The phylogenic characterisation of a new pathogenicity island (LEE) of strain RW1374 (O103:H2) and other STEC strains

Deckblatt-Impressum Inhaltsverzeichnis Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Einleitung Schrifttum Material und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Summary Literaturverzeichnis Danksagung SelbständigkeitserklärungDie Locus of Enterocyte Effacement-Pathogenitätsinsel (LEE-PAI) stellt ein bedeutendes Virulenzmerkmal enteropathogener Bakterien dar. Das Auftreten dieser genetischen Insel im Verlauf der Entwicklungsgeschichte LEE-positiver Enterobakterien wirft jedoch noch immer Fragen auf. In der vorliegenden Arbeit konnten die Ergebnisse der PCR-Analysen und DNS-DNSHybridisierungen verschiedener LEE-positiver Bakterien (E. coli, C. rodentium, E. alvei) hinsichtlich ihres LEE-Insertionsortes in pheU, pheV oder selC eine bereits formulierte Hypothese bestätigen, die besagt, dass der LEE mehrfach und zu verschiedenen Zeiten in unterschiedliche klonale Linien enteropathogener und enterohämorrhagischer E. coli inseriert ist. Diese Aussage wird von der Erkenntnis unterstützt, dass verschiedene Bakterienarten, Stämme unterschiedlicher klonaler Cluster und Pathovare unterschiedlichen Ursprungs denselben Intimintyp exprimieren. Die verschiedenartigen Intimintypen beruhen dabei auf einer Mosaikstruktur infolge LEE-interner Rekombinationsereignisse. Das negative Hybridisierungsergebnis mit der Intimin-Sonde eines humanen AE- positiven DEC-Stammes lässt jedoch vermuten, dass es sich hierbei um einen Mobilisierungsprozess des Intimin-Gens handelt, in dessen Folge es anstelle eines kompletten LEE nur zur Ausbreitung des Intimin-Gens unter den Enterobakterien kommt. Mittels Hybridisierungsmethoden konnte zudem gezeigt werden, dass entgegen der bisher vertretenen Ansicht die EPEC2-Stämme einen im pheV-Locus inserierten LEE besaßen. Die DEC 9-Klone des EHEC2-Clusters besaßen einen im pheU-Locus inserierten LEE. Jedoch weisen laut Literaturdaten die Stämme dieser beiden unterschiedlichen Cluster denselben Intimintyp (β) auf. Dahingegen besaßen die DEC 8-Klone des EHEC2-Clusters einen im pheV-Locus inserierten LEE, weisen aber einen θ-Intimintyp auf. Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass zwei unterschiedliche LEEtragende Elemente entweder gleichzeitig von verschiedenen Zellen eines EPEC2/EHEC2-Urstammes oder einzeln von den Urstämmen aufgenommen wurden. Die Vermutung einer Korrelation zwischen Intimintyp und LEE-Insertionsort wurde nicht nur durch die Hybridisierungsergebnisse mit den humanen E. coli-Stämme bestätigt, sondern auch von den Ergebnissen, die mit den bovinen E. coli-Stämme erzielt wurden. Ein großer Teil dieser Stämme besaß einen im pheU-Locus inserierten LEE sowie einen β-Intimintyp. Dasselbe traf auch auf einen C. rodentium-Stamm (DBS125) zu. Ebenso besaßen alle E. alvei-Stämme einen im pheU-Locus inserierten LEE, weisen jedoch einen α-Intimintyp auf. Die Beschreibung möglicher neuer phylogenetischer Linien AE-positiver Bakterien beruhte auf einen scheinbaren Zusammenhang zwischen LEE-Insertionsort und Intimintyp. Für die Entwicklung weiterer klonaler E. coli-Linien spricht die Ermittlung eines gemeinsamen LEEInsertionsortes (pheU oder pheV) verschiedener boviner EHEC-Stämme, die alle denselben neuen Intimintyp (ε oder ζ) aufweisen. Durchgeführte PCR- Analysen der LEE-Insertionsorte der E. coli-Stämme ergaben weiterhin, dass bei der Mehrzahl der untersuchten Stämme neben dem LEE eine zweite genomische Insel im korrespondierenden pheV- bzw. pheU-Locus inseriert ist. Das daraus entwickelte Integrationsmodell einer genetischen Insel verifiziert das von Hacker und Kaper (51) aufgestellte Evolutionsmodell von Pathogenitätsinseln. Der PAI-Vorläufer inserierte vermutlich in einen oder mehrere E. coli-Urstämme und entwickelte