματιζόμενων πυρήνων ενώ αντίθετα η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 απουσιάζει τόσο κατά τη μεσόφαση όσο και στην τελόφαση. Στην πρόφαση τα δυο σήματα εντοπίζονται στην περιφέρεια του πυρηνικού φακέλου ενώ κατά τη μετάφαση διαχωρίζονται, με τη φωσροφυλιωμένη στη θρεονίνη 3 Η3 να εντοπίζεται κατά μήκος των χρωμοσωμάτων και κυρίως στα κεντρομερή Από τα μέχρι τώρα διαθέσιμα αποτελέσματα υπάρχουν σοβαρές ενδείξεις ότι το ένζυμο που φωσφορυλιώνει την ιστόνη Η3 στη θρεονίνη 3 συνδέεται ισχυρά με περιφερικές δομές του πυρήνα των κυττάρων. Συγκεκριμένα, πειράματα ανοσοφθορισμού που πραγματοποιήσαμε έδειξαν ότι κατά τα πρώιμα στάδια της πρόφασης, η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 3 της Η3, αρχίζει ξεκάθαρα, από την περιοχή του πυρηνικού φακέλου. Επίσης η ενεργότητα της συγκεκριμένης κινάσης αρχικά, ανιχνεύθηκε σε παρασκευάσματα μεγάλης καθαρότητας, πυρηνικών φακέλων με περιφερική ετεροχρωματίνη, ενώ από πειράματα συγκατακρήμνισης βρέθηκε ότι η κινάση συνδέεται με την ΗΡ1 η οποία αλληλεπιδρά μέσω των ιστονών με τον LBR και κατ’ επέκταση με τον πυρηνικό φάκελο

Αλληλεπιδράσεις της ετεροχρωματίνης με τον πυρηνικό φάκελο

Διατμηματικό, συνεργαζόμενα Τμήματα Βιολογίας και Ιατρικής

Stem cell technology in breast cancer: current status and potential applications

Rena Chiotaki, Hara Polioudaki, Panayiotis A Theodoropoulos Department of Biochemistry, School of Medicine, University of Crete, Heraklion, Greece Abstract: Breast cancer, the leading cause of cancer among females, is supported by the presence of a rare subset of undifferentiated cells within the tumor, identified as breast cancer stem cells (BCSCs). BCSCs underlie the mechanisms of tumor initiation and sustenance and are implicated in the dissemination of the primary tumor to metastatic sites, as they have been found circulating in the blood of breast cancer patients. The discovery of BCSCs has generated a great amount of interest among the scientific community toward their isolation, molecular characterization, and therapeutic targeting. In this review, after summarizing the literature on molecular characterization of BCSCs and methodologies used for their isolation, we will focus on recent data supporting their molecular and functional heterogeneity. Additionally, following a synopsis of the latest approaches for BCSC targeting, we will specifically emphasize on the therapeutic use of naïve or engineered normal stem cells in the treatment of breast cancer and present contradictory findings challenging their safety. Keywords: breast cancer stem cells, cancer stem cell heterogeneity, targeting cancer stem cells, circulating tumor cells, stem cell technolog