Identificación, caracterización parcial y purificación de la UDP : GlC: glicoproteína glucosiltransferasa de hígado de rata, una nueva reacción de procesamiento de glicoproteínas

La N-glicosilación de proteínas se inicia en el retículo endoplásmico con latransferencia de un oligosacárido de estructura Glc3Man9GlcNAc2 desde dolicol-P-Pa polipéptidos nacientes [1]. El oligosacárido unido a la proteína es inmediatamenteprocesado por glucosidasas específicas en el lumen del reticulo endoplásmico. La glucosidasa I hidroliza el residuo de Glc más externo en unión α(1,2) y luego la glucosidasa II hidroliza los dos residuos de Glc más internos en unión α(1,3). Tambiénpueden removerse algunas manosas por acción de manosidasas en el RE. Luego lasglicoproteínas son procesadas a lo largo del camino secretorio por una serie de glicosidasasy glicosiltransferasas, con hidrólisis de restos de manosa, transferencia de N-acetilglucosamina, galactosa, ácido siálico y fucosa, lo que da lugar a la variedadde estructuras encontrada en las glicoproteínas maduras. Por marcación con [14C]glucosa en células de mamíferos, plantas, hongos y tripanosomátidosse detectó la formación de [glucosa-14C]-Glc1Man5-9GlcNAc2 unidosa proteínas [2-10]. Los resultados experimentales indicaban que estos compuestos seformaron en parte por glucosilación de los correspondientes Man5-9GlcNAc2-Prot sinintervención de derivados de dolicol. En todos los casos los restos de Glc fueronremovidos y no aparecieron en las glicoproteínas maduras. Se han hecho algunos estudios en sistemas libres de células con microsomas dehígado de rata para estudiar estas reacciones de glucosilación de oligosacáridosunidos a glicoproteínas [10]. En ellos se aprovecharon los aceptores endógenos presentesen los microsomas utilizados comofuente de actividad glucosilante. Con el objeto de estudiar en detalle esta nueva reacción de procesamiento deglicoproteínas ampliamente distribuida en la naturaleza, en el presente trabajo de Tesis se desarrolló un ensayo in vitro específico para esta serie de reacciones. El ensayoutiliza UDP-[14C]Glc como sustrato dador de restos de Glc radioactivos y unaglicoproteína con oligosacáridos de tipo polimanosa como sustrato aceptor. Las glicoproteínasdeben estar desnaturalizadas para poder actuar como aceptoras. Lareacción necesita Ca++y pH neutro. Mediante este ensayo se detectó la actividad de glucosiltransferasa en microsomasde hígado de rata, porotos, Mucor rouxii, Crithidia fasciculata y Trypanosornacruzi. En el ensayo de actividad de la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa, elresto de Glc es transferido en el mismo tipo de unión α(1,3) y al mismo resto de Manque en el intermediario Glc1Man9GlcNAc2-P-P-dolicol. En Crithidia fasciculata, Leptomonas samueli y Trypanosoma cruzi se encontró una actividad equivalente ala glucosidasa II de otros eucariontes pero no se encontró actividad de glucosidasa I. Estos resultados sugieren que la glucosidasa II es la enzima que hidroliza in vivo losrestos de Glc transferidos por este mecanismo. La actividad se localizó por fraccionamiento subcelular en el reticulo endoplásmico. Utilizando vesículas microsomales intactas de hígado de rata se caracterizóa la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa como una proteína soluble delinterior del retículo endoplásmico: Mostró latencia para la glucosílación de un aceptorexógeno y fue resistente a proteólisis en dichas vesículas. Se la pudo extraersoluble en medio isotónico con bajas concentraciones de detergentes, mediantemétodos mecánicos sin utilizar detergentes y con pH alcalino. Se extrajo en la faseacuosa por partición con Triton X-114. La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa de hígado de rata se purificó ahomogeneidad. En electroforesis desnaturalizante en medio reductor corrió como unaúnica banda de peso molecular aparente 160 kDa y en condiciones nativas se comportócomo un homodímero. La enzima pura exhibió las mismas propiedades observadasen preparaciones crudas al desarrollar el ensayo in vitro: pH óptimo neutro,requerimiento absoluto de Ca++ para su actividad y de UDP-Glc como dador de Glc. Reconoció como sustrato aceptor únicamente a glicoproteínas desnaturalizadas yno a las mismas glicoproteínas en estado nativo. Esto no se debió a una diferenteaccesibilidad del oligosacárido entre la forma nativa y la desnaturalizada sino alreconocimiento por parte de la glucosiltransferasa de algún factor estructural en lasglicoproteínas desnaturalizadas. Se generó un antisuero de conejo contra la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasade hígado de rata capaz de reconocera la proteína desnaturalizada y nativa. Se obtuvo la secuencia de amino ácidos del extremo amino terminal y de fragmentosinternos de la glucosiltransferasa de hígado de rata. Los datos previos junto con los presentados en esta Tesis permiten en conjuntoconfirmar la existencia de un mecanismo de transferencia de un resto de Glc aoligosacáridos de tipo polimanosa en glicoproteínas. La glucosiltransferasa involucrada,una proteína soluble del retículo endoplásmico, reconoce como sustratos a glicoproteínasque aún no han adoptado su estructura nativa. La glucosidasa IIhidroliza el residuo de Glc transferido por ésta glucosiltransferasa. Este ciclo de glucosilación-deglucosilación continuaría hasta que las glicoproteínas adoptan suestructura nativa y dejan de ser sustrato de la glucosiltransferasa.Fil: Trombetta, Eduardo Sergio. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

