The Interplay between Chemistry and Mechanics in the Transduction of a Mechanical Signal into a Biochemical Function

There are many processes in biology in which mechanical forces are generated. Force-bearing networks can transduce locally developed mechanical signals very extensively over different parts of the cell or tissues. In this article we conduct an overview of this kind of mechanical transduction, focusing in particular on the multiple layers of complexity displayed by the mechanisms that control and trigger the conversion of a mechanical signal into a biochemical function. Single molecule methodologies, through their capability to introduce the force in studies of biological processes in which mechanical stresses are developed, are unveiling subtle intertwining mechanisms between chemistry and mechanics and in particular are revealing how chemistry can control mechanics. The possibility that chemistry interplays with mechanics should be always considered in biochemical studies.Comment: 50 pages, 18 figure

Theoretical Perspectives on Protein Folding

Understanding how monomeric proteins fold under in vitro conditions is crucial to describing their functions in the cellular context. Significant advances both in theory and experiments have resulted in a conceptual framework for describing the folding mechanisms of globular proteins. The experimental data and theoretical methods have revealed the multifaceted character of proteins. Proteins exhibit universal features that can be determined using only the number of amino acid residues (N) and polymer concepts. The sizes of proteins in the denatured and folded states, cooperativity of the folding transition, dispersions in the melting temperatures at the residue level, and time scales of folding are to a large extent determined by N. The consequences of finite N especially on how individual residues order upon folding depends on the topology of the folded states. Such intricate details can be predicted using the Molecular Transfer Model that combines simulations with measured transfer free energies of protein building blocks from water to the desired concentration of the denaturant. By watching one molecule fold at a time, using single molecule methods, the validity of the theoretically anticipated heterogeneity in the folding routes, and the N-dependent time scales for the three stages in the approach to the native state have been established. Despite the successes of theory, of which only a few examples are documented here, we conclude that much remains to be done to solve the "protein folding problem" in the broadest sense.Comment: 48 pages, 9 figure

Arrhythmogenic cardiomyopathy related DSG2 mutations affect desmosomal cadherin binding kinetics

Dieding M, Debus JD, Kerkhoff R, et al. Arrhythmogenic cardiomyopathy related DSG2 mutations affect desmosomal cadherin binding kinetics. Scientific Reports. 2017;7(1): 13791.Cadherins are calcium dependent adhesion proteins that establish the intercellular mechanical contact by bridging the gap to adjacent cells. Desmoglein-2 (Dsg2) is a specific cadherin of the cell-cell contact in cardiac desmosomes. Mutations in the DSG2-gene are regarded to cause arrhythmogenic (right ventricular) cardiomyopathy (ARVC) which is a rare but severe heart muscle disease. The molecular pathomechanisms of the vast majority of DSG2 mutations, however, are unknown. Here, we investigated the homophilic binding of wildtype Dsg2 and two mutations which are associated with ARVC. Using single molecule force spectroscopy and applying Jarzynski's equality we determined the kinetics and thermodynamics of Dsg2 homophilic binding. Notably, the free energy landscape of Dsg2 dimerization exposes a high activation barrier which is in line with the proposed strand-swapping binding motif. Although the binding motif is not directly affected by the mutations the binding kinetics differ significantly from the wildtype. Furthermore, we applied a dispase based cell dissociation assay using HT1080 cell lines over expressing Dsg2 wildtype and mutants, respectively. Our molecular and cellular results consistently demonstrate that Dsg2 mutations can heavily affect homophilic Dsg2 interactions. Furthermore, the full thermodynamic and kinetic description of Dsg2 dimerization provides a consistent model of the so far discussed homophilic cadherin binding

The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding.

One of the most exciting developments in the field of biological physics in recent years is the ability to manipulate single molecules and probe their properties and function. Since its emergence over two decades ago, single molecule force spectroscopy has become a powerful tool to explore the response of biological molecules, including proteins, DNA, RNA and their complexes, to the application of an applied force. The force versus extension response of molecules can provide valuable insight into its mechanical stability, as well as details of the underlying energy landscape. In this review we will introduce the technique of single molecule force spectroscopy using the atomic force microscope (AFM), with particular focus on its application to study proteins. We will review the models which have been developed and employed to extract information from single molecule force spectroscopy experiments. Finally, we will end with a discussion of future directions in this field

Monitoring the antibiotic darobactin modulating the β-barrel assembly factor BamA

The β-barrel assembly machinery (BAM) complex is an essential component of Escherichia coli that inserts and folds outer membrane proteins (OMPs). The natural antibiotic compound darobactin inhibits BamA, the central unit of BAM. Here, we employ dynamic single-molecule force spectroscopy (SMFS) to better understand the structure-function relationship of BamA and its inhibition by darobactin. The five N-terminal polypeptide transport (POTRA) domains show low mechanical, kinetic, and energetic stabilities. In contrast, the structural region linking the POTRA domains to the transmembrane β-barrel exposes the highest mechanical stiffness and lowest kinetic stability within BamA, thus indicating a mechano-functional role. Within the β-barrel, the four N-terminal β-hairpins H1-H4 expose the highest mechanical stabilities and stiffnesses, while the four C-terminal β-hairpins H5-H6 show lower stabilities and higher flexibilities. This asymmetry within the β-barrel suggests that substrates funneling into the lateral gate formed by β-hairpins H1 and H8 can force the flexible C-terminal β-hairpins to change conformations

