The pathological study on membranous nephropathy in dogs with special reference to phospholipase A2 receptor in the podocytes

イヌの膜性腎症（MN）はヒトとの類似性の高い代表的な糸球体疾患であるとともに、高い発生頻度を示す重要な腎疾患である。成人のMNは、先行する疾患のない特発性（原発性）MNと感染症や腫瘍、薬剤、全身性疾患などに続発する続発性（二次性）MNとに分類されている。さまざまなモデル動物を用いた研究やヒトの新生児MNの研究などから、ヒトの特発性MNでは、糸球体足細胞足突起表面に存在するunknownな自己抗原に循環血中の自己抗体が結合することで引き起こされるin situでの免疫複合体（Immune complex：IC）形成が発病機序として考えられてきた。近年、ヒトの足細胞に発現するphospholipase A2 receptor （PLA2R）に対する自己抗体が特発性MN患者血中に高率に検出され、PLA2Rがヒトの特発性MNにおける自己抗原の候補分子として注目を集めている。一方、イヌのMNは病理組織学的・臨床病理学的にはヒトのMNに類似するが、発生機序については全く検討されていない。　本研究では、イヌのMNの病態解明に資することを目的として、ヒトの特発性MNにおいて病理発生との関連性が指摘されているICの沈着部位、イヌのPLA2Rの遺伝子解析と全身における発現、正常犬・MN症例の糸球体におけるPLA2R発現を解析した。さらに初代培養足細胞を用い、イヌの足細胞がPLA2Rを発現していることをヒト以外の動物の腎臓で初めて明らかにした。第一章　MN症例の免疫複合体の沈着部位　MNにおいて糸球体係蹄壁の上皮下にIC集積部と考えられるdense deposit (DD)の沈着がみられることは重要な特徴所見であるが、イヌのMNにおいて上皮下以外への沈着に言及した報告は少ない。本章ではイヌの腎生検症例のうちMNと確定診断した 8症例について、透過型電子顕微鏡を用い各症例2つ以上の糸球体の観察し、DD沈着様式を超微形態学的に精査した。その結果、半数の症例（4例）ではDDの沈着は上皮下のみであったのに対し、半数の症例では上皮下に加え、内皮下またはメサンギム領域にも沈着を認めた。　ヒトのMNに関する過去の多くの研究が示すように、上皮下に限局したDDの沈着は足突起上の抗原に対する自己抗体の結合によるin situでのICの形成を示唆する。一方、上皮下以外の部位への沈着は続発性MNにおける循環ICの沈着を示唆する重要な所見の一つとなる。本章ではイヌのMNにおいて異なるDD沈着パターンが存在すること、イヌのMNにおいても異なる発生機序を持つ症例が含まれる可能性があることを初めて示唆した。第二章　正常犬の糸球体におけるPLA2Rの局在とMN症例におけるPLA2Rの発現変化　第一章の結果から、一部のMN症例ではin situでのICの形成機序が疑われたため、ヒトと同様にPLA2Rに関連したMNがイヌにも存在するかを検討することを本章の目的とした。現在までにイヌの糸球体におけるPLA2Rの発現に関する報告はなく、本章では正常犬の糸球体から得られたPLA2R遺伝子のクローニングを行った。さらに、免疫蛍光法（IF）により正常犬の糸球体における詳細なPLA2Rの局在を明らかにするとともに、MN症例の糸球体におけるPLA2Rの発現変化を検討した。2-1　PLA2Rの発現分布およびアミノ酸配列の同定　正常なビーグル犬の全身諸臓器および単離糸球体からTotal RNAを抽出、cDNAを作成し、PLA2Rの部分配列についてRT-PCRを行った。また単離糸球体からPLA2R全長配列をクローニングし、シークエンス解析・相同性検索を行った。RT-PCRでは多臓器において特異的なバンドが得られたが、特に肺、脾臓、大腸、生殖器、腎臓および単離糸球体において強い陽性シグナルが得られた。またイヌのPLA2Rはヒトと相同性が高く（86%）、予想されるモチーフ構造はヒトと同様であった。2-2　正常糸球体におけるPLA2Rの発現・局在　正常なビーグル犬の腎臓凍結切片を用い、IFによりPLA2Rの発現を調べた。また糸球体におけるPLA2Rの詳細な局在を検索するために、糸球体基底膜の構成要素であるIV型コラーゲンおよび足細胞の足突起、細胞質にそれぞれ存在するpodocin、vimentinとの二重染色を行った。さらに2-1で得られた遺伝子配列情報からPLA2Rに特異的なプローブ作成し、パラフィン切片を用いたIn situ hybridization（ISH）法を実施した。また単離糸球体からの抽出タンパク質を用いPLA2Rに対するWestern Blotting (WB)をおこなった。IFの結果、PLA2R陽性シグナルは糸球体で足細胞パターンを示し、podocinと共局在し、vimentinの内側、IV型コラーゲンの外側に沿うように存在していた。ISH法では糸球体に特異的なシグナルが得られ、WBにおいてもPLA2Rに特異的なバンドが得られた。2-3　MN症例犬の糸球体におけるPLA2Rの発現　第一章で用いたMN症例8例のうちの5症例とその他の免疫介在性の糸球体疾患として膜性増殖性糸球体腎炎2症例、非免疫介在性糸球体腎症2症例の生検組織についてPLA2RのIFによる観察を行った。その結果、第一章において上皮下のみにDD沈着が認められたMN4症例のうち検索できた2症例の糸球体においてPLA2Rの明らかな発現増加が認められた。上皮下以外にもICの沈着が認められたMN2症例およびその他の糸球体疾患では発現増加は認められなかった。　本章では全長配列、モチーフ構造、組織分布などのイヌのPLA2Rに関する基礎的情報を示し、IFおよびISHからイヌの腎糸球体におけるPLA2Rの発現を初めて明らかにした。また二重免疫染色でPLA2Rがpodocinと共局在したことから、ヒトと同様にイヌの糸球体、特に足細胞の足突起にPLA2Rが存在していることを示唆した。また、ヒトの特発性MNにおいて、糸球体におけるPLA2Rの発現上昇が血中抗PLA2R自己抗体の存在と一致して認められることが報告されていが、本章でPLA2Rの発現上昇がみられた2症例ではDDの沈着も上皮下に限局しており、これらの結果はイヌのMNにおいても一部の症例ではヒトの特発性MNと同様の発生機序が存在する可能性を示唆するものであると考えられた。第三章　イヌの足細胞初代培養法の確立と培養足細胞のPLA2R発現　第二章では糸球体におけるPLA2Rの発現を明らかにしIFにより足細胞に発現している可能性を示したが、本章では足細胞における発現を証明することを目的とした。そこで本章ではラット足細胞の初代培養に用いられる磁気ビーズ法を用い正常犬の足細胞の培養を試み、足細胞特異タンパク質およびPLA2Rの発現を解析した。正常なビーグル犬3頭から採材した腎臓を鉄粉を含むPBSで潅流した後、皮質組織を細切し、collagenaseで処理。250µmメッシュで濾した後、鉄を含む糸球体をマグネットおよび100µmメッシュ上にトラップすることで糸球体を回収した。この回収した糸球体を37℃、3日間培養し、その周囲に増殖している細胞について、nephrin、podocin、synaptopodin およびPLA2RのIF観察を行った。WBおよびRT-PCRにはトリプシンを用い細胞を剥離し、40µmメッシュで濾し残存する糸球体を取り除いたのちに、もう1日培養した培養足細胞を用いた。