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Bacteriological and molecular epidemiological studies of invasive pneumococcal disease-derived Streptococcus pneumoniae in Tokyo, Japan

麻布大学博士(学術)Streptococcus pneumoniae, a major pathogen responsible for respiratory infections, occasionally causes severe diseases such as meningitis and sepsis. When S. pneumoniae is isolated from sterile sites such as the blood or cerebrospinal fluid, the infection is classified as invasive pneumococcal disease (IPD), a Category 5 disease under Japan’s Infectious Disease Control Law. The bacterial capsule is a major virulence factor of S. pneumoniae and determines its serotype, and more than 100 serotypes have been identified to date. In Japan, multivalent vaccines targeting multiple serotypes have been introduced as part of routine vaccination programs, leading to a considerable reduction in IPD cases. However, there has been a shift in the serotype distribution causing IPD, with some non-vaccine serotypes now emerging as a growing concern. In particular, serogroup 24, which has become one of the dominant serotypes among IPD isolates following vaccine introduction, has not been sufficiently analyzed. Additionally, the antimicrobial susceptibility of S. pneumoniae indicates a decreasing rate of resistance to penicillin (PCG). Continuous monitoring of epidemiological trends, serotypes, and antimicrobial susceptibilities of S. pneumoniae is crucial for evaluating vaccine efficacy and selecting antibiotics during treatment. In this study, we analyzed 780 S. pneumoniae strains isolated from medical institutions in Tokyo between October 2013 and December 2022. Of these, 398 were from pediatric patients aged 0–14 years and 382 from adults aged 21–98 years. The study period was divided into three phases—Periods 1 (2013-2016), 2 (2017-2019), and 3 (2020-2022). Serotyping and antimicrobial susceptibility testing were conducted, and molecular epidemiological analysis focused on serogroup 24, including serotype 24F, which has become one of the major serotypes in IPD isolates since the introduction of the vaccine. The findings are summarized below. 1) Comparison of clinical symptoms and vaccination history The most common symptoms across all ages were bacteremia of unknown origin (38.1%), followed by pneumonia (29.6%) and meningitis (12.1%). When comparing clinical symptoms between children and adults, pneumonia was more common in adults, whereas otitis media, respiratory symptoms, and bacteremia were more common in children. These findings highlight the differences in the clinical manifestations of IPD between children and adults. Regarding vaccination history, 90.7% of pediatric patients had been vaccinated, whereas only 10.5% of adult patients had been vaccinated. Although the vaccination rate among adults eligible for vaccination has been reported to be 34% to 49%, the low vaccination coverage among adults in this study suggests an increased risk of infection. 2) Serotype distribution and antimicrobial susceptibility A total of 42 serotypes were identified across all periods. The most common serotype among pediatric strains was 24F (17.3%), followed by 15A and 24B. In contrast, the most common serotype among adult strains was 3 (13.6%), followed by 12F and 19A, indicating that the distribution of serotypes differs between children and adults. The prevalence of serotype 19A, included in the PCV13 vaccine (13-valent pneumococcal conjugate vaccine for children), decreased from Period 1 to Period 2, whereas the prevalence of 15B and 24B increased during the same period and that of 35B increased from Period 2 to Period 3. Among adults, the prevalence of serotypes 7F and 12F, included in the PPSV23 vaccine (23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine for the elderly), decreased from Period 2 to Period 3, whereas that of non-vaccine serotype 34 increased. The proportions of PCV13 serotypes in pediatric isolates were 19.4%, 5.0%, and 1.2% for Periods 1, 2, and 3, respectively, while the proportions of PPSV23 serotypes in adult isolates were 76.2%, 69.0%, and 45.1%, showing a significant decline in both groups. Antimicrobial susceptibility testing showed that the rate of resistance to PCG, defined as the minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.12 µg/mL, decreased from 25.5% in Period 1 to 19.1% in Period 2 but increased to 30.3% in Period 3. These results highlight the impact of vaccination on serotype distribution, with a shift from vaccine serotype to non-vaccine serotypes. Additionally, the rate of resistance to PCG, which was thought to decrease after vaccine introduction, was found to increase again since 2020, indicating that PCG-resistant strains need to be closely monitored in clinical settings. 3) Relationship between serotypes and antimicrobial susceptibility The PCG resistance rate was high in PCV13 serotypes 6B, 19F, and 19A and non-PCV13 serotypes 15A, 23A, and 35B. Among the strains with high PCG resistance (MIC ≥ 2 µg/mL), 64.7% belonged to serotypes 15A and 35B. For non-PCV13 serotypes, the PCG resistance rates were 25.7%, 17.7%, and 32.6% across Periods 1, 2, and 3, respectively. Notably, the resistance rates of serotype 35B during each period were 75.0%, 42.9%, and 87.5%, respectively, showing a significant increase from Period 2 to Period 3. These findings indicate that antimicrobial susceptibility trends vary across serotypes, with distinct PCG resistance patterns observed. In addition, the PCG resistance rate has shown a tendency to increase again in recent years due to the increase in the prevalence of non-vaccine serotypes, such as 35B, which exhibit high PCG-resistance rates, indicating the need for measures against these non-vaccine serotypes. 