Ethnomathematical research and drama in education techniques: developing a dialogue in a geometry class of 10th grade students

Ethnomathematical research, together with digital technologies (WebQuest) and Drama-in- Education (DiE) techniques, can create a fruitful learning environment in a mathematics classroom—a hybrid/third space—enabling increased student participation and higher levels of cognitive engagement. This article examines how ethnomathematical ideas processed within the experiential environment established by the Drama-in-Education techniques challenged students‘ conceptions of the nature of mathematics, the ways in which students engaged with mathematics learning using mind and body, and the ̳dialogue‘ that was developed between the Discourse situated in a particular practice and the classroom Discourse of mathematics teaching. The analysis focuses on an interdisciplinary project based on an ethnomathematical study of a designing tradition carried out by the researchers themselves, involving a search for informal mathematics and the connections with context and culture; 10th grade students in a public school in Athens were introduced to the mathematics content via an original WebQuest based on this previous ethnomathematical study; Geometry content was further introduced and mediated using the Drama-in-Education (DiE) techniques. Students contributed in an unfolding dialogue between formal and informal knowledge, renegotiating both mathematical concepts and their perception of mathematics as a discipline

Complete Mouth Rehabilitation and Gastroesophageal Reflux Disease: Conventional and Contemporary Treatment Approaches

This report describes the diagnosis and prosthodontic management of 2 patients with a history of chronic gastroesophageal reflux disease and worn dentition. Different treatment approaches were used for oral rehabilitation. Use of conventional and contemporary restorative materials resulted in functional and esthetic prosthodontic rehabilitation with a favorable prognosis. Gastroesophageal reflux disease (GERD) is a “condition which develops when the reflux of stomach contents causes troublesome symptoms and/or complications. Reflux episodes can be intensified by dietary habits, smoking, physical exercise, and obstructive sleep apnea.Complications of GERD are regurgitation, chest pain, esophagitis, Barrett’s esophagus, esophageal adenocarcinoma, cough, asthma, and dental erosion.GERD is associated with dental erosion and sleep bruxism,and dental erosion may be the only symptom of GERD. The purpose of this report was to present the oral diagnosis and management of 2 patients with chronic GERD who presented with tooth wear and required complete mouth rehabilitation. The restoration of dentition was achieved by following different treatment modalities

Ανίχνευση διαταραχών συμπεριφοράς σε ασθενείς µε άνοια µέσω του Frontal System Behavior Scale (FrSBE)