回収された糸球体の純度は高く、初代培養2日以内に糸球体より細胞が伸長し、3-4日目には糸球体の間を埋めるように細胞の遊出・伸長が認められた。培養細胞はIFおよびRT-PCRにおいて足細胞特異タンパク質（nephrin、podocin、synaptopodin）を発現しており、足細胞であることが確認された。同時にこれらの細胞がPLA2Rを発現していることも、IF、RT-PCRおよびWBによって確認した。　本章では糸球体より遊出する培養足細胞は足細胞特異タンパク質を発現しており、初めてイヌの足細胞を培養することに成功した。また初代培養足細胞はPLA2Rを発現しており、第二章で示唆されたイヌの足細胞でのPLA2R発現を証明した。【総括】　イヌにおいてMNは重要な糸球体疾患の一つであるが、その病理発生機序はこれまでまったく研究されてこなかった。本研究では蛋白尿を呈したイヌのMN腎生検症例においてICの異なる沈着パターンの存在を示し、イヌのMNが異なる病理発生機序によるものを含んでいる可能性を示唆した。さらに、イヌの糸球体におけるPLA2Rの発現・局在を明らかにし、ヒトの特発性MNに類似した糸球体におけるPLA2Rの発現上昇を一部のイヌMN症例において認めたことから、イヌのMNにおいてもPLA2Rを抗原とするin situ IC形成が引き金となる病態が存在する可能性が考えられた。また足細胞におけるPLA2R発現はヒトでのみの報告されており、現在までにPLA2Rを抗原としたMNのモデル動物は存在していない。本研究で示したイヌの足細胞におけるPLA2R発現とMN症例の糸球体におけるその高発現は、特発性MNの病態モデルとしてのイヌの可能性を示す重要な新知見である。IntroductionMembranous nephropathy (MN) is a major immune complex-mediated glomerulonephritis (ICGN) and can be grouped into idiopathic (primary) type and secondary type of MN in human. Phospholipase A2 receptor (PLA2R) is expressed in the glomerular podocytes of human kidney. Anti-PLA2R autoantibodies were discovered in the majority of patients with idiopathic MN. Also, enhanced glomerular expression of PLA2R is reported in most patients of the disease. Therefore, PLA2R is suggested to be causative autoantigen of human idiopathic MN. On the other hands, PLA2R is expressed minimal or absent in murine and rat podocytes. Because a suitable animal model of PLA2R -associated glomerular disease has not been established, the function of this receptor in podocytes, and whether the circulating autoantibodies actually bind PLA2R on podocytes, remains unclear.In dogs, MN is a major spontaneous glomerular disease and its histological and clinical characteristics are analogous to idiopathic MN in humans. However, there are no reports describing the expression of PLA2R in canine podocytes, and the pathogenesis of canine MN has not been investigated. In this study, the author hypothesized that some case of canine MN might be induced by the autoimmune mechanism in common with human idiopathic MN.Chapter 1Human MN can be grouped into idiopathic (primary) type and secondary type. In electron microscopy, the dense deposits are usually limited in subepithelial area in idiopathic MN, while these are observed also in subendothelial and mesangial area in addition to subepithelial area in secondary MN. In this chapter, the author investigated the localization of immune deposits in 8 cases of MN dogs by electron microscopy. In 4 cases, the deposits were limitedly observed in subepithelial area. In another 4 cases, subendothelial and mesangial deposition was also observed. In this study, the author demonstrated some cases of canine MN exhibiting restrictive subepithelial localization of dense deposits, which is consistent with characteristic finding in human idiopathic MN. Chapter 2In this chapter the author performed gene cloning and motif analysis for canine PLA2R obtained from normal glomeruli and investigated the expression and detailed localization of PLA2R in normal glomeruli and a MN cases dogs by immunofluorescence (IF). The author provided fundamental information that canine PLA2R obtained has high homology and common extracellular