4) Serotype, genotype, and phylogenetic analyses of serogroup 24 Among the strains identified as serogroup 24, 121 were subjected to multilocus sequence typing (MLST), a method which classifies bacterial strains based on the sequences of seven housekeeping genes. Whole-genome analysis was also performed to investigate virulence factors and conduct phylogenetic analysis. Serotyping revealed that 74 strains were 24F, 41 were 24B, and 4 were 24C. Two strains isolated from a single colony culture reacted to both 24F and 24C and were designated as 24F/C. MLST analysis identified the following sequence types (STs): 16 strains as ST162, 71 as ST2572, 18 as ST2752, 15 as ST5496, and 1 as ST18433 (a newly registered ST). The annual trends in the prevalence of these STs for each serotype showed shifts in their proportions. Before 2015, all serogroup 24 isolates belonged to either ST2572 or ST5496; however, since 2016, ST162 has become more prevalent among 24F isolates, and the prevalence of ST2754 has increased in 24B isolates from 2017 onwards. Notably, the two strains isolated from the same patient were identified as two different serotypes (24F and 24B), both belonging to ST162. Core gene SNP analysis, based on single nucleotide polymorphisms in the core genome, revealed that the isolates could be classified into three lineages, each correlated with distinct STs. Interestingly, the serotypes were interspersed across two of these clades. These results indicate that the dominant serotypes of serogroup 24 isolates in Tokyo are currently ST162 and ST2754 and that there is a substantial serotype diversity within the genome of serogroup 24, represented across multiple lineages. 5) Detection of virulence and antimicrobial resistance genes Fifteen virulence-related genes and several antimicrobial resistance-related genes were identified through the whole-genome sequencing of each strain. All strains carried a core set of virulence genes, including cbpD, cbpG, lytA, lytB, lytC, cbpE, pavA, hysA, nanA, eno, cppA, and ply. All 17 strains identified as ST162 or ST18433 harbored rlrA islets (rrgA, rrgB, rrgC, srtB, srtC, and srtD), which are known virulence factors involved in adhesion, suggesting that these strains may have enhanced virulence. Although all strains were PCG-sensitive, the types of penicillin-binding proteins involved in PCG resistance were classified into four different types, depending on the ST. Additionally, 105 isolates (86.8%) harbored both ermB (macrolide-resistant) and tetM (tetracycline-resistant). For co-trimoxazole resistance related genes, mutations in folA and folP were identified in all serogroup 24 strains, but the mutation patterns varied according to ST. The patterns of possession of virulence and antimicrobial resistance genes varied by ST, and recently dominant STs in serogroup 24, such as ST162 and ST2754, showed increased resistance to co-trimoxazole. 6) Comparison of capsular gene regions and mutations in abpA The gene alignments of the capsular regions of six strains, selected based on ST and serotype, were compared with the reference sequences CR931688 (24F) and CR931687 (24B). The analysis revealed that each strain had gene sequences similar to those of the 24F reference strain from dexB to the 5′ end of tnp and sequences similar to the 24B reference strain around glf at the 3′ end. The gene sequence of abpA, which is involved in the biosynthesis of capsular polysaccharides, was compared with that of CR931688, and 19 variants of amino acid sequence patterns were identified. The strains classified as ST162 commonly exhibited L77F and E100D mutations, while Sp525, a 24B strain from the same patient, had an additional P43L mutation. All strains with altered gene lengths were identified as serotype 24B. Sixty-one strains with only the K204E mutation, representing the most prevalent group, were identified, including serotypes 24F, 24B, 24C, and 24F/C. These results indicate that serogroup 24 in Tokyo has a different capsular gene alignment than that previously reported and that some abpA gene mutation patterns may contribute to serotype determination within serogroup 24. 7) Phylogenetic analysis of ST162 and analysis of strains from the same patient A phylogenetic analysis was performed on ST162, focusing on two strains isolated from the same patient. A whole-genome phylogenetic analysis, performed with the reference strains, showed that both strains clustered together on the same branch, suggesting a common origin. Furthermore, the only macrolide-resistant strain of ST162, Sp1057, belonged to the same clade as other macrolide-resistant strains from the U.K. and other regions, indicating the need to monitor the potential for macrolide resistance in ST162. A further comparison of the full-length capsular sequences of the two isolates from the same patient revealed that a single nucleotide mutation in T128C resulted in a P43L mutation in the abpA product. All the remaining nucleotide sequences in the capsular region were identical. These results suggest that the P43L mutation in abpA can change the serotype from 24F to 24B. In conclusion, this study provided valuable insights into IPD cases after vaccine introduction, highlighting the changes in S. pneumoniae serotype distribution and the long-term trends in antimicrobial resistance. An increase in the prevalence of non-vaccine serotypes and a growing trend of the occurrence of PCG-resistant strains were observed, providing valuable baseline data to inform future vaccine strategies and the selection of antimicrobial agents. Additionally, we conducted the first global phylogenetic analysis of serogroup 24 and ST162, both of which are of major concern globally. Our findings revealed that serogroup 24 isolates from Tokyo were composed of three lineages with diverse serotypes among multiple clades. Notably, two strains from the same patient, although genetically related, exhibited different serotypes; additionally, the discovery of a serotype (24F/C), displaying features of both 24F and 24C, underscores the antigenic instability of serotype 24F. These findings indicate the potential for serotype conversion during infection. Furthermore, a detailed genomic analysis of the bacterial capsule, which is targeted by both vaccines and the host immune system, revealed that mutations in the abpA gene considerably influenced serotype determination within serogroup 24. These mutations may lead to antigenic changes that could reduce vaccine efficacy and increase the risk of the development of severe diseases through immune evasion.肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）は主要な呼吸器感染症起因菌の一つであるが、ときに髄膜炎や敗血症等の重篤な疾患を引き起こす。本菌が血液、髄液またはその他の無菌的部位から分離される症例は侵襲性肺炎球菌感染症（IPD）と定義され、感染症法において五類全数把握疾患に指定されている。莢膜は本菌の主要な病原因子であると同時に血清型を決定する抗原であり、本菌の血清型は100種類以上存在する。わが国ではIPD予防のために、複数の血清型を含む多価ワクチンが定期接種として導入された結果、IPDは著しく減少した。しかしながら、IPD起因菌の血清型に変化が認められており、いくつかの非ワクチン血清型が問題となってきた。特にワクチン導入後、患者分離株の主要な血清型となった血清群24については、十分な分離株の解析がなされているとは言えない状況である。また、本菌の薬剤感受性の傾向は、ペニシリン（PCG）耐性の割合が減少傾向であるとされている。本菌の発生動向、血清型および薬剤感受性についての継続的な情報は、ワクチン効果の評価や治療時の抗菌薬選択において非常に重要である。 本研究では、ワクチン導入直後の2013年10月から2022年12月までの期間に都内医療機関で分離された肺炎球菌780株（0–14歳の小児398株、21–98歳の成人382株）を対象とし、血清型別および薬剤感受性試験について調査期間を1期（2013–2016年）、2期（2017–2019年）および3期（2020–2022年）に分けて調査を実施した。さらに、ワクチン導入後の主要な血清型の一つである血清型24Fを含む血清群24について、分子疫学解析を行い、以下のような知見を得た。 1）患者の臨床症状とワクチン接種歴の比較 患者の症状は、全年齢で原発巣不明の菌血症が38.1%と最多で、次いで肺炎が29.6%、髄膜炎が12.1%であった。臨床症状を小児と成人で比較すると、肺炎は成人で多く認められ、中耳炎、呼吸器症状、菌血症は小児で多く、IPDの臨床症状が小児と成人で異なることが明らかとなった。ワクチン接種歴については、小児症例ではワクチン接種率が90.7%であったが、成人症例におけるワクチン接種率は10.5%であった。成人におけるワクチン接種対象者の接種率は約50%と報告されているのに対し、本研究における成人の接種率は低く、このことが感染リスクの増加となっていることが示唆された。 2）血清型分布と薬剤感受性 1期から3期の全期間において血清型別の結果、菌株は42種類の血清型に型別された。小児由来菌株で最も多い血清型は、24F (17.3%)であり、次いで15A、24Bの順であった。一方、成人由来菌株で最も多い血清型は3 (13.6%)であり、次いで12F、19Aの順であり、小児と成人で血清型分布が異なることが明らかとなった。 調査期間中の動向については、小児においてはPCV13（小児対象13価ワクチン）血清型である19Aが1期から2期の間に減少した一方、同期間で15B、24Bは増加し、2期から3期の間で35Bは増加した。また、成人においては2期と3期の間でPPSV23（高齢者対象23価ワクチン）血清型である7F、12Fの減少、および非ワクチン型である34の増加が確認された。小児におけるPCV13含有血清型の割合は1期から3期にかけて、それぞれ19.4%、5.0%、1.2%であり、成人におけるPPSV23含有血清型の割合は76.2%、69.0%、45.1%と両者ともに有意に低下していた。 一方、薬剤感受性試験ではPCGに対する最小発育阻止濃度（MIC）値0.12 µg/mLを耐性とすると、1期から2期にかけて耐性率は25.5%から19.1%と減少したが、3期は30.3%と増加傾向であった。 以上により、ワクチン接種が血清型分布に与える影響が確認され、ワクチン型から非ワクチン型へのシフトが進んでいることが明らかになった。さらに、ワクチン導入後のPCG耐性率は減少傾向と考えられていたが、本研究において2020年以降再び上昇していることが確認され、臨床上PCG耐性菌（PRSP）に留意する必要が示された。 3）血清型と薬剤耐性率の関連および経年変化 PCG耐性率はPCV13ワクチン型では、6B、19Fおよび19Aが高く、非PCV13ワクチン型では15A、23Aおよび35Bの耐性率が高かった。PCGのMIC値が2 µg/mL以上の高度耐性株のうち15Aと35Bの両血清型で高度耐性株の64.7%を占めた。 非PCV13ワクチン型において、PCG耐性率は25.7%、17.7%、32.6%と推移した。各期間の35BのPCG耐性率はそれぞれ75.0%、42.9%、87.5%であり、2期から3期にかけて上昇が認められた。このことから、菌株の薬剤感受性傾向は血清型によりPCG耐性率が異なることが確認された。また、近年PCG 耐性率が再び上昇傾向を示したのは、35B 等のPCG 耐性率の高い非ワクチン型の増加が要因であり、これらの非ワクチン血清型への対策が必要であることを示唆した。 4）血清群24の血清型、遺伝子型および系統解析 前述の菌株の中で血清群24菌株と同定された121株に対し、7領域の遺伝子配列の差異で型別する MLST（Multilocus sequence typing）および全ゲノム解析による病原因子および系統解析を実施した。121株の血清型別は、24Fが74株、24Bが41株、24Cが4株で、他の2株については単一コロニーから分離されたにもかかわらず、24Fと24Cの両方の反応性を示す菌体が同時に観察され24F/Cとした。 MLSTの結果、ST（Sequence type）162が16株、ST2572が71株、ST2752が18株、ST5496が15株、ST18433（新規登録）が1株であった。各血清型におけるSTの変化は、2015年以前はすべての株がST2754またはST5496であったが、24Fについては2016年以降ST162が増加し、24Bにおいては2017年よりST2754が増加した。また、同一症例から24Fと24Bの異なる血清型が分離されたが、両株ともST162であった。 すべての供試菌株が保有する遺伝子領域の一塩基多型を基にしたCore gene SNPs解析の結果では、分離株はSTと相関する3系統に分類され、うち2系統において血清型は混在していた。以上により、東京都で分離された血清群24の主要な型は、現在はST162およびST2754であり、血清群24のゲノムは複数の系統間で血清型に多様性があることが明らかとなった。 5）病原性および薬剤耐性遺伝子の検索 各株の全ゲノム情報より、15種類の病原遺伝子と薬剤耐性関連遺伝子を検索した結果、全株がcbpD、cbpG、lytA、lytB、lytC、cbpE、pavA、hysA、nanA、eno、cppA、plyを保有していた。また、ST162またはST18433と同定された17株は全株が付着に関与する病原因子であるrlrA islet (rrgA、rrgB、rrgC、srtB、srtC、srtD )を保有しており、病原性の亢進が示唆された。 薬剤耐性遺伝子については、全株がPCG感受性であったが、PCG耐性に関与する遺伝子領域であるPBP（Penicillin binding protein）の型は、ST毎に異なる4種類の型に分類された。また、105株（86.8%）がermB（マクロライド耐性）とtetM（テトラサイクリン耐性）の両方を保有していた。また、コトリモキサゾール耐性については、血清群24のすべての株にfolAおよびfolPの変異が確認されたが、変異パターンはSTに応じて異なった。病原性遺伝子や薬剤耐性関連遺伝子のパターンはST毎に異なる傾向であることが判明し、近年血清群24として主流となっているST162やST2754ではコトリモキサゾール耐性が亢進していることが明らかとなった。 6）莢膜遺伝子領域の比較とabpA遺伝子のアミノ酸変異 各STと血清型別に抽出した6株について莢膜関連領域の遺伝子配列をCR931688（24F）とCR931687（24B）の参照配列と比較した結果、すべての東京株はdexBから5’側のtnpまでの配列は24F参照株に、3’側のglf周辺は24B参照株と相同性が高い配列を有していた。また、莢膜多糖の生合成に関与するとされるabpA遺伝子をCR931688と比較した結果、アミノ酸配列には19パターンが認められた。ST162は、共通してL77F、E100Dの変異が認められ、同一症例由来の2株のうち24BであったSp525株は、前述の変異に加えてP43L変異が認められた。abpA遺伝子の長さが変化した株はすべて24Bであった。K204E変異のみの株は61株と最も多く、24F、 24B、24C、24F/Cの血清型が存在した。これらのことから、東京における血清群24は、従来の報告とは異なる莢膜遺伝子の配列を持つことが解明され、一部のabpA遺伝子の変異パターンは、血清群24の血清型の決定に関与する可能性が示された。 7）ST162の系統解析と同一症例由来株の解析 同一症例由来の2株を含むST162に着目し、参照株を加えて全ゲノム系統解析を実施した。同一症例由来株は同枝に帰属し、これら2株は共通の由来を持つことが示唆された。さらに、ST162の中で唯一マクロライド耐性であったSp1057株は、英国等由来のマクロライド耐性株と同じクレードに属し、今後のST162のマクロライド耐性化に留意が必要であることが明らかとなった。また、同一症例から分離された2株の莢膜全長の塩基配列を比較したところ、abpAのP43Lの変異の要因となるT128Cの1塩基変異のみで、他の莢膜領域の塩基配列は同一であった。 以上により、abpA遺伝子産物のP43L変異は24Fから24Bへの血清型の変化に寄与する可能性が示唆された。 本研究において、ワクチン導入後のIPD症例の特徴やIPD由来肺炎球菌の血清型分布の変化、さらには薬剤感受性の長期的な動向を明らかにした。非ワクチン血清型の増加とPCG耐性菌の増加傾向が確認され、今後のワクチン施策や抗菌薬選択時の基礎データとして極めて有用である。一方、世界的にも重要な血清群24およびST162に関する全ゲノムの系統解析を初めて実施し、東京都の血清群24は3系統から構成されること、複数の系統間で血清型の多様性があることが示された。その中で、同一症例由来で共通の由来を持つと考えられる2株の血清型が異なったことや、24Fと24Cの両方の性質を示す血清型24F/Cが発見されたことは、血清型24Fにおける血清型の不安定さを裏付けるものであり、本菌が患者体内で変異し血清型を変化させる可能性を示した。さらに、ワクチン抗体だけでなく宿主免疫の標的となる莢膜についての詳細なゲノム解析から、abpA遺伝子の変異パターンが血清群24の血清型決定に大きく影響し、抗原性の変化からワクチン効果減弱および宿主免疫からの逃避による重症化のリスクにつながることを示唆する成果となった。doctoral thesi

犬の短頭種気道症候群の治療標準化を目的とした新規定量的病態評価法の確立

麻布大学博士（獣医学）パグやフレンチ・ブルドッグ、ペキニーズなどの短頭⽝種は、選択的交配により短い顔面頭蓋など特徴的な解剖学的構造を有する結果として、上部気道閉塞を主訴とする短頭種気道症候群（Brachycephalic Airway Syndrome：BAS）を発症しやすいことが知られている。BAS は鼻腔や咽頭、喉頭、気管から構成される上部気道の閉塞を引き起こす進行性の病態であり、外鼻孔の狭窄や過剰な軟口蓋などの解剖学的異常に起因する。これらの一次病変を放置すると、咽頭や喉頭の虚脱といった二次病変が不可逆的に進行し治療が困難となるだけでなく、上部消化管や肺にも影響を及ぼし、長期的に生活の質が低下する可能性がある。こうした状況に対処するため外鼻孔拡大術や軟口蓋切除術などの外科的手法が実施され、術後に多くの症例で症状の改善が確認されている。しかしどの解剖学的異常がどの程度気道閉塞に関与しているかを特定することが困難であるため、症例ごとに最適な術式の選定が困難であり、標準的な治療法の確立には至っていない。また重症度や治療効果の客観的指標が存在しないため、評価は主観的な要素に依存しており、治療標準化の障害となっている。このような背景から本研究ではBASの治療の標準化に向け、客観的かつ定量的な病態評価法の確立を目的とした。そこで上部気道を構成する解剖学的構造のうち、第1章および第2章では吻側の鼻腔、第3章および第4章では尾側の咽頭と軟口蓋にそれぞれ着目し研究を行なった。 第1章 コンピューター断層画像による短頭犬種の鼻腔内構造の比較 短頭犬種は顔面頭蓋の短縮によって生じた鼻腔内の構造異常が気道閉塞に関与していると考えられているが、これを定量化する方法は限られている。本章では鼻腔の総断面積に対する気道面積比（The ratio of the airway cross-sectional area to the total nasal cavity area: AA/NC 比）の測定が犬の鼻腔内構造の定量的評価法として使用し、複数の短頭犬種間の鼻腔内構造に違いがあるかを検証した。また犬の頭蓋骨形状を表す値とAA/NC比の相関を調査し、頭蓋形状が鼻腔内構造の測定に与える影響について考察した。 【材料と方法】 50 頭の短頭犬種（パグ：20頭、フレンチ・ブルドッグ：20頭、シー・ズー：10頭）の頭部コンピューター断層（Computed Tomography: CT）画像を使用した。第一切歯レベル、犬歯レベル、硬口蓋水平板レベル、眼窩下孔レベルの4つの断面における略AA/NC比を求め、犬種間で比較した。また頭蓋指数 (Skull Index: SI), 顔面頭蓋指数 (Facial Index: FI), 脳顔面頭蓋角(Craniofacial Angle: CFA)を算出し、CT画像上で指定した断面におけるAA/NC比との相関を求めた。 【結果】 第一切歯および犬歯レベルのAA/NC比はシー・ズーがフレンチ・ブルドッグおよびパグよりも有意に大きく、眼窩下孔レベルのAA/NC比はフレンチ・ブルドッグがシー・ズーおよびパグよりも有意に大きかった（P < 0.05）。