Ο σχεδιασμός της προτεινόμενης μελέτης αποτέλεσε µία προσπάθεια να ανιχνευθούν πέρα από τα νοητικά ελλείµµατα των ασθενών με Άνοια, πιθανές αλλαγές στη προσωπικότητα και διαταραχές στη συμπεριφορά τους. Το συγκεκριμένο ερώτημα διερευνήθηκε µέσω του ερωτηματολογίου Frontal System Behavior Scale (FrSBE), το οποίο χορηγείται για πρώτη φορά σε ελληνικό πληθυσμό. Το συγκεκριμένο ερωτηματολόγιο μελετά επιπτώσεις στη συμπεριφορά και τη λειτουργικότητα του ατόμου µετά από βλάβες σε μετωπιαία - υποφλοιικά κυκλώματα. Συγκεκριμένα πρόκειται για ένα ερωτηματολόγιο που αποτελείται από 46 ερωτήματα και υποδιαιρείται σε τρεις υποκλίμακες που αφορούν την απάθεια, την άρση αναστολών και το δυσεπιτελικό σύνδρομο. Στη πρόσφατη βιβλιογραφία γίνεται μια προσπάθεια αναθεώρησης του ερωτηματολογίου και προτείνεται μια σύντομη εκδοχή αυτού, από την οποία έχουν αφαιρεθεί 8 ερωτήματα ( 3 ερωτήματα από την υποκλίµακα της απάθειας, 3 ερωτήματα από την υποκλίµακα της άρσης αναστολών και 2 ερωτήματα από την υποκλίµακα του δυσεπιτελικού συνδρόμου). Επομένως, ακολουθώντας τη πρόσφατη βιβλιογραφία στη παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκαν δύο μετρήσεις, μία με κάθε εκδοχή αντίστοιχα, ώστε να γίνει μία σύγκριση και να εκτιμηθεί η εγκυρότητα της κάθε εκδοχής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η σύντομη εκδοχή είναι εξίσου έγκυρη με τη πρωτότυπη. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να εκτιμηθεί η διακριτική ικανότητα του ερωτηματολογίου, ενώ ως δευτερεύουσα υπόθεση να πραγματοποιηθεί σύγκριση των επιδόσεων μεταξύ των κλινικών ομάδων και φυσιολογικών μαρτύρων στις υποκλίμακες του FrSBE. Τα αποτελέσματα έδειξαν, πως το ερωτηματολόγιο έχει αρκετά καλή διακριτική ικανότητα τόσο στη συνολική βαθμολογία, όσο και στην κάθε επιμέρους υποκλίµακα ξεχωριστά. Το γεγονός αυτό επιτρέπει τη χρήση διαχωριστικών ορίων(cut offs). Συγκεκριμένα, για τη συνολική βαθμολόγια στη πρωτότυπη εκδοχή ως διαχωριστικό όριο ορίστηκε το 103,5 ( ευαισθησία 81%, ειδικότητα 79,6 %) , ενώ στη σύντομη εκδοχή το 81,5( ευαισθησία 84% , ειδικότητα 34 77,8 %) .Όσον αφορά στην υποκλίµακα της απάθειας στη πρωτότυπη εκδοχή του ερωτηματολογίου εκτιμήθηκε ως διαχωριστικό όριο το 33,5( ευαισθησία 77,9 % , ειδικότητα 70,4 %) , ενώ στη σύντομη το 26,5( ευαισθησία 81,6% , ειδικότητα 74,1 %) .Στην υποκλίμακα του δυσεπιτελικού συνδρόμου τα διαχωριστικά όρια που εκτιμήθηκαν είναι 41,5 ( ευαισθησία 86,3 % , ειδικότητα 81,5 %) και 31,5 (ευαισθησία 85,8% , ειδικότητα 81,5 %) για τη παλιά και τη καινούργια εκδοχή αντίστοιχα. Τέλος, στη υποκλίμακα της άρσης αναστολών τα διαχωριστικά όρια αξιολογήθηκαν ικανοποιητικά , αλλά σε μικρότερο βαθμό συγκριτικά με τις άλλες δύο υποκλίμακες και τη συνολική βαθμολογία. Συγκεκριμένα, ως διαχωριστικά όρια εκτιμήθηκαν το 27,50 ( ευαισθησία 66,3% , ειδικότητα 61,1 %) και το 22,5 ( ευαισθησία 67,4 %, ειδικότητα 70,4 %) για τη παλιά και καινούργια εκδοχή αντίστοιχα. Όσον αφορά τη δεύτερη υπόθεση , όπως ήταν αναμενόμενο οι ασθενείς με άνοια σημείωσαν υψηλότερη βαθμολογία σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Επίσης, διαφορές παρατηρήθηκαν ως προς την επίδοση μεταξύ των ασθενών με διαφορετική διαταραχή άνοιας, τη μετωποκροταφική άνοια και την άνοια Alzheimer. Επομένως, με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας έρευνας φαίνεται ότι το ερωτηματολόγιο FrSBE συνιστά ένα ιδιαίτερα χρήσιμο εργαλείο στη κλινική πράξη.The purpose of this study was to examine except from cognitive deficits behavioral disturbances in patients with dementia by using the Frontal Systems Behavior Scale (FrSBe) for the first time in Greek population. To be more specific The Frontal Systems Behavior Scale (FrSBe) is a 46-item behavior rating scale that is intended to measure behavior associated with damage to the cortical and subcortical frontal systems of the brain, with subscales measuring Apathy, Disinhibition and Executive Dysfunction .In addition according to recent studies a better fit model removed 8 items has been proposed (3 items from apathy scale, 3items from disinhibition and 2 items from executive dysfunction).Therefore , in this study have been completed two measurements, one with original version and another one with the reduced version. The results indicated strong validity in both versions. Purpose of the current study was to evaluate the cut offs score of FrSbe and as a second hypothesis was to compare the performances between Frontotemporal dementia (FTD) patients, Alzheimer(AD) patients and normal subjectives to scales of FrSBe. The results have demonstrated quite satisfied cut offs for both versions. To be more specific, for total score in the original version the cut off was the 103,5 ( sensitivity 81%, specificity 79,6 %) and for reduced version 81,5( sensitivity 84% , specificity 77,8 %) .What is more, at apathy scale at the original version the cut off was 33,5(sensitivity77,9 % , specificity 70,4 %) and for reduced version the cut off was 26,5( sensitivity 81,6% , specificity74,1 %).With regard to executive dysfunction scale the cut off was 41,5 ( sensitivity 86,3 % , specificity 81,5 %) and 31,5 (sensitivity 85,8% , specificity 81,5 %), for original and reduced version respectively. Finally, for disinhinbition scale the cut off for the original model was 27,50 ( sensitivity 66,3% , specificity 61,1 %) and the 22,5 ( sensitivity 67,4 %, specificity 70,4 %) for the reduced model respectively. Refers to second hypothesis the results indicated differences at performances between dementia patients and healthy subjects. Furthermore, differences at performances have been noticed between AD and FTD patients

Porphyromonas gingivalis induce apoptosis in human gingival epithelial cells through a gingipain-dependent mechanism

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The oral pathogen <it>Porphyromonas gingivalis </it>has been shown to modulate apoptosis in different cell types, but its effect on epithelial cells remains unclear.</p> <p>Results</p> <p>We demonstrate that primary human gingival epithelial cells (HGECs) challenged with live <it>P. gingivalis </it>for 24 hours exhibit apoptosis, and we characterize this by M30 epitope detection, caspase-3 activity, DNA fragmentation and Annexin-V staining. Live bacteria strongly upregulated intrinsic and extrinsic apoptotic pathways. Pro-apoptotic molecules such as caspase-3, -8, -9, Bid and Bax were upregulated after 24 hours. The anti-apoptotic Bcl-2 was also upregulated, but this was not sufficient to ensure cell survival. The main <it>P. gingivalis </it>proteases arginine and lysine gingipains are necessary and sufficient to induce host cell apoptosis. Thus, live <it>P. gingivalis </it>can invoke gingival epithelial cell apoptosis in a time and dose dependent manner with significant apoptosis occurring between 12 and 24 hours of challenge via a gingipain-dependent mechanism.</p> <p>Conclusion</p> <p>The present study provides evidence that live, but not heat-killed, <it>P. gingivalis </it>can induce apoptosis after 24 hours of challenge in primary human gingival epithelial cells. Either arginine or lysine gingipains are necessary and sufficient factors in <it>P. gingivalis </it>elicited apoptosis.</p