structures with human PLA2R. In addition to expression of PLA2R in normal glomeruli, the author demonstrated increased expression of PLA2R in some cases of MN dog showing idiopathic deposition pattern in chapter 1. Similar altered expression of PLA2R was reported in human idiopathic MN, in association with the presence of serum anti- PLA2R auto-antibody. The results in this chapter may support the author’s hypothesis that some canine MN cases may be autoimmune mechanism associated with PLA2R as an autoantigen expressed in podocyte.Chapter 3In the previous chapter, the author revealed glomerular expression of PLA2R in dogs. The object in this chapter is to establish the method of podocyte primary culture for dogs and to confirm the expression of PLA2R in the canine cultured podocyte. The author succeeded in effective isolation of glomeruli from canine kidney by modifying the method for rat. Canine cultured podocytes in the present study distinctly expressed PLA2R in addition to several podocyte-specific markers, including nephrin, podocin and synaptopodin. The podocyte expression of PLA2R was confirmed by reverse transcriptase polymerase chain reaction, western blotting and IF in dogs. The in-vitro experiment provided from this method may contribute to progression of investigation for canine glomerular disease including MN.ConclusionIn this study, the author revealed new findings on ultrastructural feature of canine MN and PLA2R expression in glomerular podocytes of dogs as follows. 1. Canine MN showed two different deposition patterns of dense deposit in the glomeruli resembling human idiopathic or secondary MN. This may suggest the presence of different pathogenesis in canine MN as suspected in human MN.2. Canine PLA2R obtained from the glomeruli has high homology and common extracellular structures with human PLA2R. 3. Canine PLA2R is expressed in podocyte and distributed on the foot process in tissue sections. This is important finding suggesting the possibility of dogs as an animal model of human idiopathic MN. Because PLA2R is not expressed in the podocytes of rodents, rabbits and no experimental or spontaneous animal models for idiopathic MN have been established, so far. 4. The increased expression of PLA2R, which is feature of human idiopathic MN associated with PLA2R, demonstrated in some of MN dog cases with idiopathic ultrastructural pattern of dense deposit. These results may support the author’s hypothesis that some canine MN cases are autoimmune disease associated with PLA2R as an autoantigen expressed in podocyte.5. The primary culture method for canine podocyte expressed several podocyte specific proteins was established. The in vitro experiment provided from this method may contribute to progression of investigation for canine glomerular disease including MN.These results may support the author’s hypothesis that some canine MN cases are autoimmune disease associated with PLA2R as an autoantigen expressed in podocyte. In addition, the author established the primary culture method for canine podocyte. The in vitro experiment provided from this method may contribute to progression of investigation for canine glomerular disease including MN.博士(獣医学)麻布大