またパグにおいて眼窩下孔レベルでのAA/NC比とCFAの間に正の相関がみられたが、その他の頭蓋形状指数とAA/NC比の間に相関はみられなかった。 【考察】 犬の鼻腔内構造は頭部CT横断像により得られたAA/NC比を用いて面積が狭い箇所は短頭犬種間で異なることが示された。また頭蓋骨の 形状とAA/NC比との関連性はわずかだった。よって犬種間におけるBASへの治療反応の差は鼻腔内における気道の狭窄箇所の違いに起因する可能性が考えられた。 ※本章の結果はOshita, R., Katayose, S., Kanai, E., Takagi, S.: Assessment of Nasal Structure Using CT Imaging of Brachycephalic Dog Breeds. Animals (Basel), 12(13):1636, 2022 Jun 25 として発表した。 第2章 3Dプリンターモデルを用いた犬の鼻腔内通気度における客観的評価 第1章において、鼻腔内構造の違いがBASにおける臨床徴候の重症化に強く関連していると考えられた。そのため実際の症例における治療では、鼻腔内で最も気道抵抗が大きい部位を外科的に切除し、気道を拡大することが⼀定の治療効果をもたらすと考えられるが、鼻腔内の通気度や気道抵抗を定量化するための方法は確立されていない。本章ではBASに対する外科的治療を行なったフレンチ・ブルドッグの術前および術後頭部モデルを3Dプリンターで作成し風洞実験を行うことで、鼻腔内通気度と手術による改善を定量化できるか検討した。 【材料と方法】 BASの精査および治療を目的に麻布大学附属動物病院を受診し、腹側鼻甲介の⼀部を外科的に切除したフレンチ・ブルドッグ（6歳、去勢雄）のCT画像をもとに、3Dプリンターで術前、術後の頭部モデルを作成した。頭部モデルを含めた風洞装置を作成し、内部の流体の持つ圧力を測定することで流速を求め、術前および術後で比較した。 【結果】 風洞装置の内部における流速の平均値は術前モデルで3.59m/s、術後モデルで3.61m/sだった。よって術後モデルでわずかな流速の増加がみられたが、統計解析の結果では手術の前後で有意差はなかった。 【考察】 3Dプリンターで作成した頭部モデルは実際の症例の鼻腔内構造が一定の精度で反映され、現時点では実験段階であるものの犬の鼻腔内通気度を評価する有用なツールの1つである可能性が考えられた。しかし術前後の流速に統計学的有意差は認められず、気道表面の材質や詳細な骨構造の再現などモデルの精度に関する検討、流体力学的シミュレーションを利用した包括的な解析が必要だと考えられた。 第3章 犬の軟口蓋の変形に関する定量的測定法の検討 本章では上部気道の尾側に位置する咽頭および軟口蓋に着目した。短頭犬種の軟口蓋は先天的もしくは後天的に肥厚・伸長し、呼吸運動に伴って動的に咽頭を閉塞させることが知られているが、この現象を軟口蓋の変形に着目して定量化した報告はない。このような背景から本章では、X線連続透視装置を用いて犬の咽頭構造の変形を定量化することを試みた。そこで正常ビーグル犬と、軟口蓋の異常による呼吸器症状を呈しやすい犬種で各呼吸相における軟口蓋面積および咽頭面積の変化を X 線連続透視画像で比較した。 【材料と方法】 短頭犬2犬種 （フレンチ・ブルドッグ、チワワ）と対照群（ビーグル）の側方より撮影した頭部 X 線連続透視画像を前向きに収集し、吸気および呼気における軟口蓋および咽頭空間の面積を測定した。その後、咽頭空間における軟口蓋占有率および咽頭空間面積率を算出し、呼吸による変化率を犬種間で比較した。 【結果】 全犬種で吸気時における軟口蓋面積の有意な増加が見られた（P<0.05）。また吸気時における軟口蓋占有率の有意な増加および咽頭空間面積率の有意な減少が見られた（P<0.05）。この現象は短頭犬種において顕著に観察された。 【考察】 短頭犬種で観察される軟口蓋による咽頭の動的な狭窄は、吸気時に軟口蓋が膨張することで発生する可能性が示唆された。面積変化に着目した軟口蓋の変形の定量化は、犬の上部気道閉塞の病態評価に有用である可能性がある。 第4章 上部気道拡大手術が軟口蓋および咽頭構造の定量化に与える影響 第3章より呼吸による軟口蓋の膨張を抑制することは上部気道閉塞の改善につながると考えられる。気道閉塞を起こす軟口蓋の異常に対しては軟口蓋切除術が適応となる場合が多いが、手術が軟口蓋の変形に与える影響は不明である。本章では上部気道拡大手術が軟口蓋および咽頭の面積変化に与える影響を調査した。 【材料と方法】 軟口蓋切除術を含む上部気道拡大手術を受けた犬11頭（チワワ：1頭、ブルドッグ：1頭、フレンチ・ブルドッグ：9頭）の頭部X線透視画像を術前後で撮影した。第3章で定義した軟口蓋占有率、咽頭空間面積率をそれぞれ求め、呼吸による変化率を術前後で比較した。 【結果】 11 頭の対象犬すべてで術後の主観的重症度グレードが改善した。軟口蓋占有率および咽頭空間面積率の呼吸による変化率は術後で有意に減少した（P<0.05）。 【考察】 上部気道の手術が軟口蓋の可動性を抑制し、咽頭閉塞を改善する可能性が示唆された。また面積変化に着目した軟口蓋の変形の定量化は上部気道の手術の治療効果判定に利用できる可能性がある。 本研究で開発および検討した定量的評価法はBASにおける病態理解を深め、重症度評価や治療効果判定における客観的指標として有用であることが期待される。また、今後さらに様々な年齢・重症度の症例を本評価法にて解析することによりどの犬が将来的に重症化しやすいかということや、治療効果の主観的評価法との比較検討を行うことで、より効率的なBAS治療法の確立が期待される。doctoral thesi

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Clinical applications and improvements of Mohs paste in veterinary medicine

麻布大学博士（獣医学）In veterinary medicine, complete surgical excision of skin tumors under general anesthesia is widely accepted as the gold standard. However, tumor excision may not be an option for patients at high risk for general anesthesia, such as those with complications of heart failure, hepatopathy, or nephropathy. Additionally, some animal owners may decline tumor resection due to the financial burden of surgical treatment and the laboratory work-up required for general anesthesia. In these cases, as well as for terminally ill patients with skin tumors, the tumor surface often becomes ulcerative, hemorrhagic, and malodorous, eventually developing into malignant wounds. These conditions significantly reduce the quality of life (QOL) for both animals and their owners. Malignant wounds are a common challenge in the long-term management of animals with unresectable skin tumors. Furthermore, in Japan, due to the cultural significance of companion animals, many owners are unwilling to authorize euthanasia for their pets. These factors emphasize the need for cost-effective and noninvasive approaches to manage malignant wounds, which is a necessity for animals with skin tumors in Japan. Mohs paste, developed by Frederic E. Mohs in the 1930s, is used for fixed-tissue micrographic surgery for accessible skin tumors. It works by degenerating proteins through the astringent action of ionized zinc, produced by the chemical reaction between zinc chloride and the exudate from the skin wound. The paste is non-toxic to medical practitioners. In Japanese medicine, Mohs paste has been applied to patients with malignant wounds resulting from unresectable skin tumors. Its application has shown positive effects on fixed necrotic tissues, alleviated the signs and symptoms of malignant wounds, and decreased tumor volumes, allowing their subsequent excision, such as in pleomorphic adenoma, adenoid cystic carcinoma, malignant melanoma, and squamous cell carcinoma, and for those with non-cutaneous skin tumors, like angiosarcoma and advanced breast cancer. In veterinary medicine, only two case reports have demonstrated the use of Mohs paste to achieve hemostasis and reduce malodor, However, these reports lacked objective evidence regarding its efficacy. To address the limited veterinary studies on this topic, this case series aimed to examine whether Mohs paste could serve as a viable option for palliative treatment of malignant wound signs and symptoms in terminally ill dogs and cats with cutaneous and non-cutaneous skin tumors. Medical records of seven animals with unresectable malignant tumors and malignant wounds admitted to our Veterinary Teaching Hospital from August 2012 to May 2013, were reviewed. The results showed that Mohs paste treatment (MPT) significantly reduced the number of dressing gauze changes required, resulting in decreased tumor size. In two feline cases of mammary gland tumors, the malignant wounds were completely closed with MPT. In addition, MPT extended the lifespan of animals by at least one month. In conclusion, Mohs paste treatment was effective in reducing tumor progression and exudate production associated with malignant wounds. It controlled bleeding at the wound site, minimized malodor and infection, and promoted malignancy-related wound closure. MPT appears to be an effective treatment for alleviating the signs and symptoms of malignant wounds in veterinary patients, especially when health contraindications and/or financial difficulties exclude other treatment options. This first report