In vitro modeling of host-parasite interactions: the 'subgingival' biofilm challenge of primary human epithelial cells

BACKGROUND: Microbial biofilms are known to cause an increasing number of chronic inflammatory and infectious conditions. A classical example is chronic periodontal disease, a condition initiated by the subgingival dental plaque biofilm on gingival epithelial tissues. We describe here a new model that permits the examination of interactions between the bacterial biofilm and host cells in general. We use primary human gingival epithelial cells (HGEC) and an in vitro grown biofilm, comprising nine frequently studied and representative subgingival plaque bacteria. RESULTS: We describe the growth of a mature 'subgingival' in vitro biofilm, its composition during development, its ability to adapt to aerobic conditions and how we expose in vitro a HGEC monolayer to this biofilm.Challenging the host derived HGEC with the biofilm invoked apoptosis in the epithelial cells, triggered release of pro-inflammatory cytokines and in parallel induced rapid degradation of the cytokines by biofilm-generated enzymes. CONCLUSION: We developed an experimental in vitro model to study processes taking place in the gingival crevice during the initiation of inflammation. The new model takes into account that the microbial challenge derives from a biofilm community and not from planktonically cultured bacterial strains. It will facilitate easily the introduction of additional host cells such as neutrophils for future biofilm:host cell challenge studies. Our methodology may generate particular interest, as it should be widely applicable to other biofilm-related chronic inflammatory diseases

Gut bacteriome analysis of Anastrepha fraterculus sp. 1 during the early steps of laboratory colonization

Microbial communities associated to insect species are involved in essential biological functions such as host nutrition, reproduction and survivability. Main factors have been described as modulators of gut bacterial community, such as diet, habit, developmental stage and taxonomy of the host. The present work focuses on the complex changes that gut microbial communities go through when wild insects are introduced to artificial rearing conditions. Specifically, we analyzed the effect of the laboratory colonization on the richness and diversity of the gut bacteriome hosted by the fruit fly pest Anastrepha fraterculus sp. 1. Bacterial profiles were studied by amplicon sequencing of the 16S rRNA V3–V4 hypervariable region in gut samples of males and females, in teneral (1-day-old, unfed) and post-teneral (15-day-old, fed) flies. A total of 3,147,665 sequence reads were obtained and 32 bacterial operational taxonomic units (OTUs) were identified. Proteobacteria was the most abundant phylum (93.3% of the total reads) and, Wolbachia and Enterobacter were the most represented taxa at the genus level (29.9% and 27.7%, respectively, of the total read counts). Wild and laboratory flies showed highly significant differences in the relative abundances of bacteria. The analysis of the core bacteriome showed the presence of five OTUs in all samples grouped by origin, while nine and five OTUs were exclusively detected in laboratory and wild flies, respectively. Irrespective of fly origin or sex, a dominant presence of Wolbachia was observed in teneral flies, whereas Enterobacter was highly abundant in post-teneral individuals. We evidenced significant differences in bacterial richness and diversity among generations under laboratory colonization (F0, F1, F3 and F6) and compared to laboratory and wild flies, displaying also differential patterns between teneral and post-teneral flies. Laboratory and wild A. fraterculus sp. 1 harbor different gut bacterial communities. Laboratory colonization has an important effect on the microbiota, most likely associated to the combined effects of insect physiology and environmental conditions (e.g., diet and colony management).Instituto de GenéticaFil: Salgueiro, Julieta. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética. Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Pimper, Lidia Elena. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética. Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Segura, Diego Fernando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética. Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Milla, Fabian Horacio. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética. Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Russo, Romina María. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética. Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Asimakis, Elias D. University of Patras. Department of Environmental Engineering; GreciaFil: Stathopoulou, Panagiota. University of Patras. Department of Environmental Engineering; GreciaFil: Bourtzis, Kostas. Vienna International Centre. Joint FAO/IAEA Division of Nuclear Techniques in Food and Agriculture. Insect Pest Control Laboratory; AustriaFil: Cladera, Jorge Luis. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética. Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Tsiamis, George. University of Patras. Department of Environmental Engineering; GreciaFil: Lanzavecchia, Silvia Beatriz. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética "Ewald A. Favret". Laboratorio de Genética de Insectos de Importancia Económica; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

New genetic loci link adipose and insulin biology to body fat distribution.