EDUCAR É SEMPRE UM ATO POLÍTICO: DESAFIOS CONTEMPORÂNEOS

O pensamento que perpassa o texto é de que não é possível separar educação e política. A reflexão situa-sena contribuição de Paulo Freire para o campo da pedagogia e da filosofia da educação a partir da relação entre Educação e Política, sobretudo em tempos de um projeto de sociedade ultraneoliberal. Abordaremos sobre as teses centrais de Freire em mostrar que a educação é um ato político, e o discurso que se esforça em negar esse status para a educação é um discurso ideológico, pois busca encobrir a realidade através de uma pseudoneutralidade da ação educativa. Freire é incisivo em abordar essa questão; entendemos que a clareza de seu pensamento continua a elucidar essa questão em tempos de globalização excludente e da avalanche de visões neotecnicistas em educação, como ocorre nos dias atuais

Developmental Control of Endocytosis in Dendritic Cells by Cdc42

AbstractDendritic cells (DCs) developmentally regulate antigen uptake by controlling their endocytic capacity. Immature DCs actively internalize antigen. However, mature DCs are poorly endocytic, functioning instead to present antigens to T cells. We have found that endocytic downregulation reflects a decrease in endocytic activity controlled by Rho family GTPases, especially Cdc42. Blocking Cdc42 function by Toxin B treatment or injection of dominant-negative inhibitors of Cdc42 abrogates endocytosis in immature DCs. In mature DCs, injection of constitutively active Cdc42 or microbial delivery of a Cdc42 nucleotide exchange factor reactivates endocytosis. DCs regulate endogenous levels of Cdc42-GTP with activated Cdc42 detectable only in immature cells. We conclude that DCs developmentally regulate endocytosis at least in part by controlling levels of activated Cdc42

Quantitative and Dynamic Assessment of the Contribution of the ER to Phagosome Formation

SummaryPhagosomes were traditionally thought to originate from an invagination and scission of the plasma membrane to form a distinct intracellular vacuole. An alternative model implicating the endoplasmic reticulum (ER) as a major component of nascent and maturing phagosomes was recently proposed (Gagnon et al., 2002). To reconcile these seemingly disparate hypotheses, we used a combination of biochemical, fluorescence imaging, and electron microscopy techniques to quantitatively and dynamically assess the contribution of the plasmalemma and of the ER to phagosome formation and maturation. We could not verify even a transient physical continuity between the ER and the plasma membrane, nor were we able to detect a significant contribution of the ER to forming or maturing phagosomes in either macrophages or dendritic cells. Instead, our data indicate that the plasma membrane is the main constituent of nascent and newly formed phagosomes, which are progressively remodeled by fusion with endosomal and eventually lysosomal compartments as phagosomes mature into acidic, degradative organelles