establishes methods for Mohs paste treatment and objectively evaluates managing malignant wounds in dogs and cats described in Chapter 1. Mohs paste is not commercially available as a pharmaceutical product and must be prepared immediately before use in the hospital. The preparation poses several disadvantages: i) It requires significant time and effort to prepare for each treatment, as i the paste’s properties change immediately after component mixing. ii) It is difficult to handle; petroleum jelly should be applied to the skin to limit the application of Mohs paste to a specific region. iii) A metal (zinc)-containing liquid waste is generated when malignant wounds are scrubbed and when the mortar used to prepare the paste is washed. These limitations may be attributed to the starch in the base material. Researchers have attempted to modify Mohs paste by incorporating d-sorbitol, microcrystalline cellulose, hydrophilic ointments, and macrogol ointments to stabilize its properties for subsequent use. However, these modified pastes require mortar for preparation, and malignant wounds must be scrubbed before application. To address these limitations, the base material was changed to Carboxymethyl cellulose (CMC), a thickener used in the food industry. In the second study, the base material of the Mohs paste was changed from zinc oxide starch powder to CMC (modified Mohs paste based on CMC: moM-CMC). Research was conducted to determine the optimal viscosity of the moM-CMC sol and analyze its properties. The sol, composed of composed of 1 g of CMC, 2 ml of saturated zinc chloride water, and 1–1.5 ml of purified water, was easily prepared in a disposable cup, which could be discarded after use. When the moM-CMC sol was applied to a malignant wound, it gelled on the wound surface, allowing for easy removal without scrubbing. Therefore, no metal-containing liquid waste was generated. In addition, the moM-CMC sol could be handled easily using a syringe, thereby addressing the handling difficulties associated with traditional modified Mohs paste. This case series aimed to evaluate the properties of moM-CMC sol and conduct a pilot trial involving its use in three dogs with malignant wounds. In conclusion, our case series showed that the moM-CMC sol requires significantly less time and effort for preparation, use, and cleaning. i) The preparation of moM-CMC sol was completed within a few minutes in the treatment group for all cases. ii) It was handled easily, be applied using a syringe in Case 3. iii) Metal-containing liquid waste was not generated because the moM-CMC gel was removed without scrubbing the malignant wound and all equipment used could be conveniently discarded as medical waste. Moreover, the efficacy of the moM-CMC sol appears comparable to that of the modified Mohs paste, making it a viable, alternative for managing malignant wounds. To address the limitations of the initial version, a modified Mohs paste using carboxymethyl cellulose sol (moM-CMC sol) was developed to treat malignant wounds associated with bleeding, infection, and malodor. However, it has a few disadvantages. 1) moM-CMC 1.0 cannot be stored due to its property changes within an hour of mixing necessitating fresh preparation before treatment. 2) It is not easy to handle it. These disadvantages are due to that the moM-CMC 1.0 sol transitioned to a gel in approximately one hour. To overcome these issues, we further developed a Mohs paste designed for long-term storage while retaining usability. The composition of zinc chloride and distilled water did not change; however, the volume of CMC changed. The hardness of each paste was verified. Moreover, the paste was heated at the end of the process, and a storable Mohs paste was obtained. The paste was named modified Mohs paste based on carboxymethyl cellulose sol 2.0 (moM-CMC 2.0). Therefore, moM-CMC 2.0, which has better handling properties than moM-CMC 1.0, remains stable for over 3 months. The composition of moM-CMC sol 2.0 includes 5 g of zinc chloride, 2.5 mℓ of purified water, and 0.75 g of CMC. The suspension was packed in a syringe and made jelly like in a boiling water bath for 15 min. It was applied directly from a syringe to the wound area. Next, moM-CMC 2.0 was used to treat malignant wounds in animals. All ten cases showed clinical symptoms of malignant wounds; moM-CMC 2.0, was applied to the malignant wounds using a syringe. The sol transitioned to gel on the tumor because of the exudate from the ulcer lesion. The treatments were performed for 10–60 min, 1–20 times at one-week intervals. All ulcerated cases demonstrated temporary palliative benefits, including reduced malodor. The pre-prepared moM-CMC 2.0 offers an immediate and convenient application for malignant wounds. This study focused on the use of Mohs paste as a palliative treatment option. Mohs paste was used in clinical cases to confirm its objective efficacy. By modifying the base material from zinc oxide starch powder to CMC, moM-CMC 1.0 and moM-CMC 2.0 were developed, improving the preparation, disposal, and storage processes. These advancements were validated in clinical cases, highlighting their potential to enhance the palliative treatment of malignant wounds in skin tumors.Mohsペーストは、1930年代に米国の外科医であるFrederic E. Mohs博士によって考案されたケモサージェリーに用いられる外用薬で、主成分である塩化亜鉛の蛋白凝固作用により腫瘍組織を化学的に固定し、病理組織学的に腫瘍細胞が無くなるまで段階的に切除を繰り返し腫瘍の根治を目指す治療法である。2000年代になり重山らによって、亜鉛華デンプンを基剤としたMohsペーストが考案され、我が国の医学領域では、自壊した腫瘍からの止血、滲出液の産生軽減、悪臭の軽減目的や、基礎疾患があり麻酔が不可能な症例に対して腫瘍の減容積目的など、患者のQuality of life（以下 QOL）向上のための緩和ケアとして使用が拡がった。獣医領域においても飼育動物の高齢化により腫瘍に罹患する犬猫は増加しており、腫瘍の自壊はヒトと同様に罹患動物のQOLを低下させ、さらに悪臭や出血によって飼い主に負担をかける。それらの改善にMohsペーストによる緩和治療が、獣医療でも有効であると推測された。そのため、本研究はヒトの自壊腫瘍に対するMohsペースト療法を参考にし、獣医領域での応用を検討した。第1章では、ヒトで使用されているMohsペーストが、犬猫でも有効な治療手段となり得るのか検討することを目的とした。そのため、自壊腫瘍を有する臨床例に対してMohsペーストを使用し、Mohsペーストによる治療方法の確立とその有効性の評価を試みた。次に第2章では、亜鉛華デンプンを基剤とする従来のMohsペーストの難点を改善することを目的とし、基剤をカルボキシメチルセルロース（carboxymethylcellulose: 以下CMC）に変更したMohsペーストの作成を試みた。これにより調製が簡単で金属廃液の産生が抑えられるMohsペーストを考案し、これをイヌ3頭の自壊腫瘍に対して使用した。その結果、使用感の向上と従来のMohsペーストと同様の有効性を確認した。さらに第3章では、保存可能なMohsペーストの作成を目的とし、CMC量の変更や調製方法の改良を行い、自壊腫瘍を有するイヌ8頭、ネコ2頭の臨床例で使用感の改善と有効性を確認した。 　