Body fat distribution is a heritable trait and a well-established predictor of adverse metabolic outcomes, independent of overall adiposity. To increase our understanding of the genetic basis of body fat distribution and its molecular links to cardiometabolic traits, here we conduct genome-wide association meta-analyses of traits related to waist and hip circumferences in up to 224,459 individuals. We identify 49 loci (33 new) associated with waist-to-hip ratio adjusted for body mass index (BMI), and an additional 19 loci newly associated with related waist and hip circumference measures (P < 5 × 10(-8)). In total, 20 of the 49 waist-to-hip ratio adjusted for BMI loci show significant sexual dimorphism, 19 of which display a stronger effect in women. The identified loci were enriched for genes expressed in adipose tissue and for putative regulatory elements in adipocytes. Pathway analyses implicated adipogenesis, angiogenesis, transcriptional regulation and insulin resistance as processes affecting fat distribution, providing insight into potential pathophysiological mechanisms

Biosynthesis of hydrolytic enzymes from thermophilic microorganisms

The ability of microorganisms to grow or thrive in a large variety of environmental conditions reflects their unique structural and metabolic characteristics. The observation and subsequent exploitation of extraordinary microbial, genetic or functional diversity may be the solution to different environmental and industrial problems. Enzyme bioprospecting is a research activity devoted to the search of novel, versatile and efficient biocatalysts and has increased recently the market potential of enzymes. A general biotechnological perspective recognizes thermostabilitity as a desirable feature of the biocatalyst, in order to participate in remarkable and unusual bioprocesses. Consequently, thermophiles are microorganisms of interest for enzyme bioprospecting activities due to their habitat-related characteristics. In the present PhD Thesis, a collection of 101 thermophilic bacterial strains were used as biological source of hydrolytic enzymes. These strains have been isolated from different ecological niches around Santorini volcano during the study of the prokaryotic diversity of the volcanic island (Meintanis Christos, PhD Thesis, 2005). All the 101 bacterial strains were able to grow at high temperatures (60 ⁰C) and regarding their BOX PCR fingerprinting, they were discriminated into 3 large groups. Primarily, the cellulose and xylan potential of 101 thermophilic bacterial isolates was thoroughly evaluated. 80 % of the strains showed xylanolytic activity in plate assays and among these 8 % exhibited simultaneously activity towards cellulose hydrolysis (SP17, SP24, SP37, SP38, SP45, SP46, SP47, SP50). The latter strains, along with additional seven (SP8, SP11, SP59, SP68, SP69, SP74, SP87), that showed the highest xylanolytic levels, were selected for further studies. The phenotypic and genotypic characterization (16S rDNA) of the fifteen selected isolates revealed phylogenetic similarity with the genus Geobacillus and followed by the assessment of the enzymatic profile in liquid cultures using various carbon sources. Wheat bran proved to be an efficient inducer for both cellulase and xylanase production by the majority of the selected thermophilic bacilli. Strain SP24 was further selected for its ability to produce elevated levels of cellulase, xylanase, β-glucosidase and β-xylosidase and was chosen as a representative strain in order to study the physiology of expression of the biomass degrading enzymes. More precisely, the research included the examination of the effect of additional carbon/nitrogen sources as a supplement to wheat bran on enzyme biosynthesis in a series of shake flasks, followed by the study of the effect of aeration conditions in microorganism growth and enzyme production in a series of bioreactor experiments and also, the localization of all enzyme activities in all SP24 cultures. Maximum enzyme production by this strain was obtained using a combination of wheat bran (basic carbon source) and birchwood xylan (supplement) in the growth medium. Additional, aeration levels had a very profound positive effect on viable growth since it affected, both the maximum determined biomass concentration as well as the growth rate. The production of all biomass degrading enzymes was growth associated since it followed more or less the cells’ concentration. Cellulase, xylanase and β-xylosidase production was enhanced at high aeration levels while the biosynthesis of β-glucosidase was strongly inhibited. The cellulase and xylanase activity was localized extracellularly, in agreement with the inability of cellulose and xylan (natural substrates) to penetrate the cell wall and membrane. An interesting observation was the effect of aeration levels in secretion rate of both cellulase and xylanase. At the highest