Conformation and dynamics of human urotensin II and urotensin related peptide in aqueous solution

Conformation and dynamics of the vasoconstrictive peptides human urotensin II (UII) and urotensin related peptide (URP) have been investigated by both unrestrained and enhanced-sampling molecular-dynamics (MD) simulations and NMR spectroscopy. These peptides are natural ligands of the G-protein coupled urotensin II receptor (UTR) and have been linked to mammalian pathophysiology. UII and URP cannot be characterized by a single structure but exist as an equilibrium of two main classes of ring conformations, <i>open</i> and <i>folded</i>, with rapidly interchanging subtypes. The <i>open</i> states are characterized by turns of various types centered at K⁸Y⁹ or F⁶W⁷ predominantly with no or only sparsely populated transannular hydrogen bonds. The <i>folded</i> conformations show multiple turns stabilized by highly populated transannular hydrogen bonds comprising centers F⁶W⁷K⁸ or W⁷K⁸Y⁹. Some of these conformations have not been characterized previously. The equilibrium populations that are experimentally difficult to access were estimated by replica-exchange MD simulations and validated by comparison of experimental NMR data with chemical shifts calculated with density-functional theory. UII exhibits approximately 72% <i>open</i>:28% <i>folded</i> conformations in aqueous solution. URP shows very similar ring conformations as UII but differs in an <i>open:folded</i> equilibrium shifted further toward <i>open</i> conformations (86:14) possibly arising from the absence of folded N-terminal tail-ring interaction. The results suggest that the different biological effects of UII and URP are not caused by differences in ring conformations but rather by different interactions with UTR

Synthèse et utilisation de benzotriazepinones comme modulateur du système urotensinergique