腎生検を行った蛋白漏出性腎疾患の犬2例，猫1例における比較検討

高度蛋白尿を呈す犬2例，猫1例について腎生検を行い，病理学的変化，治療経過および予後を比較した。　病理学的変化は，病変なし（糸球体微小変化型病変の疑い），膜性増殖性糸球体腎炎（MPGN），巣状分節性硬化（FSGS）の疑いであった。MPGNの症例は急性経過をとり死亡し，他の2例は長期生存した。　生存した2症例にはACEI （アンギオテンシン変換酵素阻害剤）およびシクロスポリンによる治療を行った。UPCの推移や治療反応は一様ではなかった。　獣医療域において蛋白漏出性腎疾患には多様な病態が含まれていることが示唆され，糸球体障害の種類や障害の程度の把握などに腎生検が有益であった。　一方で臨床症状と生検結果に沿った適切な薬剤の選択には更なる検討が必要であり，今後は症例数を重ねて更なる検討が必要であると考えられた。A cat and two dogs with severe proteinuria underwent renal biopsy for pathological diagnosis, and their clinical outcome and prognosis were compared. Their pathological findings were all different: no abnormality (suspected of minimal change glomerular disease); membranoproliferative glomerulonephritis (MPGN) and suspected focal segmental glomerulosclerosis. The dog with MPGN died in an acute course. They were treated with angiotensin-converting enzyme inhibitor and cyclosporine. The urine protein-to-creatinine ratio and response to treatment were not consistent in these cases. These results suggest that protein-losing nephropathy may present various pathological forms in small animalsand thus renal biopsy is essential for understanding the pathological process of the disease. Further research is needed to determine the best drug of choice based on the clinical symptoms and biopsy results

Evidence for Direct CP Violation in B0 -> K+- pi-+ Decays

We report evidence for direct CP violation in the decay B0 -> K+-pi-+ with 253/fb of data collected with the Belle detector at the KEKB e+e- collider. Using 275 million B B_bar pairs we observe a B -> K+-pi-+ signal with 2140+-53 events. The measured CP violating asymmetry is Acp(K+-pi-+) = -0.101+-0.025 (stat)+-0.005 (syst), corresponding to a significance of 3.9 sigma including systematics. We also search for CP violation in the decays B+- -> K+-pi0 and B+- -> pi+-pi0. The measured CP violating asymmetries are Acp(K+-pi0) = 0.04+-0.05(stat)+-0.02(syst) and Acp(pi+-pi0) = -0.02+-0.10(stat)+-0.01(syst), corresponding to the intervals -0.05 < Acp(K+-pi0) < 0.13 and -0.18<Acp(pi+-pi0)<0.14 at 90% confidence level.Comment: 9 pages, 3 figures. submitted to Physical Review Letter