aeration level the corresponding activities were 100 % extracellularly detected, following the faster bacterial growth. On the contrary, β-glucosidase and xylosidase appeared as cell-bound enzymes with most of their activity being detected at the cytosolic cell-bound fraction during the early stages of growth. At the latter stages of growth, the activity of both glucosidases was localized at the culture supernatant, probably as a result of partial autolysis of the cells. All the above data yielded enzyme mixtures suitable for various biotechnological and research applications. Moreover, the amplification of cellulase and xylanase genes, using the genomic DNA of the selected strain as a template, allows the cloning and overexpression of the corresponding genes in mesophilic hosts in the future. The second part of the present PhD Thesis, included the evaluation of the lipolytic potential of the same collection of 101 thermophilic bacteria. The ability of isolated bacteria to produce lipase was determined on both solid and liquid cultures with olive oil as sole carbon source. This screening resulted in the selection of 9 strains (SP14, SP22, SP29, SP73, SP75, SP76, SP79, SP83 και SP93) capable to produce elevated levels of lipases. None of the above lipolytic bacteria was chosen for its xylanolytic or cellulolytic activity. The phenotypic and genotypic identification (16S rDNA) of the nine selected isolates classified them close to the genus Geobacillus. Subsequently, the lipolytic strains were cultured in liquid and solid media using different carbon sources. The assessment of the lipolytic profile showed that the enzyme production was not constant and the best inducers were tributyrin and Tween 20 in the majority of the selected strains. In order to determine the optimum pH and T as well as thermal stabilities of the lipolytic activities in their culture supernatants, the lipolytic strains were grown in liquid cultures. All the enzymes revealed optimal lipolytic activity at 80-100 oC, pH 8-9 and increased thermostability. Nevertheless, the low protein expression level did not allow the enzyme purification from the supernatant of the wild type bacterial cultures. The secreted lipase from strain SP22 had the most desirable biotechnological features and the genomic DNA of this strain was the template for gene amplification. The PCR primers for lipase gene amplification were designed based on conserved DNA sequences of reported lipases from the genus Geobacillus and the corresponding gene was amplified (1251 b.p) and fully sequenced (GenBank JN711121) after cloning in pBluescript SK(+) vector. The lipase gene codes for a mature lipase of 416 amino acid residues, corresponding to a molecular weight of 46 kDa. As in other Bacillus lipases, an Ala replaces the first Gly in the conserved pentapeptide Gly-X-Ser-X-Gly found in most lipases. Sub-cloning of the lipase orf into pET-15b vector and subsequent transformation into E. coli host cells (DH5a, BL21(DE3) and BL21(DE3)pLysS) resulted in low expression levels probably due to the formation of inclusion bodies resulting from the highly hydrophobic nature of the enzyme, the high isoelectric point of the protein or some required posttranslational modifications (improper folding). Following these results, we attempted for the first time in literature, the overexpression of a thermostable bacterial lipase in baculovirus-infected insect cells (flashBACTM expression system). The recombinant lipase was secreted as a highly active enzyme at yields, under optimized conditions (MOI, time course), 10000- and 5000-fold higher than the wild type strain and the heterologous bacterial system, respectively, while the corresponding specific activities were among the highest reported for a lipase gene. The next step was the purification of the overexpressed lipase from the insect cell culture supernatant in a single chromatographic step (Q-Sepharose Fast Flow) using buffers containing Triton X-100 and gum arabic (emulsion). The recombinant lipase had an optimum temperature and pH of 65 oC and pH 9, respectively and it was stable up to 65 oC at pH 7 and active over a wide pH range (pH 6-11). Moreover, the purified enzyme exhibited stability towards various organic solvents and detergents but it was completely inhibited in the presence of SDS. The lipase activity was promoted in the presence of Ca2+ and was strongly inhibited by EDTA. With respect to substrate specificity, the lipolytic enzyme showed high affinity towards pNPC (C8) but elevated reaction rate towards pNPP (C16) and was more efficient in the hydrolysis of pNPL (C12). Finally, the lipase activity was investigated in esterification reactions using the ionic liquids 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate or hexafluorophosphate as reaction media and tyrosol as substrate. The synthesis of tyrosyl lipophilic derivatives is rising lately as a response to the food, cosmetic and pharmaceutical industries' increasing demand for new lipophilic antioxidants. The thermostable recombinant lipase was able to catalyze the esterification of tyrosol with vinyl butyrate. The nature of the ionic liquid and the enzyme condition (lyophilized or immobilized) affected the yield of product. The immobilization of the lipase on Celite increased the reaction rate about 30 % probably due to the higher stability of the enzyme and these yields are comparable with different commercial formulations.