Cette thèse étant rédigée par article, il est important de noter ma contribution sur sa rédaction ainsi que sur les articles présentés. Le Chapitre 1, comportant l’introduction de cette thèse, a été entièrement rédigé par moi-même, sous la supervision du Pr William D. Lubell et du Pr David Chatenet. Le Chapitre 2 et l’Article 1 ont été entièrement rédigés par moi-même, sous la supervision du Pr William D. Lubell. Les résultats présentés ont été obtenu lors de mon travail au laboratoire, sous la supervision du Pr William D. Lubell. Le Chapitre 3 et l’Article 2 ont été entièrement rédigés par moi-même, sous la supervision du Pr William D. Lubell et du Pr David Chatenet, à l’exception de la partie sur l’activation des protéines Gq et G12, rédigée par le doctorant Étienne Billard et le Pr David Chatenet. La librairie des 26 composés benzotriazépiniques a été synthétisée, purifiée et caractérisée lors de mon travail au laboratoire, sous la supervision du Pr William D. Lubell. Les résultats et le traitement des données des tests de contractions aortiques ex-vivo ont été obtenus lors de mon travail au laboratoire, sous la supervision du Pr David Chatenet, à partir d’une aorte de rat prélevé par le doctorant Étienne Billard. Les tests d’activation des protéines Gq et G12 ont été effectué par le doctorant Étienne Billard. Le Chapitre 4 et l’Article 3 ont été entièrement rédigés par moi-même, sous la supervision du Pr William D. Lubell. Les résultats présentés ont été obtenu lors de mon travail au laboratoire, sous la supervision du Pr William D. Lubell. Le Chapitre 5 comportant la conclusion de cette thèse, a été entièrement rédigé par moi-même, sous la supervision du Pr William D. Lubell.Les peptides sont des agents thérapeutiques potentiellement intéressants dû à leur faible toxicité et excellente activité. Cependant, ils ont le désavantage de se métaboliser rapidement, d’avoir une pauvre biodisponibilité et la possibilité d’interagir avec plusieurs sous-types de récepteurs, engendrant des effets secondaires. Afin de contrer ces problèmes, tout en gardant leurs attractivités, des peptides modifiés sont et ont été développés, ils sont appelés peptidomimétiques. Une classe de peptidomimétique consiste au remplacement complet de la structure peptidique par une petite molécule, qui va mimer la conformation et les fonctions des chaines latérales importantes pour l’activité. De plus, certaines structures comme les benzodiazépines ont été décrites comme des structures privilégiées, du faites de leurs affinités pour de nombreux récepteurs peptidiques. Leurs aza-analogues, les benzotriazépines, ont cependant reçût beaucoup moins d’attention. Leurs synthèses mettent en jeux l’utilisation de réactifs toxiques, des conditions de réactions dures, la nécessité d’avoir des groupements protecteurs ou encore des rendements faibles pour certains substrats. Le récepteur Urotensine II (UT) est un membre de la classe de la famille des récepteurs couplés aux protéines G, qui interagit à deux ligands peptidiques cycliques endogènes : l’Urotensine II (hUII, H-Glu-Thr-Pro-Asp-c[Cys-Phe-Trp- Lys- Tyr-Cys]-Val-OH) et le peptide apparenté à l’Urotensine II (URP, H-Ala-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH). Aussi appelé système urotensinergique, il joue un rôle déterminant notamment dans la pathogénèse et la progression des maladies cardiovasculaires. Le développement de ligands pouvant différencier les rôles de UII et de URP, afin de sonder leurs voies de signalisations respectives, est primordial pour mieux comprendre cette potentielle cible thérapeutique. Les travaux présentés dans cette thèse visent deux objectifs principaux, le développement d’une nouvelle méthodologie de synthèse des 1,3,4-benzotriazépin-2-ones, orientée vers une diversification effective, et leurs utilisations comme mime peptidique pour la modulation du système urotensinergique. Pour se faire, une approche mettant en jeux des alkylations chimiosélectives successives d’une semicarbazone, suivis d’une étape de déprotection/cyclisation, a été développée pour produire une variété de benzotriazepin-2-ones. De plus, il a aussi été mis en évidence la possibilité d’utiliser le coeur achiral des benzotriazépinones comme mime peptidique de conformation tour gamma. Le squelette benzotriazépinique a été employé pour créer des modulateurs allostériques de UT, en mimant la conformation tour de la séquence tripeptidique Bip-Lys-Tyr présent dans l’Urocontrin ([Bip4]URP) qui est un modulateur allostérique du récepteur urotensinergique. Une série de 27 composés a été synthétisée par notre nouvelle méthodologie