Mecanismos de la sustitución nucleofílica aromática : Efectos Orto

El mecanismo de las reacciones de sustitución nucleofílica aromática (SNA)entre sustratos activados y aminas en solventes apróticos no polares, no ha sido, hasta el momento, debidamente elucidado. Poca atención ha merecido, también, la influencia ejercida por grupos voluminosos vecinos al centro de reacción. Con el doble propósito de investigar a) el mecanismo de estas reacciones en solventes de baja constante dieléctrica y b) el efecto ejercido por sustituyentes con considerables requerimientos estéricos (-NO2; -Br; -CH3) próximos al centro de reacción, se han estudiado en la presente Tesis, las reacciones de 4-R- y 6-R-2-nitroanisoles con diversas aminas tales como:ciclohexilamina, n-butilamina, piperidina y N-metilpiperidina en benceno y/o ciclohexano. La elección de estos sustratos se basó en la caracteristica de nucleófugo pobre del grupo metoxilo, muy poco estudiado además, en solventes no polares. Los nitrofenil-alquil-éteres son particularmente adecuados para investigar la catálisis básica por el nucleófilo en las reacciones de SNA,ya que usualmente en las reacciones de estos compuestos la ruptura del complejo intermediario es el paso determinante de la velocidad. Estas reacciones, sin embargo, no son tan simples debido a un proceso lateral de sustitución nucleofílica alifática (SN2)por el cual se rompe la unión O—metilo de los éteres, lo que conduce a la formación de los fenoles correspondientes. Los sistemas estudiados, son, por lo tanto, apropiados para investigar la competencia entre las reacciones de SNAy SN2. En la presente Tesis se realizó el estudio cinético de 2,4- y 2,6-dinitroanisol con piperidina en benceno a diferentes temperaturas y varias concentraciones de la amina, a fin de determinar la importancia del paso base catalizado en la descomposición del compuestointermediario, como así también, la influencia ejercida por los grupos nitro operando desde las posiciones orto. En la reacción de 2,4-dinitroanisol con piperidina en benceno, los procesos de SNA y SN2 ocurren con velocidades semejantes, siendo la reacción de SNA acelerada suavemente por la amina, lo cual encuadra dentro de los casos de pequeñas aceleraciones descriptos por Bunnett. En la reacción de 2,6-dinitroanisol con piperidina, en cambio, hemos observado en todos los casos que la demetilación es entre 5 y 20 veces más rápida que la reacción de SNA. La velocidad del proceso de SNA para el 2,6-dinitroanisol es alrededor de 10 veces mayor que para el 2,4-dinitroanisol, lo que es interpretado en términos de un aumento de velocidad del paso no catalizado, k2 (ec. 2). Si bien es interesante la mayor reactividad del 2,6- frente al 2,4-dinitroanisol para la SNA, más natorio es el aumento en las velocidades de SN2. Las mediciones cinéticas permiten establecer que las velocidades de demetilación para el isómero 2,6- son 1000 y 300 veces más rápidas, con piperidina y N-metilpiperidina, respectivamente, que las del 2,4-dinitroanisol. Para explicar este fenómenose ha calculado el efecto de campo ejercido por el grupo nitro desde la posición orto. El cálculo de las temperaturas isocinéticas permite concluir que el proceso de sustitución nucleofílica aromática estará favorecido frente al de sustitución alifática, a más bajas temperaturas y a mayores concentraciones de la amina. Esta es una generalización sumamenteútil que permite el control de ambos procesos al planear la sintesis de los productos de SNA a partir de los respectivos anisoles. Por otro lado, trabajando con aminas primarias, los productos de demetilación se detectaron sólo a baja concentración de amina ( <0,1 M), esto es consecuencia de la notable aceleración de las reacciones de SNA al aumentar la concentración de aquélla. Al estudia las reacciones de 2,4- y 2,6-dinitroanisol con ciclohexilamina en benceno hemos encontrado, sorprendentemente, una relación cuadrática, entre la constante de velocidad de segundo orden, kA, y la concentración de base como se muestra en las fig. 5 y 7. Este comportamiento anómalo es irreconciliable con el mecanis moconocido hasta el momento para las reacciones de SNA. Trabajos previos de otros investigadores muestran un comportamiento similar, siempre en solventes apróticos no polares como benceno, tolueno e isooctano. Estos resultados no fueron interpretados mecanisticamente y el apartamiento del comportamiento esperado fue atribuido a un efecto inespecífico del solvente. Sin embargo, si se divide cada constante de velocidad de segundo orden por la concentración de amina, y los cocientes se grafican en función de esta última se observa una dependencia lineal (fig. 6 y 8). Esto indica que se trata de cinéticas de tercer orden respecto de la concentración de la amina. En 1981, Banjoko publicó resultados similares trabajando con 2,4,6-trinitrofenil-fenil-éter y anilina en benceno, y los explicó