und verbreitete sich parallel mit der Evolution der einzelnen phylogenetischen Linien, wie wir sie heute kennen. Der LEE wurde erst aufgenommen, nachdem die ursprüngliche genomische Insel inseriert war. Am Stabilisierungsprozess einer PAI sind häufig Mutationen und Deletionen an den Verbindungspunkten zwischen PAI und tRNS-Gen beteiligt. Ein Hinweis auf diese Deletionen an der rechten LEE-PAI flankierenden Seite konnten ebenfalls die Hybridisierungsergebnisse der LEE-positiven Stämme aufgrund fehlender Hybridisierungssignale liefern. Ein genetisches Element kann theoretisch auf drei verschiedenen Wegen (Konjugation, Transformation, Transduktion) von einer Bakterienzelle aufgenommen werden. Der LEE des bovinen EHEC-Stammes RW1374 besitzt u.a. Merkmale, die vermuten lassen, dass der LEE via konjugativer Transposition erworben wurde. In einem durchgeführten Konjugationsexperiment, für dessen Zweck das Intimin-Gen (eae) des LEERW1374 mittels eines Insertionsplasmides markiert wurde, konnte der LEE jedoch nicht mobilisiert werden. Dennoch kann nicht ausgeschlossen werden, dass er einst mittels Konjugation übertragen wurde. Eine beidseitige Markierung der in pheV inserierten LEE-PAI des Stammes RW1374 wurde unter Verwendung von Insertionsplasmiden mit Erkennungssequenzen für die selten schneidende Restriktionsendonuklease NotI durchgeführt, um die Insel zu isolieren. Es gelang jedoch nur mittels homologer Rekombination eine einseitige Markierung der pheV-Insel. Die linke pheV flankierende Region wurde mit dem Plasmid pSG76-A, die rechte pheV flankierende Region mit dem Plasmid pST76-A markiert. Auch gelang die Klonierung der LEE-PAI des Stammes RW1374 in einen apathogenen E. coli K12-Stamm nicht. Ebenfalls scheiterte die Übertragung beider Methoden auf einen anderen E. coli- (3030A-86) und C. rodentium-Stamm (DBS100). Die pathogenen Eigenschaften der einseitig markierten Stämme von RW1374 (RW1374::pSG76-A und RW1374::pST76-A) sowie eines am Intimin-Gen mutagenisierten Stammes (RW1374::eaepST76-A) wurden in einem Zellkulturtest (FAS-Test) charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass eine einseitige Markierung an den Flanken der LEE-PAI keinerlei Einfluss auf die Ausbildung der für LEE-positive Bakterien typischen Attaching und Effacing-Läsionen hat. Hingegen löste der am Intimin-Gen mutagenisierte RW1374 keine AE-Läsionen in der HEp2-Zellkultur aus. Dieses Ergebnis bestätigte, dass eae-Mutanten ihre Fähigkeit verlieren, eine vollständige AE-Läsion auszulösen.The locus of enterocyte effacement pathogenicity island (LEE PAI) is a major virulence feature in enteropathogenic bacteria. The origin and spread of that genomic island during the evolutionary history of enterobacteria is poorly understood, therefore one of the major issue of this report consists in unravelling parts of the LEE history. In the present study, LEE insertion sites in various pathogens (E. coli, C. rodentium, E. alvei) unravelled by PCR analysis and hybridisation confirms that the island inserted at multiple occasions into various sites during the evolution of enteropathogenic and enterohemorrhagic E. coli lineages. The fact that different kind of bacteria, strains of various clonal clusters and pathotypes of different origin express the same intimin type but have different LEE location strongly supports this hypothesis. By the way, the various intimin types are based on a mosaic structure due to LEE internal recombination. However, the negative result of hybridisation with the intimin probe of a human AE positive DEC strain suggests that this might be due to a specific mobilisation process of the intimin gene which only results in the spread of the intimin gene instead of the entire LEE. Contrary to the current opinion it was shown by hybridisation that EPEC2 strains possess a LEE inserted in