développée, afin de mieux comprendre la relation structure/activité dans la modulation de l’UT. Certains composés ont révélé la capacité à moduler sélectivement les effets de hUII et URP sur la contraction de l’aorte de rat de manière ex-vivo. Enfin, dans la perspective d’améliorer l’activité antagoniste, une fonction N-benzylamide a été installée en position 8 de la benzotriazepine, pour mimer la phénylalanine présente dans l‘Urocontrin. De plus, des analogues photo-réactifs sont poursuivis, par introduction d’un groupement benzophénone, dans le but de se lier de manière covalente au récepteur urotensinergique et de localiser la partie responsable de la modulation de l’activité de hUII et URP. Pour conclure, l’ensemble de ces travaux représentent une avancée sur l’utilisation des benzotriazépinones en générale et comme mime peptidique possédant notamment une conformation tour . Le développement d’une méthodologie orientée sur une diversification efficace a permis le développement de modulateurs achiraux du récepteur UT. Ainsi, ces études ont contribué à l’avancement des connaissances, fondamentales et appliquées, dans les domaines des mimes peptidiques et de la chimie médicinale.Peptides are potentially interesting therapeutic agents, due to their low toxicity and excellent activity. They have however disadvantages, such as rapid metabolism, poor bioavailability and potential to react indiscriminately with multiple receptors, which may lead to secondary effects. To address such issues, modified peptide analogs, so-called peptidomimetics, have been developed. One type of peptidomimetic consists of the complete replacement of the peptide structure by a small molecule that mimics the important backbone and side chain conformation and functions for activity. In addition, certain molecules, such as benzodiazepines have been described as privileged structures, because of their affinity for many peptide receptors. The aza-analogues, benzotriazepines, have received a lot less attention than the parent benzodiazepines, in part due to difficulties in their synthesis, necessitating toxic reagents, harsh reaction conditions, and multiple protecting groups to obtain compound in low yield. The Urotensin II (UT) receptor is a member of the G protein-coupled receptor family, and interacts with two endogenous cyclic peptide ligands: urotensin II (hUII, H-Glu-Thr-Pro-Asp-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH) and the urotensin II-related peptide (URP, H-Ala-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH). The so-called urotensinergic system has among various physiological roles, significance in the pathogenesis and the progression of cardiovascular diseases. The conception of ligands which can differentiate the signaling and phenotypic outcomes of UII and URP are necessary to more effectively target UT for therapeutic development. This thesis focuses on two principle objectives: the development of new methods for the synthesis of diverse 1,3,4-benzotriazepin-2-ones, and the application of the latter as peptidomimetics that modulate selectively the endogenous ligands of the urotensinergic system. An approach featuring chemo-selective alkylation of a semicarbazone intermediate has been developed to produce diverse benzotriazepin-2-ones. In addition, the achiral benzotriazepinones were shown to have potential to serve as peptide gamma-turn mimics. The benzotriazepinone scaffold was employed to create achiral allosteric UT modulators by mimicry of the purported turn confirmation of the tripeptide sequence, Bip-Lys-Tyr, in the biologically active UT regulator Urocontrin ([Bip4]URP). A series of 27 compounds was synthesized by our method to study structure-activity relationships for UT modulation. Certain benzotriazepinones exhibited capacity to selectively modulate the effects of hUII and URP in ex vivo studies of rat aorta contraction. To improve antagonist activity, a N-benzylamide was installed at the benzotriazepine 8-position to mimic the phenylalanine residue in Urocontrin. Moreover, photo-reactive analogs have been pursued by introduction of a benzophenone residue towards the goal of binding UT covalently to identify the location responsible for modulation of hUII and URP activity. In conclusion, advances have been made in the synthesis and application of benzotriazepinones as peptide -turn mimics. Methods to diversify effectively the heterocycle have empowered development of achiral modulators of the UT receptor. Fundamental and applied advancements of knowledge have thus been made in the domains of peptide mimicry and medicinal chemistry

