ANCA patients have T cells responsive to complementary PR-3 antigen

Some patients with proteinase 3 specific anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies (PR3-ANCA) also have antibodies that react to complementary-PR3 (cPR3), a protein encoded by the antisense RNA of the PR3 gene. To study whether patients with anti-cPR3 antibodies have cPR3-responsive memory T cells we selected conditions that allowed cultivation of memory cells but not naïve cells. About half of the patients were found to have CD4+TH1 memory cells responsive to the cPR3138-169-peptide; while only a third of the patients had HI-PR3 protein responsive T cells. A significant number of T cells from patients responded to cPR3138-169 peptide and to HI-PR3 protein by proliferation and/or secretion of IFN-γ, compared to healthy controls while there was no response to scrambled peptide. Cells responsive to cPR3138-169-peptide were not detected in MPO-ANCA patients suggesting that this response is specific. The HLADRB1* 15 allele was significantly overrepresented in our patient group and is predicted to bind cPR3138-169 peptide with high affinity. Regression analysis showed a significant likelihood that anti-cPR3 antibodies and cPR3-specific T cells coexist in individuals, consistent with an immunological history of encounter with a PR3-complementary protein. We suggest that the presence of cells reacting to potential complementary protein pairs might provide an alternative mechanism for auto-immune diseases

Study of the idiotypic/anti-idiotypic antibody network in BALB/c mice post immunization with B and T cell epitopes of La/SSB