第1章は従来のMohsペーストを、犬猫の自壊腫瘍に対して臨床応用する事を目的とした。イヌおよびネコの皮膚腫瘍やその他の腫瘍により形成された皮膚自壊創に対してMohsペーストの塗布を行い、塗布の方法や時間、治療間隔、治療回数などについて検討を行った。さらに、Mohsペースト治療による効果の判定を、客観的な指標にて評価した。体表部の腫瘍が増大し自壊したイヌ4頭、ネコ3頭の計7頭の臨床例で、基礎疾患により全身麻酔ができない症例や飼い主が手術を希望しなかった症例を対象とした。有効性の評価は、自壊部分の大きさ、滲出液の量、悪臭改善効果、止血効果を、治療前と最終治療2または3週後との間で比較した。その結果、最終治療後の腫瘍自壊部の大きさは、治療前と比較して有意に減少していた（p < 0.05）。7頭中4頭でMohsペースト療法後に自壊部の大きさが減少し、そのうち2頭は完全に消失した。滲出液量の指標となるガーゼの交換回数も治療前と比較して有意に減少した（p < 0.01）。7頭すべてにおいて、治療後には出血および悪臭が顕著に減少した。以上の事からMohsペースト療法は、犬猫においても自壊腫瘍の増殖抑制および自壊創からの滲出液量の減少効果を有することが確認された。さらに、自壊部の出血の制御、悪臭の軽減、感染管理、ならびに腫瘍の縮小に伴う創部の閉鎖が認められた。Mohsペースト療法は基礎疾患を有する症例や、経済的な理由などから他の治療法が選択できない症例において、自壊腫瘍の症状を緩和する有効な治療法となり得ることが示唆された。 　現在、Mohsペーストは医薬品として市販されておらず、院内で使用直前に調製されている。本研究、第1章のMohsペーストも同様であるが、このMohsペーストはいくつか難点がある。まず、調製に乳鉢や乳棒を使用して各成分を撹拌するため、それらが塩化亜鉛で汚染され、その洗浄により亜鉛が混入した金属廃液が生じる。また調製後、経時的に硬化しはじめ、再度混和やグリセリンを添加すると軟化するが、自壊部への固着性が低下し使用感が悪化する。硬化の原因は基剤のデンプンであることから、第2章では基剤を変更することにより調製方法の改善と使用感の良いMohsペーストの作成を試みた。本研究では、食品工業において増粘剤として使用されているカルボキシメチルセルロース（CMC）を基剤として選択した。飽和塩化亜鉛水2 ml、CMC 1 g、蒸留水1〜1.5 mlを原料として使用し、これらを混合して新規Mohsペーストを作成した。このCMCを基剤としたMohsペーストをmodified Mohs paste based on CMC（moM-CMC）と命名した。調製直後のmoM-CMCはゾル状であり（moM-CMCゾル）、数分でゲル化することが確認された。具体的には、鶏胸肉に塗布したmoM-CMCゾルが数分以内にゲル状に変化した。したがって、治療後に擦らずに容易に除去することが可能であり、患部の洗浄を必要としない。また、調製も使い捨てのプラスチックカップで行うことができるため、亜鉛を含む金属廃液の発生が回避できた。moM-CMCゾルの適正粘度の決定と特性の解析や吸水性および塩化亜鉛の放出性の評価を行い、それをもとにイヌ3頭の自壊した悪性腫瘍に対してmoM-CMCゾルを用いて治療を行なった。その結果、止血作用および悪臭軽減効果などの臨床症状の改善がこの3頭でも認められ、従来のMohsペーストと同等の効果を有する可能性が示唆された。従ってmoM-CMCゾルは、従来のMohsペーストを用いた自壊腫瘍管理の代替療法となり得ると考えられた。 　しかしながら、moM-CMC ゾルは10分を過ぎるとゲル化が始まり硬化するため従来のMohsペーストと同様、使用する直前に作る必要がある。第3章では、この点を克服するために研究を進めた。CMCの入った液体を加温し、その後冷却すると粘度が上昇することを確認し、各成分の混合液を調製の過程で加温することにより、懸濁液であったものが冷めるとゾルとなり保存可能なMohsペーストを約1時間で作成することが可能となった。続いて塩化亜鉛量、蒸留水量を一定にし、添加するCMC量を段階的に変えて調製し、それぞれに対して固さの検証を行った。これにより、ゾルの状態で長期保存が可能なMohsペースト（moM-CMC 2.0）を考案した。さらに自壊腫瘍を有する臨床例に対して使用し、その症状緩和効果を検証した。2019年7月から2021年8月までにmoM-CMC 2.0を用いた10頭について回顧調査を実施した。調査項目は、動物種、品種、年齢、性別、体重、臨床徴候、においスコア、診断、腫瘍ステージ、moM-CMC 2.0の塗布方法、治療時間、回数、間隔、治療期間、治療反応、除去後のにおいスコア、合併症、死因、および生存期間とした。治療には、あらかじめ準備しておいたmoM-CMC 2.0（塩化亜鉛 5 g、蒸留水 2.5 ml、CMC 0.75 g）を使用し、シリンジから自壊部に直接押し出して塗布した。においスコアの評価には、9段階の快・不快度尺度を用い、同一症例については同一の評価者が判定した。腫瘍ステージは悪性腫瘍と仮定しTNM分類に基づいて分類を行った。また、治療反応の評価にはcRECIST v1.0を適用した。使用後に残ったmoM-CMC 2.0はシリンジに入れたまま保存し、次の治療に対しても使用した。moM-CMC 2.0でも治療を行った10頭すべてで、においスコアが平均-2から0へと改善し、7頭中6頭で止血効果、3頭では寛解が得られた。以上のことからmoM-CMC 2.0は従来のMohsペーストやmoM-CMC ゾルと同様に自壊腫瘍の症状緩和効果が認められた。 　本研究は、Mohsペーストを獣医療でも緩和療法での使用に着目しその有効性を見出した。さらに獣医師の利便性を良くするために改良を重ねmoM-CMC ゾル、およびmoM-CMC 2.0 を考案し実際の症例でその有効性を確認した。 　医療におけるこれまでのMohsペーストの改良は、A) 保存性の改善、が主であった。moM-CMC ゾルは、B) シリンジによりピンポイントの投与が可能、C) 金属廃液が生じないという利点がある。さらにmoM-CMC 2.0は上記A), B), C) 全ての利点を有し使用直前の準備が不要なことから自壊腫瘍の緩和治療が容易になる可能性がある。doctoral thesi

Comparison of the coarse-grained beads model from extracted monodisperse data by multi- disperse analysis with that from monodisperse data in the absence of aggregates in small angle X-ray scattering

Small-angle X-ray scattering is a simple and convenient method to obtain structural information of aqueous molecules such as their size and shape. In contrast, irregular aggregates observed due to the synchrotron radiation equipment and/or various experimental conditions have been a serious bottleneck in SAXS analysis. In the present study, we constructed a monodisperse scattering profile from the experimental data with aggre-gation by multi-disperse analysis, and calculated the coarse-grained beads model by Monte Carlo simulation. In addition, we also calculated the coarse-grained beads model from monodisperse data without aggregation. Consequently, in both cases, the obtained beads model was well superimposed onto the crystal structure reported previously. This suggests that the present multi-disperse analysis could be quite effective where removable ag¬gregates prevent us from attaining monodisperse condition.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape

2023年度大学院特別講義に係る講師一覧

S(会告など)application/pdfdepartmental bulletin pape

Studies on the susceptibility of chickens and mallards to infection with high pathogenicity avian influenza viruses

麻布大学博士（獣医学）The H5 subtype of high pathogenicity avian influenza (HPAI) viruses (HPAIVs) derived from A/goose/Guangdong/1/1996 have spread globally and circulated in wild and domestic birds for a quarter of a century. In Japan, HPAIV caused outbreaks in poultry for five consecutive seasons, from the 2020/21 season (autumn 2020 to spring 2021) to the 2024/25 season. In the event of an outbreak in poultry, immediate and appropriate initial response measures are taken in accordance with the Act on Domestic Animal Infectious Diseases Control, such as the slaughter of poultry on the premises and disinfection of contaminated areas, to stamp out the disease. Chickens are the most commonly reared poultry species in Japan, and the damage caused by HPAI in chickens is significant. In Chapter 1, I investigated the susceptibility of chickens to infection with HPAIVs recently isolated in Japan and determined the virological characteristics of HPAIVs that strongly influence the prevalence of HPAIVs in poultry. Migratory water birds are considered to be carriers of HPAIVs. Mallards are often observed in Japan during winter, and HPAIV-infected mallards are known to often shed virus asymptomatically. In Chapters 2 and 3, I investigated the susceptibility of mallards to infection with HPAIVs recently isolated in Japan and evaluated whether they are potential carriers of the viruses. All animal experiments were conducted in Biosafety Level 3 facilities at the National Institute of Animal Health, Japan, in compliance with the institutional protocol reviewed and approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the National Agriculture and Food Research Organization. The approval number of the protocols are as follows: Chapter 1, 20-066, 20-078, 20-084, 21-001, 21-026; Chapters 2 and 3, R4-I002-NIAH, R4-I002-NIAH-2, R4-I002-NIAH-3. Chapter 1: The infectivity, virulence, and transmissibility of HPAIVs isolated in Japan during the 2020/21 season in chickens During the 2020/21 season, H5N8 HPAIVs caused 52 HPAI outbreaks on poultry premises. These