Synthèse en phase solide de pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones modulateurs du système urotensinergétique

Les pyrrolodiazépinones ont des activités biologiques intéressantes sur différents récepteurs biologiques, ce qui en font une cible de choix pour développer de nouvelles petites molécules biologiquement actives. Une méthodologie en solution a été développée pour synthétiser des pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones, qui utilise la réaction de Pictet-Spengler pour former le cycle diazépinone, comme réaction clé. Il a été démontré que le pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-one mime un tour-γ inverse par l’analyse de cristaux par rayon X. Cette méthodologie a été transposée sur trois types de support, soit la résine de Merrifield, de Wang et un support soluble (TAP). Le système urotensinergétique joue un rôle dans certaines pathologies du système cardiovasculaire, comme l’hypertension artérielle, l’insuffisance cardiaque et l’athérosclérose. Le système urotensinergétique est exprimé dans le système circulatoire, extractoire et le système nerveux central et comprend l’UII, l’URP et le récepteur UT. L’UII et l’URP humains sont composés respectivement des séquences d’acides aminés : H-Glu-Thr-Pro-Asp-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH et H-Ala-c[Cys-Phe-Trp-LysTyr-Cys]-Val-OH. L’UII est le peptide vasoconstricteur le plus puissant connu à ce jour, dont l’URP est son isoforme. Les deux peptides ont des effets biologiques différents et on peut supposer qu’ils jouent un rôle distinct dans certaines pathologies. Il a été démontré que la partie active de l’UII est composée du tripeptide : Trp-Lys-Tyr. Dans l’URP, il a été démontré que ce tripeptide forme un tour-γ inverse, ce qui fait du récepteur UT une bonne cible biologique pour tester une librairie de pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones, reprenant le tripeptide Trp-Lys-Tyr. Dernièrement, l’équipe du professeur David Chatenet a mis au point un peptide, l’urocontrin en remplaçant le segment Trp par un groupement biphénylalanine, qui a démontré un comportement spécifique comme antagoniste du récepteur UT. La Librairie de pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones est basée sur la séquence TrpLys-Tyr de l’UII et de l’URP et de la séquence Trp-Lys-Bip de l’urocontrin. La synthèse de la librairie est faite sur la résine de Wang. La chaîne latérale de Tyr est mimée en utilisant la tyramine, Lys et Orn sont utilisés et la chaîne latérale de Trp a été reproduite II en utilisant le biphényle (comme dans l’urocontrin), le 1-naphthyle et le 2-naphthyle, sont introduits en employant les aldéhydes respectifs dans la réaction de Pictet-Spengler, ce qui donne les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones insaturés et les saturés S- et R-. L’évaluation de l’activité biologique des pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones obtenues sur le récepteur UT se fait par des tests in vitro et ex vivo. Les tests in vitro consistent en un essai de liaisons sur des cellules CHO exprimant le récepteur UT en employant hUII-125I, comme contrôle radiomarqé. Les tests ex vivo sont effectués sur des aortes de rats pour mesurer la capacité à induire des contractions ou de moduler les contractions induites par hUII et URP. Certains R-pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones causent une réduction de 50% du signal radioactivité du hUII-125I. Les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones ne montrent guère d’activité ex vivo, mais ils ont la capacité de moduler les contractions induites par l’hUII et l’URP. Par exemple, l’analogue Lys R-saturé avec le biphényle inhibe toutes les contractions de l’aorte à 14 µM avec un pKb de 5,54 à 4 µM, sans influencer les contractions de l’aorte induites par l’URP. Les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones ont une sélectivité pour le système urotensinergétique et sont inactifs sur le récepteur de l’endotheline-1. Les pyrrolo[3,2-e][1,4]diazépin-2-ones sont les premières petites molécules qui peuvent moduler l’activité biologique de l’UII et URP et offrir un potentiel intéressant comme outil pour étudier le système urotensinergétique.The pyrrolodiazepinones have interesting biological activities on various biological receptors, which makes them a prime target for developing new biologically active small molecules. A methodology in solution had been developed for synthesizing pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones, which utilized the Pictet-Spengler condensation as the key reaction to form the diazepinone ring. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones were found to mimic an inverse γ-turn conformation by X-ray crystallographic analysis. The methodology was subsequently implemented on three types of support: Merrifield resin, Wang resin and the soluble TAP support. The urotensinergic system plays a role in certain diseases of the cardiovascular system, such as hypertension, heart failure and atherosclerosis. The urotensinergic system is expressed in the circulatory system, excretory and central nervous systems and includes the endogenous ligands urotensin II (UII) and urotensin II-related peptide (URP), and the urotensin receptor UT. The ligands UII and human URP are composed of the respective amino acid sequences: H-Glu-Thr-Pro-Asp-c[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH and H-Ala-c[Cys-Phe-Lys-Tyr-Trp-Cys]-Val-OH. The peptide UII is the most potent vasoconstrictor known to date. The two peptides have different biological effects and may exhibit distinct roles in certain diseases. Their common Trp-Lys-Tyr sequence is believed to play an important role in the activity of UII and URP, and has been suggested to adopt an inverse γ-turn conformation. Notably, the laboratory of Professor David Chatenet developed the UT receptor antagonist peptide urocontrin by replacing the Trp residue by biphenylalanine (Bip) in URP. A library of pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-one analogs was thus designed to mimic the inverse γ-turn sequence and targeted against UT. The pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-one library was designed based on the Trp-Lys-Tyr sequence of UII and URP, and Trp-Lys-Bip sequence of urocontrin. The synthesis of the pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-one library was achieved on Wang resin. The side chain of Tyr was mimicked using tyramine, Lys and Orn were used as the basic amino acid component, and the side chain of Trp was replicated using biphenyl (as in urocontrin) 1-naphthyl and 2-naphthyl groups that were introduced by employing their respective aldehydes in a Pictet-Spengler reaction, which furnished unsaturated and saturated S- and R-pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones. Evaluation of the biological activity of the pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones on the UT receptor was performed in vitro and ex vivo. Tests in vitro measured binding in CHO-cells which expressed UT by employing hUII-125I as radiolabeled control. In rat aorta, ex vivo tests measured capacity to induce contraction, or modulate the contractions induced by hUII and URP. Certain R-pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones caused an up to 50% reduction of the radioactive signal of hUII-125I. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones exhibited little activity ex vivo; however, they modulated contractions induced by hUII and URP. For example, the saturated R-analog possessing lysine and a biphenyl side chain inhibited completely hUII-induced contractions of the aorta at 14 µM with a pKb of 5.54 at 4 µM, without influencing URP-induced contractions. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones were selective for the urotensinergic system and inactive on the related receptor endothelin-1. Pyrrolo[3,2-e][1,4]diazepin-2-ones represent the first small molecules that can differently modulate the biological activities of UII and URP, and offer interesting potential as tools for studying the urotensinergic system