pheV locus. DEC clones 9 of EHEC2 displayed a LEE inserted in pheU. However, strains of these different clonal clusters have the same intimin type (β), while Dec clones 8 of EHEC2 displayed a LEE inserted in pheV but have intimin type θ. These results imply that two divergent LEE bearing elements might have been acquired either simultaneously by different cells from a common ancestral strain of EPEC2/EHEC2 lineages or separately by its progenitors. Human E. coli as well as bovine E. coli results confirmed a direct relationship between intimin type and LEE insertion sites. Most of the bovine strains possessed a LEE inserted in pheU and have a β intimin type. The same was true for one C. rodentium strain (DBS125). All E. alvei strains displayed a LEE inserted in pheU, too, but they have an α intimin type. The description of a possible new phylogenetic lineage of AE positive pathogens is based on an apparent correlation between LEE insertion site and intimin type. The investigation of a common LEE insertion site (pheU or pheV) of various bovine EHEC strains which all express a common intimin type (ε or ζ) indicates the evolution of further clonal lineages of E. coli. PCR analysis of LEE insertion sites in E. coli strains revealed that most of the strains possessed a second genomic island in addition to the LEE PAI inserted in the corresponding pheU and pheV locus, respectively. Hence, we developed a model of integration of a genomic island in pheV and pheU gene. This scenario fits well into the model of evolution of PAIs presumed by Hacker and Kaper (51). A putative PAI precursor integrated presumably in one or few E. coli ancestors, evolved and disseminated in parallel with evolution of the contemporary phylogenetic lineages of E. coli. LEE was apparently acquired after the primary genomic island was integrated. Mutations and deletions on the junctions between PAI and transfer-RNA gene are often involved in PAIs stabilisation. An indication of such deletions at the right LEE flanking region deliver the results of hybridisation due to absent hybridisation signals. A genomic element can be acquired by a bacterial cell in three different ways (conjugation, transformation, transduction), in theory. The LEE of the bovine EHEC strain RW1374 possesses features which are congruent with the acquisition of the LEE via conjugative transposition. The intimin (eae) gene of the LEERW1374 was marked with an insertion plasmid to mobilize the LEE. It was not possible to mobilize the LEE in an accomplished conjugation experiment, however this does not rule out a formerly transfer of the LEE via conjugation. Methods to mark both sides of the pheV inserted LEE PAI of RW1374 were used to isolate this island. For this purpose we used insertion plasmids, that carry recognition sites for the rare cutting restriction enzyme NotI. Nevertheless, only one side of the pheV located island was successfully marked via homolog recombination. pSG76-A was introduced on the left pheV flanking region, and pST76-A was introduced on the right pheV flanking region. Also cloning of the LEE PAI of RW1374 in a non-pathogenic E. coli K12 strain was not achieved. Application of these two methods to another E. coli (3030A-86) and another C. rodentium (DBS100) strain failed, too. However, the pathogenic properties of the partial marked strains RW1374::pSG76-A and RW1374::pST76-A as well as the intimin mutated strain RW1374::eaepST76-A were characterised in a cell culture assay (FAS test). It was shown that a partial marking of the LEE PAI flanking regions has no influence on attaching and effacing lesions typical for LEE containing pathogens. On the contrary, the intimin mutated strain failed to form AE lesions in HEp2 cell culture. This result indicated that intimin-mutated strains lost their ability to form AE lesions