CHMP5 is essential for late endosome function and down-regulation of receptor signaling during mouse embryogenesis

Charged MVB protein 5 (CHMP5) is a coiled coil protein homologous to the yeast Vps60/Mos10 gene and other ESCRT-III complex members, although its precise function in either yeast or mammalian cells is unknown. We deleted the CHMP5 gene in mice, resulting in a phenotype of early embryonic lethality, reflecting defective late endosome function and dysregulation of signal transduction. Chmp5−/− cells exhibit enlarged late endosomal compartments that contain abundant internal vesicles expressing proteins that are characteristic of late endosomes and lysosomes. This is in contrast to ESCRT-III mutants in yeast, which are defective in multivesicular body (MVB) formation. The degradative capacity of Chmp5−/− cells was reduced, and undigested proteins from multiple pathways accumulated in enlarged MVBs that failed to traffic their cargo to lysosomes. Therefore, CHMP5 regulates late endosome function downstream of MVB formation, and the loss of CHMP5 enhances signal transduction by inhibiting lysosomal degradation of activated receptors

The Two Caenorhabditis elegans UDP-Glucose:Glycoprotein Glucosyltransferase Homologues Have Distinct Biological Functions

The UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT) is the sensor of glycoprotein conformations in the glycoprotein folding quality control as it exclusively glucosylates glycoproteins not displaying their native conformations. Monoglucosylated glycoproteins thus formed may interact with the lectin-chaperones calnexin (CNX) and calreticulin (CRT). This interaction prevents premature exit of folding intermediates to the Golgi and enhances folding efficiency. Bioinformatic analysis showed that in C. elegans there are two open reading frames (F48E3.3 and F26H9.8 to be referred as uggt-1 and uggt-2, respectively) coding for UGGT homologues. Expression of both genes in Schizosaccharomyces pombe mutants devoid of UGGT activity showed that uggt-1 codes for an active UGGT protein (CeUGGT-1). On the other hand, uggt-2 coded for a protein (CeUGGT-2) apparently not displaying a canonical UGGT activity. This protein was essential for viability, although cnx/crt null worms were viable. We constructed transgenic worms carrying the uggt-1 promoter linked to the green fluorescent protein (GFP) coding sequence and found that CeUGGT-1 is expressed in cells of the nervous system. uggt-1 is upregulated under ER stress through the ire-1 arm of the unfolded protein response (UPR). Real-time PCR analysis showed that both uggt-1 and uggt-2 genes are expressed during the entire C. elegans life cycle. RNAi-mediated depletion of CeUGGT-1 but not of CeUGGT-2 resulted in a reduced lifespan and that of CeUGGT-1 and CeUGGT-2 in a developmental delay. We found that both CeUGGT1 and CeUGGT2 play a protective role under ER stress conditions, since 10 µg/ml tunicamycin arrested development at the L2/L3 stage of both uggt-1(RNAi) and uggt-2(RNAi) but not of control worms. Furthermore, we found that the role of CeUGGT-2 but not CeUGGT-1 is significant in relieving low ER stress levels in the absence of the ire-1 unfolding protein response signaling pathway. Our results indicate that both C. elegans UGGT homologues have distinct biological functions

Production of He-4 and (4) in Pb-Pb collisions at root(NN)-N-S=2.76 TeV at the LHC

Results on the production of He-4 and (4) nuclei in Pb-Pb collisions at root(NN)-N-S = 2.76 TeV in the rapidity range vertical bar y vertical bar <1, using the ALICE detector, are presented in this paper. The rapidity densities corresponding to 0-10% central events are found to be dN/dy4(He) = (0.8 +/- 0.4 (stat) +/- 0.3 (syst)) x 10(-6) and dN/dy4 = (1.1 +/- 0.4 (stat) +/- 0.2 (syst)) x 10(-6), respectively. This is in agreement with the statistical thermal model expectation assuming the same chemical freeze-out temperature (T-chem = 156 MeV) as for light hadrons. The measured ratio of (4)/He-4 is 1.4 +/- 0.8 (stat) +/- 0.5 (syst). (C) 2018 Published by Elsevier B.V.Peer reviewe