Identification de déterminants moléculaires de la liaison du récepteur et de l'urotensine II

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) forment la classe de récepteurs la plus nombreuse et la plus étudiée. La compréhension du mode de fonctionnement de cette famille de récepteurs fait l'objet d'études intenses, tant au niveau de leur interaction avec le ligand qu'au niveau du processus d'activation suite à cette liaison. Le récepteur de l'U-II (UT) est un membre de la classe A des GPCRs et possède toutes les caractéristiques de cette famille. Notre hypothèse est que le récepteur UT possède des déterminants moléculaires identifiables qui sont impliqués lors de sa liaison à l'U-II et de son activation. Dans un premier temps, des études de marquage par photoaffinité du récepteur UT ont été effectuées en utilisant deux séries de ligands U-II qui contiennent le résidu photosensible para-benzoyl-L-phenylalanine (Bpa) et qui possèdent un caractère agoniste ou agoniste partiel. Il a été montré pour les deux séries de ligands que les quatre premiers résidus de l'U-II sont à proximité du résidu Met288 dans la 3e boucle extracellulaire du récepteur UT. Cette approche a également été utilisée pour comparer le patron de photomarquage entre deux ligands contenant le Bpa à la position 6, soit de l'analogue agoniste complet avec celui de l'analogue agoniste partiel. Il a été montré que le peptide agoniste photomarque les résidus Met184/Met185 du TMD4 de l'UT, tandis que l'agoniste partiel photomarque plutôt une région délimitée au TMD5. Le deuxième objectif du projet a été l'identification, au moyen de l'approche SCAM (Substituted Cysteine Assessibility Method) de résidus qui bordent la pochette de liaison du récepteur. Chacun des résidus des domaines transmembranaires 6 et 7 ont été mutés, un à un, par une cystéine. Suite au traitement par des composés MTS, la liaison du ligand [indice supérieur 125]I-U-II aux mutants F268C[indice supérieur (6.44)], W278C[indice supérieur (6.54)] et A282C[indice supérieur (6.58)] du TMD6 ainsi qu'aux mutants L298C[indice supérieur (7.34)], Y300C[indice supérieur (7.36)], T302C[indice supérieur (7.38)] et T303C[indice supérieur (7.39)] du TMD7 a été inhibée, démontrant que ces positions du récepteur font face à la pochette de liaison. L'ensemble de ces études mène à une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison et de l'activation du récepteur UT et nous a permis de proposer un modèle moléculaire du récepteur UT ligandé. Ce modèle pourra ouvrir la voie vers une meilleure compréhension du processus de liaison et d'activation des GPCRs peptidergiques de la classe A