haciendo intervenir una tercera molécula de amina en el paso base catalizado. Su mecanismo,y las ec. cinéticas derivadas de él, no se ajustan, sin embargo, a nuestros resultados, ya que como puede observarse en las figuras 6; 10 y 12 para las reacciones desarrolladas a 60°C, se obtiene una meseta para altas concentraciones de la amina, lo cual no es predecible por el mecanismo mencionado. Estas y otras evidencias discutidas en la presente Tesis descartan el mecanismo propuesto por Banjoko. Es sabido que en solventes de baja constante dieléctrica, tanto las aminas alifáticas como aromáticas, se encuentran parcialmente auto asociadas formando dimeros. En el Esquema 5 proponemos un mecanismo para las reacciones de SNA donde el dimero de la amina compite con el monómero para llevar a cabo el ataque nucleofIlico. Este mecanismo conduce a ecuaciones cinéticas que se ajustan a las expresiones de velocidad halladas experimentalmente, en la presente Tesis y en otros trabajos de la literatura. A fin de investigar la generalidad del mecanismo propuesto se estudiaron otras reacciones de SNA en donde se varió: el sustrato, el nucleófilo y el solvente. Se realizó el estudio cinético de las reacciones de 2,4- y 2,6 dinitroanisol con n-butilamina en benceno, hallándose resultados que se encuadran dentro del esquema propuesto (fig. lO y ll). Además, en la reacción de 2,4-dinitroanisol se encontró que la velocidad de reacción disminuye al aumentar la temperatura. Este poco común efecto inverso de la temperatura halla su explicación en el mecanismo propuesto, ya que la autoasociación de las aminas decrece con el aumento de la temperatura. Un efecto inverso similar se detectó en las reacciones de ambos dinitroanisoles con ciclohexilamina en ciclohexano (fig. 12Y 13). Según lo determinado por Bernasconi y Zollinger, la reacción de 2,4-dinitrofluorbenceno con p-anisidina en benceno no se ajusta al mecanismo clásico; esto fue interpretado nuevamente en términos de un efecto del medio. La misma, sin embargo, responde al mecanismo propuesto véa el dímero. Se estudió entonces, la reacción de este sustrato con o-anisidina en benceno, a fin de comparar los resultados con los hallados por Bernasconi.En todos los casos se ha hallado que la reacción es de tercer orden respecto de la concentración de o-anisidina. (fig. 20 y 21) El efecto del agregado de una segunda especie básica catalizadora, tal como la piridina, tampoco se ajusta al mecanismo conocido, para la mencionada reacción con p-anisidina. De acuerdo con este me canismo la pendiente de la correlación lineal kA vs.la concentración de piridina,[P] , debe ser independiente de la concentración de anisidina; no obstante,se encontró que ésta aumentaba al aumentar la concentnación de la amina primaria, pero este resultado no fue interpretado por sus autores en términos mecanísticos. En la presente Tesisse estudió también el agregado de piridina en la reacción de 2,4-dinitrofluorbenceno con o-anisidina con el objeto de demostrar que existe una relación lineal entre la pendiente de la correlación kA vs.[P] y la concentración de o-anisidina, tal comolo predice el mecanismo del Esquema 6, donde se hace intervenir al dímero mixto entre ambas amina: como tercera especie nucleofílica. La fig. 23 muestra que existe la dependencia mencionada. Experiencias previas desarrolladas en nuestro laboratorio (J. Chem.Soc. Perkin Trans. II, 1256 (1976)) indicaban que la reacción de 2,4-dinitroanisol y ciclohexilamina en metanol no estaba catalizada por la amina. Resultado que es muy diferente al descripto aqui, trabajando en benceno. Por lo tanto, resultó de gran interés estudiar el comportamiento de este tipo de sistemas en mezclas de benceno metanol. Si se admite la hipótesis de la intervención del dímero en benceno y que en metanol opera el mecanismo clásico, en mezclas va riables de benceno-metanol debe observarse alguna manifestación del cambio de mecanismo, si éste verdaderamente ocurre. En la reacción de 2,6-dinitroanisol con ciclohexilamina se observó un pronunciado descenso de la velocidad de reacción por el agregado de pequeñas cantidades de metanol. Esto está de acuerdo con la disminución en la concentración del dímero de la amina, (la asociación de las moléculas de amina con el metanol es un proceso más favorecido, como se ha probado termodinámica y teóricamente). Luego la velocidad aumenta al aumentar la proporción de metanol siendo el nucleófilo, en esas condiciones, el monómero de la amina. Los efectos de los grupos vecinos al centro de reacción en la SNA han sido objeto sólo de unos pocos estudios sistemáticos. En la presente Tesis se discuten los factores que afectan las velocidades y mecanismos de reacción encuadrados dentro de los llamados Consulte el resumen completo en el documento.Fil: Palleros, Daniel Ricardo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Mitochondrial molecular chaperones