viruses were divided into five distinct genotypes (E1, E2, E3, E5, and E7) based on the constellations of all gene segments, and the prevalence of HPAIVs in poultry differed among genotypes. To investigate the cause of these outbreaks, chickens were experimentally infected with five representative strains of each genotype, and the infectivity, virulence, and transmissibility of HPAIVs in chickens were studied. First, to evaluate the infectivity and virulence, 4-week-old chickens were intranasally inoculated with the viruses at several doses ranging from 102.0 to 106.0 50% egg infectious dose (EID50) and the viral doses required for infection, lethality, and viral shedding were examined. The 50% chicken infectious dose (CID50) differed by up to 101.88 times among the five strains, and the titer was lowest for the E3 strain (102.75 EID50), followed by that of the E2 strain (103.50 EID50). The mean death time of chickens inoculated with each virus at a dose of 106 EID50 differed by up to 2.43 days post-inoculation (dpi), and the titer of the E2 strain (3.20 dpi) was the lowest, followed by that of the E3 strain (3.17 dpi). These results indicated that the infectivity and virulence of the E2 and E3 strains were higher than those of the other strains. To evaluate the transmissibility of the viruses in the chicken population, one chicken was intranasally inoculated with the virus at a dose of 106 EID50 and six naïve chickens were cohabited with the inoculated chicken. The E2, E3, and E5 strains transmitted to naïve chickens with high efficiency (>80%), whereas the other strains showed low transmission efficiency (<20%). Associating these findings with the prevalence of HPAIVs in poultry, the E2 and E3 genotypes, which have higher infectivity, virulence, and transmissibility in chickens than the other three genotypes, have caused a large number of outbreaks on poultry premises over a wide area in Japan. In contrast, poultry outbreaks caused by the three low-infectious genotypes, E1, E5, and E7, were limited in number or area, regardless of other virological characteristics. Among the three virological characteristics of HPAIVs analyzed in this study, the infectivity of HPAIVs in chickens may have strongly influenced the prevalence of HPAIVs in poultry in Japan during this season. Chapter 2: The infectivity and virulence of HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season in mallards HPAIV-infected ducks often shed virus asymptomatically. Migratory waterfowl, such as mallards, which are asymptomatically infected with HPAIVs may act as global carriers of the viruses. During the 2021/22 season, H5N1 and H5N8 HPAIVs caused 25 HPAI outbreaks on poultry premises. Through phylogenetic analysis of the hemagglutinin (HA) genes, these viruses were classified into three groups; G2a, G2b, and G2d (the E2 genotype referred to in Chapter 1 was classified in the G2a group). The study of Chapter 2 aimed to determine whether mallards without immunity to HPAIVs can be asymptomatically infected with viruses of these HA groups and carry them over long distances. Naïve mallards were inoculated with three representative strains of each HA group, and the infectivity and virulence of these strains in mallards were studied. Fertilized mallard eggs were purchased from a mallard farm and the mallards were raised until they were 12 weeks old. Serum samples were collected from all mallards before use in animal experiments to ensure that they were serologically negative for influenza A virus. Mallards were intranasally inoculated with the viruses at several doses ranging from 102.0 to 106.0 EID50. The 50% mallard infectious dose (MID50) for the three strains ranged from 102.50 to 103.75 EID50. The corresponding MID50 values were lower than the CID50 values previously reported, indicating higher infectivity of these strains in mallards than in chickens. All mallards infected with the G2a and G2b strains survived and most showed no clinical signs. Some mallards infected with the G2d strain died, but some mallards were asymptomatic, except when inoculated with a high viral dose (106 EID50). Mallards inoculated with each virus at a dose of 106 EID50 shed enough virus to infect others, exceeding the MID50 and CID50 values. This study showed that HPAIVs recently isolated in Japan were highly infectious to mallards, and that most infected mallards shed virus without clinical signs. These results suggest that mallards without immunity to HPAIVs may be long-distance carriers of the HPAIVs recently isolated in Japan. Chapter 3: Long-term immune responses induced in mallards by infection with HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season In Chapter 2, most mallards infected with HPAIVs isolated in Japan during the 2021/22 season showed no clinical signs and survived. HA is a key antigen-inducing antibody in the humoral immune response to AIVs, and the immune response induced by previous AIV infections has been reported to affect subsequent infections. During the 2021/22 season, the G2b group predominated in the first half of the season and the G2d group predominated in the second half of the season. These facts suggest the possibility that the wild mallards pre-infected with viruses of the G2b group must have been exposed to viruses of the G2d group. The question in Chapter 3 is whether individual wild mallards are repeatedly infected with HPAIVs and act as HPAIV carriers multiple times within a season. Twelve-week-old naïve mallards were inoculated with the three strains used in the experiment of Chapter 2 at low viral doses (10 MID50; dose ranged from 103.50 to 104.75 EID50), and the antibody dynamics in the sera were evaluated for 84 days. To test the efficacy of immunity at 84 dpi following the initial inoculation, the mallards were intranasally challenged with homologous or heterologous strains at low doses (10 MID50). Neutralizing (NT) antibody titers against homologous antigens in the three groups peaked between 28 and 56 dpi. The median maximum NT antibody titer in the three groups ranged from 269 to 806, and the median NT antibody titer at 84 dpi ranged