The study of autoimmune experimental models has shown that the development of the id/anti-id network may regulate the progress of the disease. La/SSB protein is an autoantigen involved in various autoimmune diseases like SLE (Systemic Lupus Erythematosus) and SS (Sjogren’s Syndrome). The aim of this essay was to study the id/anti-id network that was developed in BALB/c mice immunized with the epitopes pep289-308, pep349-364, cpep289-308, or cpep349-364. As a first step, we investigated the immunogenicity of the above peptides in non autoimmune BALB/c and CBA mice. We also defined the best immunization dose for each peptide, the route of injection and the total number of the boosts. Afterwards we looked into the possible development of the idiotypic/anti-idiotypic network and also the relation between these two types of antibodies. We found out that the administration of mice with pep289-308 caused the massive production of specific anti-pep289-308 idiotypic antibodies and also anti-cpep289- 308 anti-idiotypic antibodies. Similarly, mice immunized with cpep289-308 produced anti-cpep (idiotypic) and also anti-pep289-308 (anti-idiotypic) antibodies. These data were confirmed with competitive ELISA assays. Similar studies were also carried out for the epitopes pep349-364 and cpep349-364. Our data showed that immunization of BALB/c mice with these peptides did not induce the production of anti-idiotypic antibodies. Further investigation in antibodies production during a long period (up to 184 days), revealed many aspects of the id/anti-id antibodies relationship giving more information about the mechanism that is evolved in the development of the network. According to the literature, antibodies specific for the antigen (idiotypic) may play the role of antigen for the immune system, and may provoke the production of anti- idiotypic antibodies specific for the idiotypic ones. The delay, in the production of anti-idiotypic antibodies that observed in our experiments, is consistent with the theory mentioned above. In order to study better the mechanism of the development and the maintenance of the id/anti-id network, we produced a monoclonal antibody, specific for the cpep289-308 epitope. The use of this mAb in our experiments, confirmed the idiotypic/anti-idiotypic relationship of the produced antibodies. Since the peptides pep289-308 and pep349-364 are linear epitopes of the autoantigen La/SSB, we investigated the reactivity of mice anti-sera with the whole protein of La/SSB. We found out that sera of mice immunized with pep289-308 or pep349-364 recognized the immobilized La/SSB molecule. Most likely the anti-sera antibodies recognized the corresponding epitopes (pep289-308, pep349-364), as a part of the whole molecule. In parallel, we considered to study the phenomenon of intramolecular spreading that is often observed in autoimmune disorders and diseases. Our investigation revealed that the immunization of BALB/c mice with the peptides pep289-308 and cpep289-308 induced intramolecular spreading into the other epitope of La/SSB, 349-364. Given that the development and maintenance of the idiotypic/anti-idiotypic network is based on the cooperation of B and T cells, we investigated for the creation of T-cell clones specific for peptide-epitopes. We observed that the pep289-308 and cpep289-308 sensitized T cells respond positively to both peptides in in vitro experiments. This result indicates that probably the in vivo creation of T cells specific for each peptide is occurred independently. We also determined the type of the response through the determination of two representative cytokines IL-4 and IFN-γ. Data showed that the idiotypic response for each peptide was mixed TH1/TH2, while the anti-idiotypic response was TH2 type only.Σε πειραματικά μοντέλα αυτοάνοσων ασθενειών έχει διαπιστωθεί πως η ανάπτυξη ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου μπορεί να ρυθμίσει την εξέλιξη της νόσου. Η La/SSB πρωτεΐνη είναι ένα αυτοαντιγόνο, το οποίο φαίνεται να εμπλέκεται σε αυτοάνοσες ασθένειες όπως ο SLE και το SS. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου που αναπτύσσεται σε BALB/c ποντίκια, μετά από ανοσοποίηση με τους επιτόπους της La/SSB πρωτεΐνης pep289-308 και pep349-364 καθώς και τις συμπληρωματικές τους μορφές (cpep289- 308 και cpep349-364 αντίστοιχα). Σε πρώτο στάδιο μελετήθηκε η ανοσογονικότητα των τεσσάρων προαναφερθέντων πεπτιδίων σε μη αυτοάνοσα ποντίκια της φυλής BALB/c και CBA. Επίσης προσδιορίστηκαν η άριστη δόση ανοσοποίησης για κάθε πεπτίδιο, ο βέλτιστος τρόπος χορήγησης των αντιγόνων και ο αριθμός των αναμνηστικών δόσεων. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η δημιουργία του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου και μελετήθηκαν οι ιδιότητες των παραγόμενων αντισωμάτων. Από τα αποτελέσματα των πειραμάτων διαπιστώθηκε πως ο επίτοπος 289-308, όταν χορηγήθηκε στα πειραματόζωα, προκάλεσε την παραγωγή ιδιοτυπικών αντι-pep289- 308 αλλά και αντι-ιδιοτυπικών αντι-cpep289-308 αντισωμάτων. Παρόμοια αποτελέσματα έδωσε και η ανοσοποίηση με το συμπληρωματικό πεπτίδιο cpep289- 308, κατά την οποία παράχθηκαν αντι-cpep289-308 (ιδιοτυπικά) αντισώματα, αλλά και αντι-pep289-308 (αντι-ιδιοτυπικά) αντισώματα. Η ειδικότητα των συγκεκριμένων αντισωμάτων επιβεβαιώθηκε με ειδικές δοκιμασίες ανταγωνιστικής ELISA. Ανάλογες μελέτες πραγματοποιήθηκαν και για το ζευγάρι των πεπτιδίων pep349-364 και cpep349-364. Από τα αποτελέσματα διαπιστώθηκε πως η ανοσοποίηση των BALB/c ποντικών με τους συγκεκριμένους επιτόπους δεν οδηγεί στην παραγωγή αντι-ιδιοτυπικών αντισωμάτων. Η περαιτέρω μελέτη της κινητικής των παραγόμενων αντισωμάτων, έδωσε επιπλέον πληροφορίες για τη σχέση τους και βοήθησε στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δημιουργίας του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου. Σύμφωνα με το μηχανισμό τα ιδιοτυπικά αντισώματα αποτελούν εκ νέου αντιγόνα για το ανοσοποιητικό σύστημα, με αποτέλεσμα την παραγωγή των αντι-ιδιοτυπικών αντισωμάτων. Η χρονική υστέρηση που παρατηρήθηκε στην εμφάνιση των αντι-ιδιοτυπικών αντισωμάτων σε σχέση με την παραγωγή των ιδιοτυπικών, συμφωνεί με την πιο πάνω θεωρία. Με στόχο την καλύτερη μελέτη της δημιουργίας και διατήρησης του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου παράχθηκε μονοκλωνικό αντίσωμα ειδικό για το συμπληρωματικό πεπτίδιο cpep289-308. Στα πειράματα μας με τη χρήση του συγκεκριμένου αντι-cpep289-308 μονοκλωνικού αντισώματος επιβεβαιώθηκε η ιδιοτυπική/αντι-ιδιοτυπική σχέση των αντι-pep289-308 με τα αντι-cpep ειδικά αντισώματα. Οι οροί των ποντικών που ανοσοποιήθηκαν με τα πεπτίδια pep289-308 ή pep349-364, ελέγχθηκαν και έναντι ολόκληρου του μορίου της La/SSB και διαπιστώθηκε πως μπορούν να αναγνωρίζουν το ακινητοποιημένο μόριο της ανθρώπινης πρωτεΐνης σε ειδική δοκιμασία ELISA. Πολύ πιθανόν τα αντισώματα του ορού να αναγνώρισαν τους αντίστοιχους επίτοπους (pep289-308 και pep349-364) ως τμήμα ολόκληρου του μορίου. Παράλληλα θεωρήθηκε σκόπιμο να μελετηθεί και το φαινόμενο της ενδομοριακής εξάπλωσης, το οποίο παρατηρείται πολύ συχνά σε περιπτώσεις αυτοάνοσων καταστάσεων και ασθενειών. Η μελέτη έδειξε πως η ανοσοποίηση των BALB/c ποντικών με τα πεπτίδια pep289-308 και cpep289-308 οδηγεί σε ενδομοριακή εξάπλωση και στον άλλο επίτοπο της La/SSB, τον 349-364. Με δεδομένο πως η ανάπτυξη και η διατήρηση του ιδιοτυπικού/αντι-ιδιοτυπικού δικτύου βασίζεται στη συνεργασία Β και Τ κυττάρων, ελέγχθηκε η δημιουργία ειδικών Τ κυτταρικών κλώνων για τα εν λόγω πεπτίδια. Παρατηρήθηκε πως τα ευαισθητοποιημένα από τα pep289-308 και cpep289-308 Τ λεμφοκύτταρα αποκρίνονται θετικά in vitro και στα δύο πεπτίδια. Αυτό το αποτέλεσμα πιθανόν δείχνει την in vivo ανάπτυξη πληθυσμών Τ λεμφοκυττάρων ειδικών για το κάθε πεπτίδιο ξεχωριστά. Θεωρήθηκε επίσης αναγκαίος ο προσδιορισμός του τύπου απόκρισης μέσω ανίχνευσης δύο αντιπροσωπευτικών κυτοκινών, της IL-4 και της IFN-γ. Βρέθηκε πως η ιδιοτυπική απόκριση για όλα τα πεπτίδια ήταν μικτή TH1/TH2, ενώ η αντι-ιδιοτυπική απόκριση μόνο TH2