Production of Toxic Volatile Trimethylbismuth by the Intestinal Microbiota of Mice

The biotransformation of metals and metalloids into their volatile methylated derivatives by microbes growing under anaerobic conditions (e.g., the mammalian intestinal microbiota) plays an important role in spreading these compounds in the environment. In this paper, we could show that the presence of an intact intestinal microbiota of mice provides the conditio sine qua non for the production of these mostly toxic derivatives. To document the indispensible role of the intestinal microbiota in methylating metals and metalloids to volatile derivatives under in vivo conditions, we compared the methylation capability of conventionally raised (CONV) and germ-free (GF) B6-mice fed with chow containing colloidal bismuth subcitrate (CBS) as the starting material for the formation of volatile methylated metal(loid)s. Permethylated volatile trimethylbismuth ((CH3)3Bi) was only detected in the blood of the conventionally raised mice. Concomitantly, a higher bismuth concentration was found in organs such as liver, lung, testicles, and brain of the CONV mice as compared to those of GF mice (P > 0.01), strongly suggesting a correlation between the intestinal biomethylation of bismuth and its accumulation in mammalian tissues

Chromosomal evolution of the PKD1 gene family in primates

Correction to Kirsch S, Pasantes J, Wolf A, Bogdanova N, Münch C, Pennekamp P, Krawczak M, Dworniczak B, Schempp W: Chromosomal evolution of the PKD1 gene family in primates. BMC Evolutionary Biology 2008, 8:263 (doi:10.1186/1471-2148-8-263

Proceedings 3rd ECVSMR congress

peer reviewe

Sustainable change: long-term efforts toward developing a learning organization

Globalization and intensified competition require organizations to change and adapt to dynamic environments in order to stay competitive. This article describes a longitudinal action research study supporting the strategic change of a trading company. The strategic change was accompanied by planned changes in organizational structures and processes, management systems, emerging changes in leadership, and organization members’ attitudes and behaviors, and it was supported by management development activities. Longitudinal data over a 4-year period including participant observation and interviews reveal that a systemic approach, a learning and becoming perspective toward change, trust, an appropriate role perception, and the specific use of management instruments contribute to sustained change that resulted in performance improvements and a move toward a learning organization. We conclude with implications for strategic change and suggestions for further research in this area

Elliptic flow of charged particles in Pb-Pb collisions at 2.76 TeV

We report the first measurement of charged particle elliptic flow in Pb-Pb collisions at 2.76 TeV with the ALICE detector at the CERN Large Hadron Collider. The measurement is performed in the central pseudorapidity region (|$\eta$|<0.8) and transverse momentum range 0.2< $p_{\rm T}$< 5.0 GeV/$c$. The elliptic flow signal v$_2$, measured using the 4-particle correlation method, averaged over transverse momentum and pseudorapidity is 0.087 $\pm$ 0.002 (stat) $\pm$ 0.004 (syst) in the 40-50% centrality class. The differential elliptic flow v$_2(p_{\rm T})$ reaches a maximum of 0.2 near $p_{\rm T}$ = 3 GeV/$c$. Compared to RHIC Au-Au collisions at 200 GeV, the elliptic flow increases by about 30%. Some hydrodynamic model predictions which include viscous corrections are in agreement with the observed increase.Comment: 10 pages, 4 captioned figures, published version, figures at http://aliceinfo.cern.ch/ArtSubmission/node/389

Production of He-4 and (4) in Pb-Pb collisions at root(NN)-N-S=2.76 TeV at the LHC

Results on the production of He-4 and (4) nuclei in Pb-Pb collisions at root(NN)-N-S = 2.76 TeV in the rapidity range vertical bar y vertical bar <1, using the ALICE detector, are presented in this paper. The rapidity densities corresponding to 0-10% central events are found to be dN/dy4(He) = (0.8 +/- 0.4 (stat) +/- 0.3 (syst)) x 10(-6) and dN/dy4 = (1.1 +/- 0.4 (stat) +/- 0.2 (syst)) x 10(-6), respectively. This is in agreement with the statistical thermal model expectation assuming the same chemical freeze-out temperature (T-chem = 156 MeV) as for light hadrons. The measured ratio of (4)/He-4 is 1.4 +/- 0.8 (stat) +/- 0.5 (syst). (C) 2018 Published by Elsevier B.V.Peer reviewe

Azimuthal anisotropy of charged jet production in root s(NN)=2.76 TeV Pb-Pb collisions

We present measurements of the azimuthal dependence of charged jet production in central and semi-central root s(NN) = 2.76 TeV Pb-Pb collisions with respect to the second harmonic event plane, quantified as nu(ch)(2) (jet). Jet finding is performed employing the anti-k(T) algorithm with a resolution parameter R = 0.2 using charged tracks from the ALICE tracking system. The contribution of the azimuthal anisotropy of the underlying event is taken into account event-by-event. The remaining (statistical) region-to-region fluctuations are removed on an ensemble basis by unfolding the jet spectra for different event plane orientations independently. Significant non-zero nu(ch)(2) (jet) is observed in semi-central collisions (30-50% centrality) for 20 <p(T)(ch) (jet) <90 GeV/c. The azimuthal dependence of the charged jet production is similar to the dependence observed for jets comprising both charged and neutral fragments, and compatible with measurements of the nu(2) of single charged particles at high p(T). Good agreement between the data and predictions from JEWEL, an event generator simulating parton shower evolution in the presence of a dense QCD medium, is found in semi-central collisions. (C) 2015 CERN for the benefit of the ALICE Collaboration. Published by Elsevier B.V. This is an open access article under the CC BY license (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).Peer reviewe