Caractérisation structurale du récepteur de l’Urotensine II

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) constituent la plus grande famille de protéines localisées à la membrane plasmique. Toutefois, les mécanismes moléculaires régissant leur liaison avec leurs ligands et la transduction du signal qui s’ensuit sont encore mal compris. Nous avons donc cherché à mieux comprendre le mécanisme de liaison d’un ligand avec son récepteur, et ainsi caractériser le premier événement de la cascade pharmacologique déclenché par ces GPCR. Nous nous sommes intéressés au récepteur de l’urotensine-II (UT), car celui-ci fait partie de la catégorie des récepteurs peptidergiques qui demeure encore à ce jour peu comprise au niveau de leur structure et de leur mode de liaison. D’un point de vue physiologique, ce récepteur joue notamment un rôle important au niveau cardiovasculaire ainsi que dans certaines pathologies comme l’hypertension ou le diabète. Nous avons donc cherché à identifier l’ensemble des résidus participant à la pochette de liaison du récepteur UT en appliquant la méthode SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) et en procédant à la substitution individuelle des résidus des TM1, TM2, TM3, TM4 et TM5 avec une cystéine. Par la suite, les paramètres pharmacologiques de ces mutants ont été mesurés à l’aide d’études de radioliaison avec le ligand [[indice supérieur 125]I]UII. Suite au traitement avec de l’hydrobromure de 2-aminoethyl-méthanethiosulfonate (MTSEA), nous avons ainsi pu mettre en évidence que les mutants I54C[indice supérieur (1.35)] du TM1, Y100C[indice supérieur (2.53)], S103C[indice supérieur (2.56)], F106C[indice supérieur (2.59)], I107C[indice supérieur (2.60)], T110C[indice supérieur (2.63)] et Y111C[indice supérieur (2.64)] du TM2, L126C[indice supérieur (3.28)], F127C[indice supérieur (3.29)], F131C[indice supérieur (3.33)] et M134C[indice supérieur (3.36)] du TM3 et M184C[indice supérieur (4.60)] et I188C[indice supérieur (4.64)] du TM4, n’étaient plus capables de lier [indice supérieur 125]I-UII, démontrant ainsi une orientation de ces positions face à la pochette de liaison du récepteur UT. L’ensemble de ces travaux nous ont permis d’acquérir une meilleure compréhension des déterminants moléculaires de la liaison menant à l’activation du récepteur UT. En associant ces résultats avec nos travaux précédents, nous sommes en mesure de présenter un modèle moléculaire complet de la pochette de liaison du récepteur UT de rat en complexe avec le ligand UII. Cette étude permet ainsi d’offrir une meilleure compréhension du processus de liaison et d’activation des GPCR peptidergiques de la classe A. En absence de structure cristalline du récepteur UT, ce modèle constitue un outil pharmacologique de choix qui pourra servir notamment à la conception rationnelle de nouveaux ligands thérapeutiques ciblant le système urotensinergique

Signaling through NADPH oxidases

Vascular remodeling processes are characterized by increased proliferation of vascular cells and a prothrombotic state. Coagulation factors and vasoactive peptides have been suggested to contribute to these processes. Reactive oxygen species (ROS) have been implicated to act as vascular signaling molecules, and NADPH oxidases have been identified as a major source of vascular ROS production. The aims of the present study were therefore to identify signaling pathways linking factors promoting remodeling processes such as thrombin and the vasoactive peptide urotensin-II to ROS production derived from NADPH oxidases as well as subsequent proliferation and procoagulant activity. Thrombin induced a biphasic increase in ROS levels. A rapid activation of NADPH oxidases was followed by a second delayed response. This increase was paralleled by ROSdependent induction of p22phox involving p38MAPK and PI3K/Akt in endothelial cells, and by enhanced Rac-1 levels in pulmonary artery smooth muscle cells, and followed by enhanced proliferation. Activation of Rac-1-dependent ROS production by thrombin resulted in elevated levels of the prothrombotic factors tissue factor (TF) and plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) in PASMC. Rac-1-dependent induction of TF was mediated by the transcription factor NF?B and resulted in enhanced procoagulant activity. Since active TF results in thrombin generation, this pathway could play an important role in promoting a feedback loop leading to a thrombogenic cycle. Rac-1-dependent induction of PAI-1 was mediated by elevated Ca2+, the Rac-1 downstream target PAK and the transcription factor HIF-1. Since PAI-1 inhibition diminished proliferation of PASMC, these findings identify PAI-1 as an important mediator of thrombin-stimulated NADPH oxidase-dependent proliferation. Finally, the vasoactive peptide U-II was identified as a novel activator of NADPH oxidases and ROS-dependent activation of MAP kinases and Akt which subsequently induced PAI-1 expression and proliferation. Taken together, these findings support a model where enhanced levels of thrombotic and vasoactive factors, as found in an early stage of vascular remodeling, activate and induce NADPH oxidases and ROS generation. ROS-dependent signaling cascades link and amplify these signals and promote proliferative and thrombotic events which can lead to progression of vascular remodeling