After synthesis in the cytosol, most mitochondrial proteins must traverse mitochondrial membranes to reach their functional location. During this process, proteins become unfolded and then refold to attain their native conformation after crossing the lipid bilayers. Mitochondrial molecular chaperones play an essential mechanistic role at various steps of this process. They facilitate presequence translocation, unfolding of the cytosol-localized domains of precursor proteins, movement across the mitochondrial membranes and, finally, folding of newly imported proteins within the matrix

The chicken–egg scenario of protein folding revisited

AbstractWhat is the first step in protein folding – hydrophobic collapse (compaction) or secondary structure formation? It is still not clear if the major driving force in protein folding is hydrogen bonding or hydrophobic interactions or both. We analyzed data on the conformational characteristics of 41 globular proteins in native and partially folded conformational states. Our analysis shows that a good correlation exists between relative decrease in hydrodynamic volume and increase in secondary structure content. No compact equilibrium intermediates lacking secondary structure, or highly ordered non-compact species, were found. This correlation provides experimental support for the hypothesis that hydrophobic collapse occurs simultaneously with formation of secondary structure in the early stages of the protein folding

The In Vivo Association of BiP with Newly Synthesized Proteins Is Dependent on the Rate and Stability of Folding and Not Simply on the Presence of Sequences That Can Bind to BiP