Unfolding and identification of membranproteins in situ

Single-molecule force spectroscopy (SMFS) uses the cantilever tip of an atomic force microscope (AFM) to apply a force able to unfold a single protein. The obtained force-distance curve encodes the unfolding pathway, and from its analysis it is possible to characterize the folded domains. SMFS has been mostly used to study the unfolding of purified proteins, in solution or reconstituted in a lipid bilayer. Here, we describe a pipeline for analyzing membrane proteins based on SMFS, which involves the isolation of the plasma membrane of single cells and the harvesting of force-distance curves directly from it. We characterized and identified the embedded membrane proteins combining, within a Bayesian framework, the information of the shape of the obtained curves, with the information from mass spectrometry and proteomic databases. The pipeline was tested with purified/reconstituted proteins and applied to five cell types where we classified the unfolding of their most abundant membrane proteins. We validated our pipeline by overexpressing four constructs, and this allowed us to gather structural insights of the identified proteins, revealing variable elements in the loop regions. Our results set the basis for the investigation of the unfolding of membrane proteins in situ, and for performing proteomics from a membrane fragment

On the Morphology and Dynamics of Purple Membranes at the Solid-Liquid Junction

Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das an der fest-flüssig Grenzfläche adsorbierte und in der Purpurmembran eingebettete Bacteriorhodopsin in Abhängigkeit von der Substratoberfläche zu einer mehr oder weniger stark ausgeprägten Dynamik neigt. Dieser dynamische Wandel von BR wurde zum ersten Mal beobachtet, zeitaufgelöst untersucht und konnte schließlich für die teils gravierenden morphologischen Veränderungen der an der Oberfläche adsorbierten Purpurmembranen verantwortlich gemacht werden. Diverse extrinsische sowie intrinsische Faktoren, die dieWechselbeziehung aus Dynamik und Morphologie bestimmen, konnten identifiziert werden. Anhand dieser Erkenntnisse konnte ein allgemeines, vom Substrat unabhängiges Stabilitätskriterium abgeleitet werden, welches sowohl für BRWildtyp enthaltende als auch für die diversen Mutanten enthaltende Purpurmembranen Gültigkeit besitzt. Die freie Oberflächenenergie, sowie die Sustratrauheit stellen in diesem Zusammenhang extrinsische Schlüsselparameter dar, welche die Dynamik gar erst erlauben oder diese innerhalb der substratgebundenen Purpurmembranen unterbinden. Eine gezielte Punktmutation (D85T) verwandelt BR nicht nur in eine Chloridpumpe, sondern beeinflußt ebenfalls dramatisch das Kristallisationsverhalten, was wiederum zeigt welchen Einfluß und was für eine Rolle intrinsische Faktoren im Rahmen der beobachtetenWechselbeziehung innehaben. Interessanterweise konnte gezeigt werden, dass eine Stabilisierung der tertiären Struktur von BR-D85T, die intrinsisch durch die Bindung von Chlorid innerhalb der Retinalbindungstasche vermittelt wurde, die Fähigkeit von PM-D85T zur Ausbildung eines zusammenhängenden Kristallgitters wiederherstellt. PM-D85T ermöglichte außerdem die Krümmung von Purpurmembranen in den unterschiedlichen Intermediaten des Photozyklus im thermischen Gleichgewicht an der fest-flüssig Grenzfläche zu untersuchen. Die Seitendifferenzierung via SMFS und EFM zeigte, dass PM-D85T im M2-Photointermediat mit der zytoplasmatischen Seite nach außen gekrümmt ist. Im Gegensatz dazu ist sie, nachdem sie den durch eine flache Topographie gekennzeichneten N-Zustand durchlaufen hat, im finalen O-Photointermediat mit der extrazellulären Seite nach außen gekrümmt. Die unterschiedlichen beobachteten Krümmungsmodi verdeutlichen ein sich in der Natur wiederhohlendes Konzept der Kopplung von Form und Funktion, indem die Konformation von BR mit der Funktion als vektorieller Protonenpumpe zum Transport von Protonen von der zytoplasmatischen zur extrazellulären Seite eng verknüpft ist. Eine genauere Untersuchung der Krümmung ergab, dass kleinere Membranen sehr stark von den extrinsischen Einschränkungen, hervorgerufen durch dieWechselwirkung mit der Substratoberfläche, beeinflußt werden. Größere Membranen hingegen bewahren eine charakteristische Krümmung, die von den physikochemischen Bedingungen und der damit Verknüpften Form von BR abhängen. Dies zeigt, dass einzig und allein die intrinsischen Formänderungen des eingebetteten Proteins für die makroskopisch gekrümmte Natur der Membranen verantwortlich ist. Von einem nanobiotechnologischen Standpunkt aus betrachtet stellen Purpurmembranen einen supramolekularen Aktuator dar, der von sowohl intrinsischen, als auch extrinsischen Einflüssen verändert und in Gang gebracht werden kann. Diese Tatsache eröffnet ein weites Feld für mögliche Anwendungen, z.B. als chemomechanischer Wandler, der pH-Wert bedingt seine Form verändert und auf diese Weise mit seiner direkten Umgebung interagieren kann. Diese Interaktionsmöglichkeit rückt die Purpurmembranen in den Kontext anderer molekularer Maschinen und supramolekularer Schalter. Die beobachteten und tendenziel steuerbaren dynamischen Eigenschaften von BR und PM an der fest-flüssig Grenzfläche kombiniert mit der reversiblen Kontrolle über das PM Kristallisationsverhalten könnten die Erzeugung von großflächigen, künstlichen Membranen ermöglichen. Diese sind von großem Interesse für die optische Datenspeicherung, Anwendungen im Bereich der Photovoltaik oder als Templat für die Darstellung neuartiger Nanobiomaterialien wie Photonischekristalle