Η ικανότητα των μικροοργανισμών να επιβιώνουν σε μεγάλη ποικιλία αβιοτικών παραγόντων αντανακλά τα ιδιαίτερα δομικά και μεταβολικά χαρακτηριστικά τους. Η συστηματική καταγραφή και αξιοποίηση της μικροβιακής γενετικής και λειτουργικής ποικιλότητας ακραίων ενδιαιτημάτων ενδέχεται να δώσει λύσεις σε περιβαλλοντικά και βιομηχανικά προβλήματα. Αναφορικά με τις βιοτεχνολογικές εφαρμογές της ενζυμικής κατάλυσης, η ανάγκη εξεύρεσης ποικιλόμορφων, αποδοτικών και σταθερών βιοκαταλυτών για συμμετοχή σε μη συμβατικές συνθήκες διεργασιών, έστρεψε το ενδιαφέρον στη μελέτη του μεταβολικού δυναμικού των θερμόφιλων μικροοργανισμών. Στην παρούσα Διδακτορική Διατριβή χρησιμοποιήθηκε ως βιολογική πηγή υδρολυτικών ενζύμων ένα σύνολο 101 θερμόφιλων βακτηριακών στελεχών που είχαν απομονωθεί κατά τη Διδακτορική Διατριβή του Μεΐντάνη Χ. (2005) στο Εργαστήριο Μικροβιολογίας, του Τομέα Βοτανικής, του Τμήματος Βιολογίας Πανεπιστημίου Αθηνών κατά τη διάρκεια μελέτης της συστηματικής καταγραφής και ποικιλότητας επιλεγμένων οικοθέσεων του ηφαιστειακού συμπλέγματος της Σαντορίνης. Τα στελέχη αυτά, στην πλειοψηφία τους εμφάνισαν φυλογενετική συγγένεια με το γένος Geobacillus και ομαδοποιήθηκαν με βάση το αποτύπωμα BOX PCR τους σε 3 ομάδες. Αρχικά, εκτιμήθηκε ποιοτικά το κυτταρινολυτικό και ξυλανολυτικό δυναμικό του συνόλου των θερμόφιλων μικροοργανισμών από το οποίο προέκυψε ένα υψηλό ποσοστό βακτηρίων με ανιχνεύσιμη ενεργότητα ξυλανάσης (80 %) ενώ μόλις το 8 % παρουσίασε ικανότητα ταυτόχρονης υδρόλυσης κυτταρίνης και ξυλάνης. Για την περαιτέρω μελέτη, επιλέχθηκαν 8 στελέχη που εμφάνισαν ταυτόχρονη κυτταρινολυτική και ξυλανολυτική δράση (SP17, SP24, SP37, SP38, SP45, SP46, SP47, SP50) καθώς και επιπλέον 7 με τις υψηλότερες σχετικές ενεργότητες ξυλανάσης (SP8, SP11, SP59, SP68, SP69, SP74, SP87). Ακολούθησε ο φαινοτυπικός και γενετικός χαρακτηρισμός των επιλεγμένων στελεχών καθώς και ο ποσοτικός προσδιορισμός της υδρολυτικής τους ικανότητας σε καλλιέργειες διαφορετικών πηγών άνθρακα. Το στέλεχος SP24 (κωδικός NCBI-JN692241) εμφάνισε ταυτόχρονη έκκριση ένδο- ξυλανάσης και κυτταρινάσης καθώς και β-ξυλοζιδάσης και β-γλυκοζιδάσης σε ικανοποιητικά επίπεδα, παρουσία πιτύρου σίτου, και επιλέχθηκε για περαιτέρω μελέτη της βιοσύνθεσης των κυτταρινολυτικών και ξυλανολυτικών του ενζύμων. Αναλυτικότερα, μελετήθηκε η επίδραση μικρής ποσότητας συμπληρωματικών πηγών άνθρακα και αζώτου στην ενζυμική επαγωγή υγρών καλλιέργειών του επιλεγμένου στελέχους SP24, καθώς επίσης και η επίδραση της παροχής οξυγόνου στο ρυθμό μικροβιακής αύξησης και της ενζυμικής βιοσύνθεσης. Επιπλέον μελετήθηκε η κυτταρική τοπολογία των ξυλανολυτικών και κυτταρινολυτικών ενζύμων. Αναφορικά με τη βελτιστοποίηση του μέσου αύξησης, η μέγιστη ενζυμική συμπαραγωγή παρατηρήθηκε παρουσία πιτύρου σίτου ως βασική πηγή άνθρακα και συμπληρωματική πηγή την ξυλάνη σημύδας, μειώνοντας το κόστος της διεργασίας. Τα υψηλά επίπεδα αερισμού της καλλιέργειας ήταν καθοριστικός παράγοντας για τον ταχύ μικροβιακό ρυθμό αύξησης και την ενζυμική βιοσύνθεση εκτός από την περίπτωση της β-γλυκοζιδάσης η οποία εμφάνισε αντίθετο πρότυπο παραγωγής. Παράλληλα, οι ξυλανάσες και οι κυτταρινάσες, ένζυμα που δρουν σε μεγαλομοριακά υποστρώματα, εντοπίστηκαν εξ ολοκλήρου εκτός του κυττάρου, ενώ οι β-γλυκοζιδικές ενεργότητες εμφανίστηκαν αρχικά στο κυτταρόπλασμα και μόνο στα τελικά στάδια της ζύμωσης ανιχνεύθηκαν εξωκυτταρικά, γεγονός που σχετίστηκε με την αυτόλυση των κυττάρων κατά τη φάση θανάτου. Συμπερασματικά, οι πληροφορίες από τα ανωτέρω αποτελέσματα επιτρέπουν τη μελλοντική αξιοποίηση του υδρολυτικού δυναμικού του επιλεγμένου μικροοργανισμού σε ευρύτερης κλίμακας ζυμώσεις. Συγχρόνως, ο μοριακός εντοπισμός γονιδίων κυτταρινάσης και ξυλανάσης στο γονιδίωμα του στελέχους SP24 επιτρέπει επίσης την υπερέκφραση αυτών σε μεσόφιλα συστήματα. Το δεύτερο μέρος της παρούσας εργασίας αφορούσε στην εκτίμηση του λιπολυτικού δυναμικού των 101 θερμόφιλων βακτηριακών στελεχών και στην επιλογή ενζύμων (και όχι μικροοργανισμών αυτή τη φορά) με βιοτεχνολογικά αξιοποιήσιμες ιδιότητες για την υπερέκφραση αυτών σε μεσόφιλους δέκτες. Ο προσδιορισμός της λιπολυτικής ικανότητας των θερμόφιλων βακτηρίων πραγματοποιήθηκε τόσο ποιοτικά (στερεές καλλιέργειες) όσο και ποσοτικά (υγρές καλλιέργειες) και επιλέχθηκαν 9 στελέχη (SP14, SP22, SP29, SP73, SP75, SP76, SP79, SP83 και SP93) για την υψηλή υδρολυτική τους δράση. Χαρακτηριστικό ήταν, ότι κανένα επιλεγμένο στέλεχος για την