Immunoglobulin heavy chain-binding protein (BiP) is a member of the hsp70 family of chaperones and one of the most abundant proteins in the ER lumen. It is known to interact transiently with many nascent proteins as they enter the ER and more stably with protein subunits produced in stoichiometric excess or with mutant proteins. However, there also exists a large number of secretory pathway proteins that do not apparently interact with BiP. To begin to understand what controls the likelihood that a nascent protein entering the ER will associate with BiP, we have examined the in vivo folding of a murine λI immunoglobulin (Ig) light chain (LC). This LC is composed of two Ig domains that can fold independent of the other and that each possess multiple potential BiP-binding sequences. To detect BiP binding to the LC during folding, we used BiP ATPase mutants, which bind irreversibly to proteins, as “kinetic traps.” Although both the wild-type and mutant BiP clearly associated with the unoxidized variable region domain, we were unable to detect binding of either BiP protein to the constant region domain. A combination of in vivo and in vitro folding studies revealed that the constant domain folds rapidly and stably even in the absence of an intradomain disulfide bond. Thus, the simple presence of a BiP-binding site on a nascent chain does not ensure that BiP will bind and play a role in its folding. Instead, it appears that the rate and stability of protein folding determines whether or not a particular site is recognized, with BiP preferentially binding to proteins that fold slowly or somewhat unstably

Physiological modulation of BiP activity by trans-protomer engagement of the interdomain linker.

DnaK/Hsp70 chaperones form oligomers of poorly understood structure and functional significance. Site-specific proteolysis and crosslinking were used to probe the architecture of oligomers formed by the endoplasmic reticulum (ER) Hsp70, BiP. These were found to consist of adjacent protomers engaging the interdomain linker of one molecule in the substrate binding site of another, attenuating the chaperone function of oligomeric BiP. Native gel electrophoresis revealed a rapidly-modulated reciprocal relationship between the burden of unfolded proteins and BiP oligomers and slower equilibration between oligomers and inactive, covalently-modified BiP. Lumenal ER calcium depletion caused rapid oligomerization of mammalian BiP and a coincidental diminution in substrate binding, pointing to the relative inertness of the oligomers. Thus, equilibration between inactive oligomers and active monomeric BiP is poised to buffer fluctuations in ER unfolded protein load on a rapid timescale attainable neither by inter-conversion of active and covalently-modified BiP nor by the conventional unfolded protein response.Supported by grants from the Wellcome Trust (Wellcome 084812/Z/08/Z) the European Commission (EU FP7 Beta-Bat No: 277713), a Wellcome Trust Strategic Award for core facilities to the Cambridge Institute for Medical Research (Wellcome 100140) and a US Public Health Service grant NIH-GM54068 (to LH). DR is a Wellcome Trust Principal Research Fellow.This is the final version of the article. It first appeared from eLife via http://dx.doi.org/10.7554/eLife.0896

Microwave assisted solvent free synthesis of 1,3-diphenylpropenones

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>1,3-Diphenylpropenones (chalcones) are well known for their diverse array of bioactivities. Hydroxyl group substituted chalcones are the main precursor in the synthesis of flavonoids. Till date various methods have been developed for the synthesis of these very interesting molecules. Continuing our efforts for the development of simple, eco-friendly and cost-effective methodologies, we report here a solvent free condensation of aryl ketones and aldehydes using iodine impregnated alumina under microwave activation. This new protocol has been applied to a variety of substituted aryl carbonyls with excellent yield of substituted 1,3-diphenylpropenones.</p> <p>Results</p> <p>Differently substituted chalcones were synthesized using iodine impregnated neutral alumina as catalyst in 79-95% yield in less than 2 minutes time under microwave activation without using any solvent. The reaction was studied under different catalytic conditions and it was found that molecular iodine supported over neutral alumina gives the best yield. The otherwise difficult single step condensation of hydroxy substituted aryl carbonyls is an attractive feature of this protocol to obtain polyhydroxychalcones in excellent yields. In order to find out the general applicability of this new endeavor it was successfully applied for the synthesis of 15 different chalcones including highly bioactive prenylated hydroxychalcone xanthohumol.</p> <p>Conclusion</p> <p>A new, simple and solvent free method was developed for the synthesis of substituted chalcones in environmentally benign way. The mild reaction conditions, easy work-up, clean reaction profiles render this approach as an interesting alternative to the existing methods.</p

GroEL-Assisted Protein Folding: Does It Occur Within the Chaperonin Inner Cavity?