Biomolecular simulations: From dynamics and mechanisms to computational assays of biological activity

Biomolecular simulation is increasingly central to understanding and designing biological molecules and their interactions. Detailed, physics‐based simulation methods are demonstrating rapidly growing impact in areas as diverse as biocatalysis, drug delivery, biomaterials, biotechnology, and drug design. Simulations offer the potential of uniquely detailed, atomic‐level insight into mechanisms, dynamics, and processes, as well as increasingly accurate predictions of molecular properties. Simulations can now be used as computational assays of biological activity, for example, in predictions of drug resistance. Methodological and algorithmic developments, combined with advances in computational hardware, are transforming the scope and range of calculations. Different types of methods are required for different types of problem. Accurate methods and extensive simulations promise quantitative comparison with experiments across biochemistry. Atomistic simulations can now access experimentally relevant timescales for large systems, leading to a fertile interplay of experiment and theory and offering unprecedented opportunities for validating and developing models. Coarse‐grained methods allow studies on larger length‐ and timescales, and theoretical developments are bringing electronic structure calculations into new regimes. Multiscale methods are another key focus for development, combining different levels of theory to increase accuracy, aiming to connect chemical and molecular changes to macroscopic observables. In this review, we outline biomolecular simulation methods and highlight examples of its application to investigate questions in biology. This article is categorized under: Molecular and Statistical Mechanics > Molecular Dynamics and Monte‐Carlo Methods Structure and Mechanism > Computational Biochemistry and Biophysics Molecular and Statistical Mechanics > Free Energy Method

Developing actively targeted nanoparticles to fight cancer: Focus on italian research

Active targeting is a valuable and promising approach with which to enhance the therapeutic efficacy of nanodelivery systems, and the development of tumor-targeted nanoparticles has therefore attracted much research attention. In this field, the research carried out in Italian Pharmaceutical Technology academic groups has been focused on the development of actively targeted nanosystems using a multidisciplinary approach. To highlight these efforts, this review reports a thorough description of the last 10 years of Italian research results on the development of actively targeted nanoparticles to direct drugs towards different receptors that are overexpressed on cancer cells or in the tumor microenvironment. In particular, the review discusses polymeric nanocarriers, liposomes, lipoplexes, niosomes, solid lipid nanoparticles, squalene nanoassemblies and nanobubbles. For each nanocarrier, the main ligands, conjugation strategies and target receptors are described. The literature indicates that polymeric nanoparticles and liposomes stand out as key tools for improving specific drug delivery to the site of action. In addition, solid lipid nanoparticles, squalene nanoparticles and nanobubbles have also been successfully proposed. Taken together, these strategies all offer many platforms for the design of nanocarriers that are suitable for future clinical translation

DOTA-Derivatives of Octreotide Dicarba-Analogs with High Affinity for Somatostatin sst2,5 Receptors

In vivo somatostatin receptor scintigraphy is a valuable method for the visualization of human endocrine tumors and their metastases. In fact, peptide ligands of somatostatin receptors (sst's) conjugated with chelating agents are in clinical use. We have recently developed octreotide dicarba-analogs, which show interesting binding profiles at sst's. In this context, it was mandatory to explore the possibility that our analogs could maintain their activity also upon conjugation with DOTA. In this paper, we report and discuss the synthesis, binding affinity and conformational preferences of three DOTA-conjugated dicarba-analogs of octreotide. Interestingly, two conjugated analogs exhibited nanomolar affinities on sst(2) and sst(5) somatostatin receptor subtypes

Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds

Biological systems are characterized by a level of spatial and temporal organization that often lies beyond the grasp of present day methods. Light-modulated bioreagents, including analogs of low molecular weight compounds, peptides, proteins, and nucleic acids, represent a compelling strategy to probe, perturb, or sample biological phenomena with the requisite control to address many of these organizational complexities. Although this technology has created considerable excitement in the chemical community, its application to biological questions has been relatively limited. We describe the challenges associated with the design, synthesis, and use of light-responsive bioreagents, the scope and limitations associated with the instrumentation required for their application, and recent chemical and biological advances in this field