αυξημένη λιπολυτική του ικανότητα δεν εμφάνισε αντίστοιχη κυτταρινολυτική ή ξυλανολυτική δράση. Ακολούθησε φαινοτυπικός και γενετικός χαρακτηρισμός των 9 θερμόφιλων βακτηρίων και μελέτη της βιοσύνθεσης λιπασών σε υγρές και στερεές καλλιέργειες διαφορετικών πηγών άνθρακα. Με δεδομένο ότι τα χαμηλά επίπεδα ενζυμικής παραγωγής δεν επέτρεψαν τον πρωτεϊνικό καθαρισμό από καλλιέργεια των στελεχών φυσικού τύπου, η υπερέκφραση των επιθυμητών γονιδίων σε μεσόφιλα συστήματα ήταν ο επόμενος στόχος. Το γονίδιο λιπάσης που επιλέχθηκε για κλωνοποίηση και υπερέκφραση ήταν το προϊόν ενίσχυσης από το γονιδίωμα του στελέχους SP22 (κωδικός NCBI-JQ808133). Η επιλογή βασίστηκε στην αυξημένη σταθερότητα και θερμική αντοχή καθώς και στην αλκαλοφιλία που επέδειξε η αντίστοιχη λιπάση κατά τη μελέτη των χαρακτηριστικών της συγκριτικά με τις υπόλοιπες 8. Η απομόνωση και ανάλυση της αλληλουχίας του επιλεγμένου γονιδίου εμφάνισε ένα ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης 1251 ζ.β και η πρωτοταγής δομή της πρωτεΐνης ανέδειξε το χαρακτηριστικό πενταπεπτίδιο Ala-Χ-Ser-Χ-Gly καθώς και τη σημαντική για το ενεργό κέντρο, τριάδα His - 42, Ser -141 και Asp-345. Τα παραπάνω αποτελούν ιδιαιτερότητες των θερμόφιλων λιπασών (υποοικογένεια I.5) του γένους Bacillus. Αρχικά, η υπερέκφραση του γονιδίου της λιπάσης πραγματοποιήθηκε σε βακτηριακό σύστημα (δεκτικά κύτταρα E.coli) υπό τον έλεγχο του ισχυρού υποκινητή Τ7 (φορέας κλωνοποίησης - pET15b). Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν 3 σειρές ξενιστικών κυττάρων (DH5a, BL21(DE3) και BL21(DE3)pLysS) στις οποίες μελετήθηκε η κινητική έκφρασης της θερμοσταθερής λιπάσης. Η υπερέκφραση της θερμοσταθερής λιπάσης του στελέχους SP22 (Geobacillus sp.) σε προκαρυωτικό σύστημα εμφάνισε προβλήματα, καθότι σε συνθήκες υψηλής παραγωγής οδήγησε στον σχηματισμό αδιάλυτων συσσωματωμάτων για τα οποία ενδεχομένως ευθύνονται τα βασικά φυσικοχημικά χαρακτηριστικά του μορίου όπως η υδροφοβικότητα, το υψηλό ισοηλεκτρικό του ή κάποια απαιτούμενη μεταμεταφραστική τροποποίηση. Η ανάγκη εύρεσης ενός πιο αποδοτικού συστήματος υπερέκφρασης της θερμοσταθερής λιπάσης οδήγησε στην επιλογή του flashBAC™. Αξίζει να αναφερθεί ότι το σύστημα αυτό ουδέποτε έχει χρησιμοποιηθεί για την υπερέκφραση βακτηριακής λιπάσης παρά μόνο σε ορισμένες περιπτώσεις ευκαρυωτικών γονιδίων λιπάσης. Επίσης, οι αναφορές έκφρασης θερμοσταθερών πρωτεϊνών μέσω των βακυλοϊών στη διεθνή βιβλιογραφία είναι ελάχιστες και μάλιστα όχι από βακτήρια. Η υπερέκφραση της λιπάσης με το σύστημα flashBAC™ οδήγησε σε εξαιρετικά υψηλές τιμές ειδικής ενζυμικής ενεργότητας καθώς επίσης και στην ολοκληρωτική εμφάνιση της πρωτεΐνης σε διαλυτή μορφή. Αναλυτικότερα, τα επίπεδα ειδικής ενζυμικής ενεργότητας εμφανίστηκαν έως και 10000 φορές υψηλότερα από το στέλεχος φυσικού τύπου και ενισχυμένα κατά 5000 φορές συγκριτικά με το ετερόλογο προκαρυωτικό σύστημα έκφρασης. Ακολούθησε η αριστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας μολυσμένων Sf9 κυττάρων και παραγωγής του ενζύμου και ο καθαρισμός της υπερεκφρασμένης λιπάσης από το εξωκυττάριο υγρό με ένα μόνο χρωματογραφικό βήμα. Η θερμοσταθερή λιπάση παρελήφθη σε ηλεκτροφορητικά καθαρή μορφή (46 kDa) και στη συνέχεια χαρακτηρίστηκε φυσικοχημικά και κινητικά. Εμφάνισε αυξημένη θερμοσταθερότητα έως τους 65 oC (άριστη θερμοκρασία δράσης), σχεδόν χωρίς καμία απώλεια ενεργότητας, και η κινητική θερμικής απενεργοποίησης του ενζύμου ήταν 2 τάξεων. Όσον αφορά στο pH, η λιπάση εμφανίστηκε αρκετά σταθερή σε ένα ευρύ φάσμα τιμών και ως άριστη τιμή δράσης ήταν το 9. Επίσης, το ένζυμο επέδειξε σταθερότητα παρουσία διαφορετικών οργανικών διαλυτών ενώ το ασβέστιο φάνηκε να ενισχύει τη λιπολυτική ενεργότητα. Η εξάρτηση του ενζύμου από το ασβέστιο εμφανίστηκε και στην ολοκληρωτική απώλεια δράσης του παρουσία του χηλικού παράγοντα EDTA (μεταλλοένζυμο). Ολοκληρώνοντας τον χαρακτηρισμό της λιπάσης, μελετήθηκε η δράση της έναντι ψευδοϋποστρωμάτων με λιπαρά οξέα διαφορετικών αλυσίδων. Η λιπάση εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια με το καπρυλικό οξύ (8 άτομα άνθρακα) και μεγαλύτερη ταχύτητα αντίδρασης στη διάσπαση εστέρων με παλμιτικό οξύ (16 άτομα άνθρακα). Ωστόσο, η μεγαλύτερη αποδοτικότητα του μορίου εντοπίστηκε κατά την υδρόλυση του ψευδοϋποστρώματος με λαυρικό οξύ (12 άτομα άνθρακα). Τέλος, διαπιστώθηκε η ικανότητα της θερμοσταθερής λιπάσης να καταλύει την αντίδραση εστεροποίησης της τυροσόλης παρουσία ιοντικών υγρών. Τα λιπόφιλα παράγωγα της τυροσόλης εμφανίζουν πλήθος εφαρμογών στο πεδίο των φαρμάκων ή των προϊόντων αντιγήρανσης. Η απόδοση της αντίδρασης εστεροποίησης από την υπερεκφρασμένη λιπάση εμφάνισε εξάρτηση τόσο με τη φύση του ιοντικού υγρού όσο και με την κατάσταση του ενζυμικού δείγματος (λυοφιλιωμένο ή ακινητοποιημένη λιπάση σε Celite). Η ακινητοποίηση του ενζύμου σε αδρανή φορέα αύξησε κατά 30 % την απόδοση της βιοκατάλυσης συγκριτικά με το λυοφιλιωμένο ένζυμο και η ικανότητα αυτή είναι ανάλογη με διάφορα εμπορικά σκευάσματα