The folding of protein molecules in the GroEL inner cavity under the co-chaperonin GroES lid is widely accepted as a crucial event of GroEL-assisted protein folding. This review is focused on the data showing that GroEL-assisted protein folding may proceed out of the complex with the chaperonin. The models of GroEL-assisted protein folding assuming ligand-controlled dissociation of nonnative proteins from the GroEL surface and their folding in the bulk solution are also discussed

Characterization of 4-HNE Modified L-FABP Reveals Alterations in Structural and Functional Dynamics

4-Hydroxynonenal (4-HNE) is a reactive α,β-unsaturated aldehyde produced during oxidative stress and subsequent lipid peroxidation of polyunsaturated fatty acids. The reactivity of 4-HNE towards DNA and nucleophilic amino acids has been well established. In this report, using proteomic approaches, liver fatty acid-binding protein (L-FABP) is identified as a target for modification by 4-HNE. This lipid binding protein mediates the uptake and trafficking of hydrophobic ligands throughout cellular compartments. Ethanol caused a significant decrease in L-FABP protein (P<0.001) and mRNA (P<0.05), as well as increased poly-ubiquitinated L-FABP (P<0.001). Sites of 4-HNE adduction on mouse recombinant L-FABP were mapped using MALDI-TOF/TOF mass spectrometry on apo (Lys57 and Cys69) and holo (Lys6, Lys31, His43, Lys46, Lys57 and Cys69) L-FABP. The impact of 4-HNE adduction was found to occur in a concentration-dependent manner; affinity for the fluorescent ligand, anilinonaphthalene-8-sulfonic acid, was reduced from 0.347 µM to Kd1 = 0.395 µM and Kd2 = 34.20 µM. Saturation analyses revealed that capacity for ligand is reduced by approximately 50% when adducted by 4-HNE. Thermal stability curves of apo L-FABP was also found to be significantly affected by 4-HNE adduction (ΔTm = 5.44°C, P<0.01). Computational-based molecular modeling simulations of adducted protein revealed minor conformational changes in global protein structure of apo and holo L-FABP while more apparent differences were observed within the internal binding pocket, revealing reduced area and structural integrity. New solvent accessible portals on the periphery of the protein were observed following 4-HNE modification in both the apo and holo state, suggesting an adaptive response to carbonylation. The results from this study detail the dynamic process associated with L-FABP modification by 4-HNE and provide insight as to how alterations in structural integrity and ligand binding may a contributing factor in the pathogenesis of ALD

The Lid Domain of Caenorhabditis elegans Hsc70 Influences ATP Turnover, Cofactor Binding and Protein Folding Activity

Hsc70 is a conserved ATP-dependent molecular chaperone, which utilizes the energy of ATP hydrolysis to alter the folding state of its client proteins. In contrast to the Hsc70 systems of bacteria, yeast and humans, the Hsc70 system of C. elegans (CeHsc70) has not been studied to date

Hsp70 chaperones: Cellular functions and molecular mechanism

Hsp70 proteins are central components of the cellular network of molecular chaperones and folding catalysts. They assist a large variety of protein folding processes in the cell by transient association of their substrate binding domain with short hydrophobic peptide segments within their substrate proteins. The substrate binding and release cycle is driven by the switching of Hsp70 between the low-affinity ATP bound state and the high-affinity ADP bound state. Thus, ATP binding and hydrolysis are essential in vitro and in vivo for the chaperone activity of Hsp70 proteins. This ATPase cycle is controlled by co-chaperones of the family of J-domain proteins, which target Hsp70s to their substrates, and by nucleotide exchange factors, which determine the lifetime of the Hsp70-substrate complex. Additional co-chaperones fine-tune this chaperone cycle. For specific tasks the Hsp70 cycle is coupled to the action of other chaperones, such as Hsp90 and Hsp100