from 106 to 395. In the homologous challenge experiments, all mallards were fully protected from the disease based on viral shedding, and their serum antibody titers were not markedly enhanced by the challenge, except for one mallard. This protection was also observed in the heterologous challenge, in which none of the mallards previously infected with the G2b strain shed virus after challenge with the G2d strain. This study demonstrated that a single low-dose HPAIV infection could induce efficacious immunity against a subsequent infection even after 84 days. These findings suggest that repeated infections with homologous and heterologous HPAIV strains do not occur frequently in individual wild mallards within a season, and that the frequency with which they act as carriers may be limited. These findings can be used to improve surveillance systems for wild birds which are mainly conducted to find HPAIVs. As described in Chapter 2, all mallards infected with the G2a strain survived and most did not shed viruses from the cloaca. The detection of HPAIVs that are not lethal to wild birds and are not excreted from the cloaca of infected birds may be difficult by testing only samples collected from dead birds and fecal samples of water birds. According to the data on serum antibody dynamics described in Chapter 3, it is possible to investigate the infection history by detecting antibodies in serum samples collected from birds infected with the virus at least two to 12 weeks prior. However, it is difficult to identify the strain that caused the infection because some HPAIV strains belonging to different HA groups show cross-reactivity. In the experiments described in Chapters 2 and 3, all infected mallards shed high titers of viruses from their tracheas. The virus in the trachea is excreted into the environment, such as in lakes, via foraging and other activities. The detection of viral genes in environmental water is thought to be a useful method for understanding the prevalence of HPAIVs in wild birds.近年、世界中の家きんや野鳥において高病原性鳥インフルエンザウイルス（HPAIV）が大流行しており、我が国では2020/21 シーズン（2020 年秋から2021年春まで）から2024/25シーズンまで5シーズン連続して家きん飼養施設で高病原性鳥インフルエンザ（HPAI）が発生している。家きん飼養施設でHPAIが発生した場合、家畜伝染病予防法に従った迅速な防疫対応により施設内の家きんは速やかに淘汰される。HPAIの発生が家きん産業に及ぼす被害は甚大であり、我が国では家きんの中でも飼養羽数が多いニワトリにおいて特に被害が大きい。そこで本論文の第1章では、近年に国内で分離されたHPAIVの感染に対するニワトリの感受性を感染試験により解析し、家きんにおけるHPAI 発生状況に強く影響するウイルスの特性の解明を試みた。また、HPAIV は渡り鳥により国内外に拡散されると考えられている。そこで第2章と第 3 章では日本の代表的な冬鳥であるマガモにおいて近年の国内分離株の感染に対する感受性を感染試験により解析し、マガモが近年の国内分離株のキャリアとなり得るかを評価した。全ての動物実験は農研機構病原性動物実験専門委員会の承認を得て（第1章の承認番号：第20-066号、20-078号、第20-084号、第21-001号、第21-026 号、第2章と第3章の承認番号：第R4-I002-NIAH号、第R4-I002-NIAH-2号、第R4-I002-NIAH-3号）、動物衛生研究部門のBSL3施設内で実施した。 第1章：2020/21シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスのニワトリにおける感染性と致死性、伝播性の解析 2020/21 シーズン、国内の家きん飼養施設ではH5N8亜型のHPAIVによる52件のHPAIが発生した。起因ウイルスは全8分節の遺伝子系統解析によりE1、E2、E3、E5、E7の5つの遺伝子型に分類され、家きんにおけるHPAI発生件数や地域は遺伝子型により異なっていた。本章では、各遺伝子型に属する計5株のHPAIVのニワトリに対する感染性と致死性、ニワトリ群内における伝播性を解析した。そして、これら特性の株間の違いと実際のHPAI発生状況を照らし合わせ、どの特性が発生状況に特に影響するかを考察した。まず、4週齢のニワトリに各遺伝子型のウイルスを102～106 50%発育鶏卵感染量（50% egg infectious dose; EID50）で経鼻接種し、感染成立に必要なウイルス量と感染ニワトリの経過を解析した。その結果、E2 と E3 遺伝子型のHPAIVの50%ニワトリ感染量（50% chicken infectious dose; CID50）は特に低く、それぞれ103.50 EID50と102.75 EID50であり、5株間の差は最大で101.88倍であった。高用量である106 EID50でウイルスを接種したニワトリの平均死亡時間においてもE2とE3遺伝子型のHPAIVの値は特に短く、それぞれ接種3.17日後と3.20日後であり、5株間の差は最大で2.43日であった。これらの結果から、E2とE3遺伝子型のHPAIVの感染性と致死性は他の遺伝子型のウイルスに比べ高いことが示された。次に、106 EID50でウイルスを接種したニワトリ1羽とウイルスを接種していないニワトリ6羽を同居させ、非接種ニワトリの感染率、すなわちウイルスの伝播率を解析した。E2、E3、E5遺伝子型のウイルスの伝播率は80%以上であった一方で、E1 とE7遺伝子型のウイルスの伝播率は20%以下であった。実際のHPAI発生状況と照らし合わせると、本章においてニワトリに高い感染性を示したE2とE3遺伝子型のHPAIVは多数の発生を広い地域（東から南日本）で起こした。一方、ニワトリに高い伝播性を示したE5遺伝子型も含め、低い感染性を示したE1、E5、E7遺伝子型のHPAIVに起因する発生は件数や地域が限定的であった。これらの結果から、本章で解析したウイルスの3つの特性の中で、ニワトリに対する感染性が同シーズンの家きんにおけるHPAI発生状況に強く影響したと考えられた。 第2章：2021/22シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスのマガモにおける感染性と致死性の解析 HPAIV に感染したカモ類は症状を示さないことが多く、マガモなどの渡り性のカモ類は感染後もウイルスを排出しながら移動することで様々な地域にHPAIVを拡散する。2021/22 シーズン、国内の家きん飼養施設では H5N1 亜型と H5N8 亜型のHPAIVによる25件のHPAIが発生し、起因ウイルスはHA遺伝子の系統解析によってG2a、G2b、G2d の3つのHAグループに分類された（第1章のE2遺伝子型はG2aグループである）。本章の目的は、HPAIVに初めて暴露されたマガモ、すなわちHPAIV に対する免疫を持たないマガモは近年の国内分離株を広域に拡散するキャリアとなり得るかを明らかにすることである。12 週齢のマガモに各 HA グループのHPAIVを102～106 EID50で経鼻接種し、感染性と致死性を解析した。試験に使用したマガモは農場より受精卵で購入し、人工的に孵化・飼育後、A型インフルエンザウイルスに対する血清抗体がないことを試験前に確認している。3株の50%マガモ感染量（50% mallard infectious dose; MID50）は 102.50～103.75 EID50であり、これは以前に報告された同株のCID50より低く、これら3株のマガモに対する感染性はニワトリに対する感染性より高いことが示された。G2aとG2bグループのHPAIVに感染したマガモは全羽生残し、ほとんどの感染マガモは無症状で経過した。一方、G2dグループのHPAIVに感染したマガモの経過は様々であり、低用量で感染したマガモの一部は無症状で経過し、高用量で感染したマガモの一部は死亡した。106 EID50のウイルスを接種したマガモの気管からはMID50と CID50の値を上回る量のウイルスが排出された。これらの結果から、HPAIV に対する免疫を持たないマガモは同シーズンの国内分離株に容易に感染し、感染後にウイルスを排出しながら移動することで広域にウイルスを拡散することが示唆された。 第3章：2021/22シーズンに国内で分離された高病原性鳥インフルエンザウイルスに対するマガモの長期的な免疫応答の解析 第2章において、2021/22シーズンのHPAIVに感染したマガモの多くは無症状で経過し、生残した。一般的に、HPAIV感染により宿主体内にはHAを主要な標的抗原とした体液性免疫が誘導される。野生のマガモは複数回HPAIVに暴露されると想定されるが、過去の感染により獲得した免疫はウイルスに再暴露された際の再感染の成立、そして再感染成立後の病態に影響する。2021/22シーズン、国内ではシーズン前半にG2bグループのHPAIVが主に流行し、後半にG2dグループのHPAIVが主に流行したことから、G2b グループの HPAIV に感染し生残した野生マガモは G2dグループの HPAIV に再び暴露されたことが想定される。第 3 章の目的はマガモがHPAIVに繰り返し感染することにより、1つのシーズン中に何度もHPAIVのキャリアとなり得るかを明らかにすることである。第2章と同じ3株を人工的に孵化・飼育したマガモに低用量（10 MID50; 103.50～104.75 EID50）で接種し、接種後84日間の血清抗体の推移を解析した後、免疫応答の有効性を同じもしくは異なる株を再接種することにより検証した。血清中の接種株に対する中和抗体価は接種28～56日後にピークとなり、3株の最高中和抗体価の中央値は268～806であった。3株の接種84日後の中和抗体価の中央値は106～395であり、接種84日後に同じ株を同じ用量で再接種したところ、全てのマガモにおいて再接種後のウイルス排出は認められず、再接種株に対する抗体価が大きく上昇したマガモも1羽のみであった。また、G2bグループのHPAIVに感染したマガモにG2dグループのHPAIVを再接種した場合においても、ウイルス排出を伴う再感染は認められなかった。これらの結果は、低用量かつ単回のウイルス接種であっても同シーズンのHPAIVはマガモに高いレベルの免疫応答を誘導することを示し、野生下においてマガモがHPAIVに繰り返し感染する頻度は高くなく、1個体が1つのシーズン中にHPAIVのキャリアとなる機会は限られている可能性を提示した。 本論文の結果は、野鳥を対象としたHPAIVのサーベイランス方法の検討に役立てることが出来る。第2章の研究結果では、感染マガモの多くは無症状で経過し、G2aグループのHPAIVに感染したマガモは総排泄腔からのウイルス排出がほぼ認められなかった。死亡野鳥と糞便検体を用いた調査のみでは、野鳥に対して致死性が低い株や感染鳥の糞便中に排出されにくい株の検出は難しい。第3章の研究結果から、少なくとも調査の2～12週間前の感染であれば、血清抗体の検出により感染歴を調べることが可能である。しかし、異なるHAグループに属するHPAIV間で交差反応性を示す場合があるため、感染した株を特定することは困難である。第2章と第3章のどちらにおいても、すべての感染マガモは気管から多くのウイルスを排出した。気管のウイルスは採食などにより湖水などの環境中に排出される。環境水等に含まれるウイルス遺伝子の検出は野鳥におけるHPAIVの流行状況を把握するための有用な手段となると考えられる。doctoral thesi