Time-resolved serial femtosecond crystallography reveals early structural changes in channelrhodopsin

X線自由電子レーザーを用いて、光照射によるチャネルロドプシンの構造変化の過程を捉えることに成功. 京都大学プレスリリース. 2021-03-26.Channelrhodopsins (ChRs) are microbial light-gated ion channels utilized in optogenetics to control neural activity with light . Light absorption causes retinal chromophore isomerization and subsequent protein conformational changes visualized as optically distinguished intermediates, coupled with channel opening and closing. However, the detailed molecular events underlying channel gating remain unknown. We performed time-resolved serial femtosecond crystallographic analyses of ChR by using an X-ray free electron laser, which revealed conformational changes following photoactivation. The isomerized retinal adopts a twisted conformation and shifts toward the putative internal proton donor residues, consequently inducing an outward shift of TM3, as well as a local deformation in TM7. These early conformational changes in the pore-forming helices should be the triggers that lead to opening of the ion conducting pore

Glycomics Analysis of Mammalian Heparan Sulfates Modified by the Human Extracellular Sulfatase HSulf2

The Sulfs are a family of endosulfatases that selectively modify the 6O-sulfation state of cell-surface heparan sulfate (HS) molecules. Sulfs serve as modulators of cell-signaling events because the changes they induce alter the cell surface co-receptor functions of HS chains. A variety of studies have been aimed at understanding how Sulfs modify HS structure, and many of these studies utilize Sulf knockout cell lines as the source for the HS used in the experiments. However, genetic manipulation of Sulfs has been shown to alter the expression levels of HS biosynthetic enzymes, and in these cases an assessment of the fine structural changes induced solely by Sulf enzymatic activity is not possible. Therefore, the present work aims to extend the understanding of substrate specificities of HSulf2 using in vitro experiments to compare HSulf2 activities on HS from different organ tissues.To further the understanding of Sulf enzymatic activity, we conducted in vitro experiments where a variety of mammalian HS substrates were modified by recombinant human Sulf2 (HSulf2). Subsequent to treatment with HSulf2, the HS samples were exhaustively depolymerized and analyzed using size-exclusion liquid chromatography-mass spectrometry (SEC-LC/MS). We found that HSulf2 activity was highly dependent on the structural features of the HS substrate. Additionally, we characterized, for the first time, the activity of HSulf2 on the non-reducing end (NRE) of HS chains. The results indicate that the action pattern of HSulf2 at the NRE is different compared to internally within the HS chain.The results of the present study indicate that the activity of Sulfs is dependent on the unique structural features of the HS populations that they edit. The activity of HSulf2 at HS NREs implicates the Sulfs as key regulators of this region of the chains, and concomitantly, the protein-binding events that occur there

Evidence for direct CP violation in B-0 -> K+pi(-) decays

We report evidence for direct CP violation in the decay B-0-->K(+)pi(-) with 253 fb(-1) of data collected with the Belle detector at the KEKB e(+)e(-) collider. Using 275x10(6) B(B) over bar pairs we observe a B-->K(+/-)pi(-/+) signal with 2140+/-53 events. The measured CP violating asymmetry is A(CP)(K(+)pi(-))=-0.101+/-0.025(stat)+/-0.005(syst), corresponding to a significance of 3.9sigma including systematics. We also search for CP violation in the decays B+-->K(+)pi(0) and B+-->pi(+)pi(0). The measured CP violating asymmetries are A(CP)(K(+)pi(0))=0.04+/-0.05(stat)+/-0.02(syst) and A(CP)(pi(+)pi(0))=-0.02+/-0.10(stat)+/-0.01(syst), corresponding to the intervals -0.05< A(CP)(K(+)pi(0))<0.13 and -0.18< A(CP)(pi(+)pi(0))<0.14 at 90% confidence level

The Physics of the B Factories

This work is on the Physics of the B Factories. Part A of this book contains a brief description of the SLAC and KEK B Factories as well as their detectors, BaBar and Belle, and data taking related issues. Part B discusses tools and methods used by the experiments in order to obtain results. The results themselves can be found in Part C