Unraveling the Lipolytic Activity of Thermophilic Bacteria Isolated from a Volcanic Environment

In a bioprospecting effort towards novel thermostable lipases, we assessed the lipolytic profile of 101 bacterial strains isolated from the volcanic area of Santorini, Aegean Sea, Greece. Screening of lipase activity was performed both in agar plates and liquid cultures using olive oil as carbon source. Significant differences were observed between the two screening methods with no clear correlation between them. While the percentage of lipase producing strains identified in agar plates was only 17%, lipolytic activity in liquid culture supernatants was detected for 74% of them. Nine strains exhibiting elevated extracellular lipase activities were selected for lipase production and biochemical characterization. The majority of lipase producers revealed high phylogenetic similarity with Geobacillus species and related genera, whilst one of them was identified as Aneurinibacillus sp. Lipase biosynthesis strongly depended on the carbon source that supplemented the culture medium. Olive oil induced lipase production in all strains, but maximum enzyme yields for some of the strains were also obtained with Tween-80, mineral oil, and glycerol. Partially purified lipases revealed optimal activity at 70–80°C and pH 8-9. Extensive thermal stability studies revealed marked thermostability for the majority of the lipases as well as a two-step thermal deactivation pattern

Minos as a novel Tc1/mariner-type transposable element for functional genomic analysis in Aspergillus nidulans.

International audienceTransposons constitute powerful genetic tools for gene inactivation, exon or promoter trapping and genome analyses. The Minos element from Drosophila hydei, a Tc1/mariner-like transposon, has proved as a very efficient tool for heterologous transposition in several metazoa. In filamentous fungi, only a handful of fungal-specific transposable elements have been exploited as genetic tools, with the impala Tc1/mariner element from Fusarium oxysporum being the most successful. Here, we developed a two-component transposition system to manipulate Minos transposition in Aspergillus nidulans (AnMinos). Our system allows direct selection of transposition events based on re-activation of niaD, a gene necessary for growth on nitrate as a nitrogen source. On average, among 10(8) conidiospores, we obtain up to ∼0.8×10(2) transposition events leading to the expected revertant phenotype (niaD(+)), while ∼16% of excision events lead to AnMinos loss. Characterized excision footprints consisted of the four terminal bases of the transposon flanked by the TA target duplication and led to no major DNA rearrangements. AnMinos transposition depends on the presence of its homologous transposase. Its frequency was not significantly affected by temperature, UV irradiation or the transcription status of the original integration locus (niaD). Importantly, transposition is dependent on nkuA, encoding an enzyme essential for non-homologous end joining of DNA in double-strand break repair. AnMinos proved to be an efficient tool for functional analysis as it seems to transpose in different genomic loci positions in all chromosomes, including a high proportion of integration events within or close to genes. We have used Minos to obtain morphological and toxic analogue resistant mutants. Interestingly, among morphological mutants some seem to be due to Minos-elicited over-expression of specific genes, rather than gene inactivation