Idiotype-anti-idiotype circuit in non-autoimmune mice after immunization with the epitope and complementary epitope 289-308aa of La/SSB: Implications for the maintenance and perpetuation of the anti-La/SSB response

Background: Antibodies to La/SSB are usually found in sera of patients with Sjogren's Syndrome (SS) and Systemic Lupus Erythematosus (SLE). Recent work from our laboratory (Mol Med 2002;8:293-305) revealed that an active idiotypic network involving antibodies to epitopes of La/SSB and their anti-idiotypes exist in human sera. The anti-idiotypic antibodies were detected using complementary peptides to B-cell epitopes of the autoantigen. The principle of the complementary peptides is based on the 'molecular recognition' theory. According to this theory, translation of two complementary RNA strands (coding and non-coding strand) into protein, generate a pair of peptides, which bind each other with specificity and high affinity. Aim: To investigate antibody production and T-cell responses in non-autoimmune-susceptible animal strains which were immunized with the epitope 289-308aa of La/SSB as well as its complementary epitope. Materials and Methods: Balb/c mice were immunized with a peptide corresponding to epitope 289-308aa (pep) or its complementary (cpep) peptide (5 animals/group). The sera were tested for the presence of antibodies to pep and cpep as well as for epitope spreading to recombinant human La/SSB and a major B-cell epitope of La/SSB spanning the region 349-364aa. Another group of animals was sacrificed on day 10 and T-cell responses against pep and cpep were evaluated in cells from lymph nodes and spleen. Results: Immunizations with either pep or cpep led to the appearance of antibodies against the immunogen peptide by day 31 which subsequently was followed by antibody production to its complementary peptide by day 55. In two out of five animals immunized with the epitope 289-308aa, a spreading of the immune response to epitope 349-364aa was observed. In the remaining three animals, negative for antibodies to pep349-364, a specific treatment of sera, using cpep349-364 revealed that anti-idiotypic antibodies masked antibodies to pep349-364. In all immunization experiments high T-cell proliferative responses to both pep and cpep peptides were detected. Conclusions: Complementary peptides to epitopes of La/SSB can be utilized as probes to study the development of an idiotypic-anti-idiotypic network towards the major autoantigen. The ability of pep and cpep peptides to induce both B-cell and T-cell responses may provide useful insights into understanding further the initiation and maintenance of autoimmune response and create new tools for therapeutic intervention. © 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved