3D bioprinting of pancreatic islets

Hintergrund/Ziel: Um Langzeitkomplikationen bei Diabetes mellitus Typ 1 (T1D) zu verhindern, können Spenderinseln transplantiert werden, was allerdings lebenslange rigorose Immunsuppression erfordert. Durch Verkapselung der Inselzellen kann die Immunsuppression umgangen werden, aber Upscaling ist schwierig. Ziel dieser Arbeit war es, eine Strategie für das Plotting skalierbarer, semipermeabler, makroporöser Scaffolds mit einem großen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis zu entwickeln, um lebensfähige und funktionsfähige Pankreasinseln zu Plotten. Methoden: Die für diese Arbeit verwendete Hydrogelmischung bestand aus 3 % Alginat mit 9 % Methylcellulose (MC) als Verdickungsmittel, um eine plottbare Paste herzustellen. Die existierende Mischung musste für die Verwendung von hochaufgereinigtem, d. h. nicht immunogenem ('clinical-grade') Alginat anstelle des zuvor verwendeten zellverträglichen, aber weniger streng aufgereinigten ('research-grade') Alginates adaptiert werden. Für die Charakterisierung der zellfreien Mischung wurden immer Vergleiche zwischen Pasten gezogen, die mit den beiden verschiedenen Alginaten hergestellt wurden. Die Stabilität wurde über rheologische Messungen und die Freisetzung von Ionen und MC bestimmt. Die Permeabilität für Glukose und Insulin wurde mittels Aufnahme- und Freisetzungs-Assays sowie in einem für diese Arbeit entwickelten Diffusionskammersystem analysiert. Da sich Alginatgele als ausreichend permeabel erwiesen haben und eingekapselte Inseln ihre Funktionalität behalten, wurde die Permeabilität von Alginat- und Alg/MC-Gelen verglichen. In früheren Veröffentlichung wurde Alg/MC bereits als kompatibel mit dem Plotting von Einzelzellen beschrieben. Um die Kompatibilität mit endokrinen Zellen zu testen, wurde die β Zelllinie INS-1 verwendet und in Alg/MC Pasten, die mit unterschiedlich sterilisierter MC hergestellt worden waren, getestet. Für pankreatische Inseln, die als Zellcluster empfindlicher auf Scherstress reagieren als Einzelzellen, wurde erfolgreich ein Workflow für das Einbringen in die hochviskose Mischung entwickelt. Dabei wurden die Inseln mit einem Spatel vorsichtig in das Material gefaltet und mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 840 µm geplottet. Das Plotten pankreatischer Inseln wurde sowohl mit adulten Inseln aus der Ratte als auch mit neonatalen insel-ähnlichen Clustern aus dem Schwein (NICC) durchgeführt und auf Verteilung, Überleben, Apoptose und das Vorhandensein von Hormonen mit Färbungen getestet. Die Funktionalität wurde über Glukose-stimulierter Insulinsekretion (GSIR) analysiert, wobei Inseln Insulin in Reaktion auf hypoglykämische (3,3 mM Glukose) oder hyperglykämische (16,4 mM Glukose) Bedingungen freisetzen, welches im Überstand nachgewiesen wurde. Ergebnisse: Pasten, die mit den verschiedenen Alginaten hergestellt wurden, zeigten eine vergleichbare Viskosität, die für die Herstellung stabiler Strukturen geeignet ist. Clinical-grade Scaffolds hatten eine leicht geringere Vernetzungsdichte, was auf Unterschiede im M:G-Verhältnis zurückgeführt wurde. Mit 70 mM SrCl2 vernetzte Scaffolds blieben in RPMI+ über 21 Tage stabil. Die anhaltende Freisetzung von Vernetzungsionen über den Kultivierungszeitraum war unabhängig vom Alginattyp, aber abhängig von der Art des verwendeten Mediums. Innerhalb der ionisch vernetzten Scaffolds liegt die umgekehrt thermisch gelierende MC bei 37°C mit hoher Wahrscheinlichkeit teilweise geliert vor. Die Freisetzung von nicht gelierter MC konnte in Abhängigkeit der Temperatur gezeigt werden und wurde in allen getesteten Scaffold-varianten in unterschiedlicher Menge beobachtet. Bei Permeabilitätsanalysen folgte die im Kammersystem beobachtete allgemeine Kinetik der Diffusion dem normalen Verlauf der Diffusion durch Hydrogele. Die Permeabilität für Glukose war zwischen den Materialien vergleichbar, d.h. es konnte weder ein Einfluss des Alginat-Typs und der Vernetzungsdichte, noch des Vorhandenseins bzw. der Freisetzung von MC über die Zeit nachgewiesen werden. Die Permeabilität für Insulin muss aufgrund der Bindung an die Diffusionskammer und der mangelnden Stabilität der Gelscheiben in weiteren Experimenten verifiziert werden. Eine vorläufige Schlussfolgerung aus den hier vorgestellten Ergebnissen ist eine leicht verringerte Permeabilität in Alg/MC-Gelen im Vergleich zu reinen Alginatgelen. INS-1 wurden erfolgreich in Alg/MC geplottet. Die Überlebensrate direkt nach dem Plotten war in Anbetracht der Raten immortalisierter mesenchymaler Stammzellen vergleichsweise gering, INS-1 erholten sich jedoch innerhalb einer Woche und proliferierten innerhalb der Scaffolds zu großen metabolisch aktiven Zellclustern. Dies war abhängig von der Sterilisationsmethode: Die Verwendung autoklavierter sowie UV-sterilisierter MC resultierte in Pasten die das Überleben unterstützten. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung von mit überkritischem CO2 sterilisierter MC nicht zur Entwicklung von Zellclustern. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende Ratteninseln lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Vergleichbar mit Kontrollinseln in Suspensionskultur betrug die Viabilität geplotteter Inseln über einen Zeitraum von 14 Tagen 70-80 %. Der DNA-Gehalt der Scaffolds reduzierte sich über insgesamt 21 Tage stark. In allen über 7 Tage analysierten Inseln war eine begrenzte Menge apoptotischer Kerne vorhanden. In den Kontrollinseln waren diese bevorzugt zentral, in den geplotteten Inseln bevorzugt peripher lokalisiert. Die Anzahl der apoptotischen Kerne unterschied sich zwischen den Kontrollinseln und den geplotteten Inseln nicht signifikant. Insgesamt blieben die Morphologie und die Viabilität der Inseln während des Einbringens in die Mischung und beim Plotten erhalten. Die pankreatischen Hormone Insulin und Glukagon wurden in der Kontrolle und der geplotteten Inseln in angemessener Verteilung und Lokalisation nachgewiesen. Die Stimulation der Ratteninseln wurde über insgesamt 7 Isolationen verifiziert und zeigte eine geringere ab-solute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln als aus den Kontrollinseln, aber an Tag 4 und 7 der Kultur einen vergleichbaren aus dem GSIR berechneten Stimulationsindex (SI). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Insulinsekretion bei sukzessiv variierender Stimulation mit Glukose dem Verlauf der Glukosekonzentration folgt. Dies zeigt, dass die geplotteten Inseln die externe Glukosekonzentration nachweislich wahrnehmen und entsprechend reagieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die absolute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln zwar geringer war als die der Kontrollinseln, die relative Funktionalität in den geplotteten Scaffolds jedoch erhalten blieb. Zur Validierung der Ergebnisse von adulten Ratteninseln wurden in einer vorläufigen Studie die potentiell klinisch translatierbaren, aber empfindlicheren, NICC verwendet. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende NICC, lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Die Viabilität der NICC war mit etwa 60 % vergleichsweise gering, aber vergleichbar mit der der Kontroll-NICC und änderte sich über einen Kultivierungszeitraum von 21 Tagen nicht signifikant. In allen geplotteten NICC konnten lebendige Zellen nachgewiesen werden, während eine geringe Anzahl Kontroll-NICC in der Lebendfärbung fast kein Signal zeigten. Die Anzahl der apoptotischen Kerne nahm im Verlauf von 7 Tagen bei den geplotteten, nicht aber bei den Kontroll-NICC signifikant zu. Die pankreatischen Hormone Insulin, Glukagon und Somatostatin wurden in einer geringen Anzahl von zufällig innerhalb der Cluster verteilten Zellen über einen Zeitraum von 7 Tagen nachgewiesen. Die Funktionalität wurde weder durch das Einbringen in das Material noch durch das Plotten beeinflusst. Unter Verwendung eines GLP-1-Analogons zur Amplifikation der Reaktion zeigten geplottete und Kontroll-NICC eine vergleichbare Funktionalität. Der SI nahm im Laufe der Kultivierungszeit jedoch ab und lag nach 14 bzw. 21 Tagen Kultur in geplotteten und Kontrollproben unter 2. Schlussfolgerungen: Die adaptierte Alg/MC-Mischung zeigte ausreichende Stabilität und Permeabilität für das Plotten pankreatischer Inseln. In einer Proof-of-Concept-Studie mit adulten Ratteninseln wurde gezeigt, dass die hier adaptierte Alg/MC-Mischung generell für das Plotting lebendiger und funktionaler pankreatischer Inseln geeignet ist. Vorläufige Ergebnisse, die mit einer geringen Anzahl von Wiederholungen und Proben erstellt wurden, deuten darauf hin, dass Alg/MC auch ein grundlegend geeignetes Material für das Plotten von NICC ist. Die weitere Charakterisierung und insbesondere die weitere Materialadaption zur Unterstützung des Überlebens und der Ausreifung von NICC in vitro werden in einer Folgestudie vorgenommen werden.:Table of contents Abbreviations 1 1 Motivation 3 2 Introduction and state of the art 5 2.1 Pancreatic islets and diabetes mellitus type 1 5 2.1.1 Anatomy and function of the pancreas and pancreatic islets 5 2.1.2 Insulin biosynthesis, release and function 7 2.1.3 Diabetes mellitus type 1 (T1D) 9 2.1.4 Current treatment options for T1D 11 2.2 Surgical replacement of β-cells 13 2.2.1 Islet transplantation 13 2.2.2 Xenotransplantation 15 2.2.3 Encapsulation of islets 17 2.3 3D bioprinting in medical research 22 2.3.1 Extrusion-based 3D bioprinting 22 2.3.2 Bioplotting of islets 24 3 Materials & Methods 26 3.1 Cell culture 26 3.1.1 Cell lines 26 3.1.2 Primary islets from rat 26 3.1.3 Neonatal porcine islet-like cell clusters 27 3.2 Material preparation and characterisation 27 3.2.1 Hydrogel preparation 27 3.2.2 3D plotting of cell-free hydrogels for material characterisation 28 3.2.3 Rheological characterisation 28 3.2.4 Quantification of ion release 29 3.2.5 Determination of methylcellulose content 29 3.2.6 Preparation of cell-free hydrogel discs 29 3.2.7 Permeability measurements 30 3.3 Plotting and characterisation of cell-laden constructs 32 3.3.1 Incorporation of cells & scaffold preparation 32 3.3.2 Staining methods for the characterisation of (embedded) cells 32 3.3.3 Functional analysis of islets: Glucose stimulated insulin release (GSIR) 34 3.4 Statistics 35 4 Results 36 4.1 Adaptation & characterisation of cell-free Alg/MC 36 4.1.1 Paste viscosity and scaffold stability 36 4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions 38 4.1.3 Permeability for glucose & insulin 42 4.2 Adaptation & characterisation of islet cell incorporation into the Alg/MC blend 58 4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and behaviour 58 4.2.2 Incorporation of pancreatic islets into the highly viscous Alg/MC blend 61 4.2.3 Needle diameter for the plotting of pancreatic islets 64 4.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 66 4.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 66 4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 74 4.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 80 4.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted NICC 80 4.4.2 Functionality of bioplotted NICC 87 5 Discussion 92 5.1 Cell-free Alg/MC 93 5.1.1 Gel viscosity and crosslinking of alginate 93 5.1.2 Release of MC 99 5.1.3 Permeability for glucose & insulin 106 5.2 Cell incorporation into Alg/MC 118 5.2.1 Incorporation of β-cells 118 5.2.2 Incorporation of pancreatic islets 119 5.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 121 5.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 121 5.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 124 5.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 127 5.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 127 5.4.2 Functionality of bioplotted NICC 130 Summary 134 Zusammenfassung 137 References 140 Addendum 172 A.1 Supplementary data for the results 172 Supplementary data for “4.1.1. Paste viscosity and scaffold stability” 172 Supplementary data for “4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions” 173 Supplementary data for “4.1.3 Permeability for glucose & insulin” 175 Supplementary data for “4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and beha-viour” 178 Supplementary data for “4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets” 182 Supplementary data for “4.4.2 Functionality of bioplotted NICC” 187 A.2 Supplementary data for the discussion 189 Supplementary data for “5.1.1. Gel viscosity and crosslinking of alginate” 189 Supplementary data for “5.1.2. MC release” 191 Supplementary data for “5.1.3 Permeability for glucose & insulin” 195 Supplementary data for “5.2.1 Incorporation of β-cells” 197 Supplementary data for “5.4.1 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC)” 198 List of figures 196 List of tables 197 List of publications 198 Acknowledgements 20

Transcriptional decomposition reveals active chromatin architectures and cell specific regulatory interactions

Transcriptional regulation is coupled with chromosomal positioning and chromatin architecture. Here the authors develop a transcriptional decomposition approach to separate expression associated with genome structure from independent effects not directly associated with genomic positioning

Nutrition, diet and immunosenescence

Ageing is characterized by immunosenescence and the progressive decline in immunity in association with an increased frequency of infections and chronic disease. This complex process affects both the innate and adaptive immune systems with a progressive decline in most immune cell populations and defects in activation resulting in loss of function. Although host genetics and environmental factors, such as stress, exercise and diet can impact on the onset or course of immunosenescence, the mechanisms involved are largely unknown. This review focusses on identifying the most significant aspects of immunosenescence and on the evidence that nutritional intervention might delay this process, and consequently improve the quality of life of the elderly

Genetic contributors to risk of schizophrenia in the presence of a 22q11.2 deletion

Schizophrenia occurs in about one in four individuals with 22q11.2 deletion syndrome (22q11.2DS). The aim of this International Brain and Behavior 22q11.2DS Consortium (IBBC) study was to identify genetic factors that contribute to schizophrenia, in addition to the ~20-fold increased risk conveyed by the 22q11.2 deletion. Using whole-genome sequencing data from 519 unrelated individuals with 22q11.2DS, we conducted genome-wide comparisons of common and rare variants between those with schizophrenia and those with no psychotic disorder at age ≥25 years. Available microarray data enabled direct comparison of polygenic risk for schizophrenia between 22q11.2DS and independent population samples with no 22q11.2 deletion, with and without schizophrenia (total n = 35,182). Polygenic risk for schizophrenia within 22q11.2DS was significantly greater for those with schizophrenia (padj = 6.73 × 10−6). Novel reciprocal case–control comparisons between the 22q11.2DS and population-based cohorts showed that polygenic risk score was significantly greater in individuals with psychotic illness, regardless of the presence of the 22q11.2 deletion. Within the 22q11.2DS cohort, results of gene-set analyses showed some support for rare variants affecting synaptic genes. No common or rare variants within the 22q11.2 deletion region were significantly associated with schizophrenia. These findings suggest that in addition to the deletion conferring a greatly increased risk to schizophrenia, the risk is higher when the 22q11.2 deletion and common polygenic risk factors that contribute to schizophrenia in the general population are both present

3D bioprinting of pancreatic islets

Hintergrund/Ziel: Um Langzeitkomplikationen bei Diabetes mellitus Typ 1 (T1D) zu verhindern, können Spenderinseln transplantiert werden, was allerdings lebenslange rigorose Immunsuppression erfordert. Durch Verkapselung der Inselzellen kann die Immunsuppression umgangen werden, aber Upscaling ist schwierig. Ziel dieser Arbeit war es, eine Strategie für das Plotting skalierbarer, semipermeabler, makroporöser Scaffolds mit einem großen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis zu entwickeln, um lebensfähige und funktionsfähige Pankreasinseln zu Plotten. Methoden: Die für diese Arbeit verwendete Hydrogelmischung bestand aus 3 % Alginat mit 9 % Methylcellulose (MC) als Verdickungsmittel, um eine plottbare Paste herzustellen. Die existierende Mischung musste für die Verwendung von hochaufgereinigtem, d. h. nicht immunogenem ('clinical-grade') Alginat anstelle des zuvor verwendeten zellverträglichen, aber weniger streng aufgereinigten ('research-grade') Alginates adaptiert werden. Für die Charakterisierung der zellfreien Mischung wurden immer Vergleiche zwischen Pasten gezogen, die mit den beiden verschiedenen Alginaten hergestellt wurden. Die Stabilität wurde über rheologische Messungen und die Freisetzung von Ionen und MC bestimmt. Die Permeabilität für Glukose und Insulin wurde mittels Aufnahme- und Freisetzungs-Assays sowie in einem für diese Arbeit entwickelten Diffusionskammersystem analysiert. Da sich Alginatgele als ausreichend permeabel erwiesen haben und eingekapselte Inseln ihre Funktionalität behalten, wurde die Permeabilität von Alginat- und Alg/MC-Gelen verglichen. In früheren Veröffentlichung wurde Alg/MC bereits als kompatibel mit dem Plotting von Einzelzellen beschrieben. Um die Kompatibilität mit endokrinen Zellen zu testen, wurde die β Zelllinie INS-1 verwendet und in Alg/MC Pasten, die mit unterschiedlich sterilisierter MC hergestellt worden waren, getestet. Für pankreatische Inseln, die als Zellcluster empfindlicher auf Scherstress reagieren als Einzelzellen, wurde erfolgreich ein Workflow für das Einbringen in die hochviskose Mischung entwickelt. Dabei wurden die Inseln mit einem Spatel vorsichtig in das Material gefaltet und mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 840 µm geplottet. Das Plotten pankreatischer Inseln wurde sowohl mit adulten Inseln aus der Ratte als auch mit neonatalen insel-ähnlichen Clustern aus dem Schwein (NICC) durchgeführt und auf Verteilung, Überleben, Apoptose und das Vorhandensein von Hormonen mit Färbungen getestet. Die Funktionalität wurde über Glukose-stimulierter Insulinsekretion (GSIR) analysiert, wobei Inseln Insulin in Reaktion auf hypoglykämische (3,3 mM Glukose) oder hyperglykämische (16,4 mM Glukose) Bedingungen freisetzen, welches im Überstand nachgewiesen wurde. Ergebnisse: Pasten, die mit den verschiedenen Alginaten hergestellt wurden, zeigten eine vergleichbare Viskosität, die für die Herstellung stabiler Strukturen geeignet ist. Clinical-grade Scaffolds hatten eine leicht geringere Vernetzungsdichte, was auf Unterschiede im M:G-Verhältnis zurückgeführt wurde. Mit 70 mM SrCl2 vernetzte Scaffolds blieben in RPMI+ über 21 Tage stabil. Die anhaltende Freisetzung von Vernetzungsionen über den Kultivierungszeitraum war unabhängig vom Alginattyp, aber abhängig von der Art des verwendeten Mediums. Innerhalb der ionisch vernetzten Scaffolds liegt die umgekehrt thermisch gelierende MC bei 37°C mit hoher Wahrscheinlichkeit teilweise geliert vor. Die Freisetzung von nicht gelierter MC konnte in Abhängigkeit der Temperatur gezeigt werden und wurde in allen getesteten Scaffold-varianten in unterschiedlicher Menge beobachtet. Bei Permeabilitätsanalysen folgte die im Kammersystem beobachtete allgemeine Kinetik der Diffusion dem normalen Verlauf der Diffusion durch Hydrogele. Die Permeabilität für Glukose war zwischen den Materialien vergleichbar, d.h. es konnte weder ein Einfluss des Alginat-Typs und der Vernetzungsdichte, noch des Vorhandenseins bzw. der Freisetzung von MC über die Zeit nachgewiesen werden. Die Permeabilität für Insulin muss aufgrund der Bindung an die Diffusionskammer und der mangelnden Stabilität der Gelscheiben in weiteren Experimenten verifiziert werden. Eine vorläufige Schlussfolgerung aus den hier vorgestellten Ergebnissen ist eine leicht verringerte Permeabilität in Alg/MC-Gelen im Vergleich zu reinen Alginatgelen. INS-1 wurden erfolgreich in Alg/MC geplottet. Die Überlebensrate direkt nach dem Plotten war in Anbetracht der Raten immortalisierter mesenchymaler Stammzellen vergleichsweise gering, INS-1 erholten sich jedoch innerhalb einer Woche und proliferierten innerhalb der Scaffolds zu großen metabolisch aktiven Zellclustern. Dies war abhängig von der Sterilisationsmethode: Die Verwendung autoklavierter sowie UV-sterilisierter MC resultierte in Pasten die das Überleben unterstützten. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung von mit überkritischem CO2 sterilisierter MC nicht zur Entwicklung von Zellclustern. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende Ratteninseln lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Vergleichbar mit Kontrollinseln in Suspensionskultur betrug die Viabilität geplotteter Inseln über einen Zeitraum von 14 Tagen 70-80 %. Der DNA-Gehalt der Scaffolds reduzierte sich über insgesamt 21 Tage stark. In allen über 7 Tage analysierten Inseln war eine begrenzte Menge apoptotischer Kerne vorhanden. In den Kontrollinseln waren diese bevorzugt zentral, in den geplotteten Inseln bevorzugt peripher lokalisiert. Die Anzahl der apoptotischen Kerne unterschied sich zwischen den Kontrollinseln und den geplotteten Inseln nicht signifikant. Insgesamt blieben die Morphologie und die Viabilität der Inseln während des Einbringens in die Mischung und beim Plotten erhalten. Die pankreatischen Hormone Insulin und Glukagon wurden in der Kontrolle und der geplotteten Inseln in angemessener Verteilung und Lokalisation nachgewiesen. Die Stimulation der Ratteninseln wurde über insgesamt 7 Isolationen verifiziert und zeigte eine geringere ab-solute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln als aus den Kontrollinseln, aber an Tag 4 und 7 der Kultur einen vergleichbaren aus dem GSIR berechneten Stimulationsindex (SI). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Insulinsekretion bei sukzessiv variierender Stimulation mit Glukose dem Verlauf der Glukosekonzentration folgt. Dies zeigt, dass die geplotteten Inseln die externe Glukosekonzentration nachweislich wahrnehmen und entsprechend reagieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die absolute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln zwar geringer war als die der Kontrollinseln, die relative Funktionalität in den geplotteten Scaffolds jedoch erhalten blieb. Zur Validierung der Ergebnisse von adulten Ratteninseln wurden in einer vorläufigen Studie die potentiell klinisch translatierbaren, aber empfindlicheren, NICC verwendet. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende NICC, lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Die Viabilität der NICC war mit etwa 60 % vergleichsweise gering, aber vergleichbar mit der der Kontroll-NICC und änderte sich über einen Kultivierungszeitraum von 21 Tagen nicht signifikant. In allen geplotteten NICC konnten lebendige Zellen nachgewiesen werden, während eine geringe Anzahl Kontroll-NICC in der Lebendfärbung fast kein Signal zeigten. Die Anzahl der apoptotischen Kerne nahm im Verlauf von 7 Tagen bei den geplotteten, nicht aber bei den Kontroll-NICC signifikant zu. Die pankreatischen Hormone Insulin, Glukagon und Somatostatin wurden in einer geringen Anzahl von zufällig innerhalb der Cluster verteilten Zellen über einen Zeitraum von 7 Tagen nachgewiesen. Die Funktionalität wurde weder durch das Einbringen in das Material noch durch das Plotten beeinflusst. Unter Verwendung eines GLP-1-Analogons zur Amplifikation der Reaktion zeigten geplottete und Kontroll-NICC eine vergleichbare Funktionalität. Der SI nahm im Laufe der Kultivierungszeit jedoch ab und lag nach 14 bzw. 21 Tagen Kultur in geplotteten und Kontrollproben unter 2. Schlussfolgerungen: Die adaptierte Alg/MC-Mischung zeigte ausreichende Stabilität und Permeabilität für das Plotten pankreatischer Inseln. In einer Proof-of-Concept-Studie mit adulten Ratteninseln wurde gezeigt, dass die hier adaptierte Alg/MC-Mischung generell für das Plotting lebendiger und funktionaler pankreatischer Inseln geeignet ist. Vorläufige Ergebnisse, die mit einer geringen Anzahl von Wiederholungen und Proben erstellt wurden, deuten darauf hin, dass Alg/MC auch ein grundlegend geeignetes Material für das Plotten von NICC ist. Die weitere Charakterisierung und insbesondere die weitere Materialadaption zur Unterstützung des Überlebens und der Ausreifung von NICC in vitro werden in einer Folgestudie vorgenommen werden.:Table of contents Abbreviations 1 1 Motivation 3 2 Introduction and state of the art 5 2.1 Pancreatic islets and diabetes mellitus type 1 5 2.1.1 Anatomy and function of the pancreas and pancreatic islets 5 2.1.2 Insulin biosynthesis, release and function 7 2.1.3 Diabetes mellitus type 1 (T1D) 9 2.1.4 Current treatment options for T1D 11 2.2 Surgical replacement of β-cells 13 2.2.1 Islet transplantation 13 2.2.2 Xenotransplantation 15 2.2.3 Encapsulation of islets 17 2.3 3D bioprinting in medical research 22 2.3.1 Extrusion-based 3D bioprinting 22 2.3.2 Bioplotting of islets 24 3 Materials & Methods 26 3.1 Cell culture 26 3.1.1 Cell lines 26 3.1.2 Primary islets from rat 26 3.1.3 Neonatal porcine islet-like cell clusters 27 3.2 Material preparation and characterisation 27 3.2.1 Hydrogel preparation 27 3.2.2 3D plotting of cell-free hydrogels for material characterisation 28 3.2.3 Rheological characterisation 28 3.2.4 Quantification of ion release 29 3.2.5 Determination of methylcellulose content 29 3.2.6 Preparation of cell-free hydrogel discs 29 3.2.7 Permeability measurements 30 3.3 Plotting and characterisation of cell-laden constructs 32 3.3.1 Incorporation of cells & scaffold preparation 32 3.3.2 Staining methods for the characterisation of (embedded) cells 32 3.3.3 Functional analysis of islets: Glucose stimulated insulin release (GSIR) 34 3.4 Statistics 35 4 Results 36 4.1 Adaptation & characterisation of cell-free Alg/MC 36 4.1.1 Paste viscosity and scaffold stability 36 4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions 38 4.1.3 Permeability for glucose & insulin 42 4.2 Adaptation & characterisation of islet cell incorporation into the Alg/MC blend 58 4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and behaviour 58 4.2.2 Incorporation of pancreatic islets into the highly viscous Alg/MC blend 61 4.2.3 Needle diameter for the plotting of pancreatic islets 64 4.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 66 4.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 66 4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 74 4.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 80 4.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted NICC 80 4.4.2 Functionality of bioplotted NICC 87 5 Discussion 92 5.1 Cell-free Alg/MC 93 5.1.1 Gel viscosity and crosslinking of alginate 93 5.1.2 Release of MC 99 5.1.3 Permeability for glucose & insulin 106 5.2 Cell incorporation into Alg/MC 118 5.2.1 Incorporation of β-cells 118 5.2.2 Incorporation of pancreatic islets 119 5.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 121 5.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 121 5.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 124 5.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 127 5.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 127 5.4.2 Functionality of bioplotted NICC 130 Summary 134 Zusammenfassung 137 References 140 Addendum 172 A.1 Supplementary data for the results 172 Supplementary data for “4.1.1. Paste viscosity and scaffold stability” 172 Supplementary data for “4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions” 173 Supplementary data for “4.1.3 Permeability for glucose & insulin” 175 Supplementary data for “4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and beha-viour” 178 Supplementary data for “4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets” 182 Supplementary data for “4.4.2 Functionality of bioplotted NICC” 187 A.2 Supplementary data for the discussion 189 Supplementary data for “5.1.1. Gel viscosity and crosslinking of alginate” 189 Supplementary data for “5.1.2. MC release” 191 Supplementary data for “5.1.3 Permeability for glucose & insulin” 195 Supplementary data for “5.2.1 Incorporation of β-cells” 197 Supplementary data for “5.4.1 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC)” 198 List of figures 196 List of tables 197 List of publications 198 Acknowledgements 20

3D bioprinting of pancreatic islets

Hintergrund/Ziel: Um Langzeitkomplikationen bei Diabetes mellitus Typ 1 (T1D) zu verhindern, können Spenderinseln transplantiert werden, was allerdings lebenslange rigorose Immunsuppression erfordert. Durch Verkapselung der Inselzellen kann die Immunsuppression umgangen werden, aber Upscaling ist schwierig. Ziel dieser Arbeit war es, eine Strategie für das Plotting skalierbarer, semipermeabler, makroporöser Scaffolds mit einem großen Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis zu entwickeln, um lebensfähige und funktionsfähige Pankreasinseln zu Plotten. Methoden: Die für diese Arbeit verwendete Hydrogelmischung bestand aus 3 % Alginat mit 9 % Methylcellulose (MC) als Verdickungsmittel, um eine plottbare Paste herzustellen. Die existierende Mischung musste für die Verwendung von hochaufgereinigtem, d. h. nicht immunogenem ('clinical-grade') Alginat anstelle des zuvor verwendeten zellverträglichen, aber weniger streng aufgereinigten ('research-grade') Alginates adaptiert werden. Für die Charakterisierung der zellfreien Mischung wurden immer Vergleiche zwischen Pasten gezogen, die mit den beiden verschiedenen Alginaten hergestellt wurden. Die Stabilität wurde über rheologische Messungen und die Freisetzung von Ionen und MC bestimmt. Die Permeabilität für Glukose und Insulin wurde mittels Aufnahme- und Freisetzungs-Assays sowie in einem für diese Arbeit entwickelten Diffusionskammersystem analysiert. Da sich Alginatgele als ausreichend permeabel erwiesen haben und eingekapselte Inseln ihre Funktionalität behalten, wurde die Permeabilität von Alginat- und Alg/MC-Gelen verglichen. In früheren Veröffentlichung wurde Alg/MC bereits als kompatibel mit dem Plotting von Einzelzellen beschrieben. Um die Kompatibilität mit endokrinen Zellen zu testen, wurde die β Zelllinie INS-1 verwendet und in Alg/MC Pasten, die mit unterschiedlich sterilisierter MC hergestellt worden waren, getestet. Für pankreatische Inseln, die als Zellcluster empfindlicher auf Scherstress reagieren als Einzelzellen, wurde erfolgreich ein Workflow für das Einbringen in die hochviskose Mischung entwickelt. Dabei wurden die Inseln mit einem Spatel vorsichtig in das Material gefaltet und mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 840 µm geplottet. Das Plotten pankreatischer Inseln wurde sowohl mit adulten Inseln aus der Ratte als auch mit neonatalen insel-ähnlichen Clustern aus dem Schwein (NICC) durchgeführt und auf Verteilung, Überleben, Apoptose und das Vorhandensein von Hormonen mit Färbungen getestet. Die Funktionalität wurde über Glukose-stimulierter Insulinsekretion (GSIR) analysiert, wobei Inseln Insulin in Reaktion auf hypoglykämische (3,3 mM Glukose) oder hyperglykämische (16,4 mM Glukose) Bedingungen freisetzen, welches im Überstand nachgewiesen wurde. Ergebnisse: Pasten, die mit den verschiedenen Alginaten hergestellt wurden, zeigten eine vergleichbare Viskosität, die für die Herstellung stabiler Strukturen geeignet ist. Clinical-grade Scaffolds hatten eine leicht geringere Vernetzungsdichte, was auf Unterschiede im M:G-Verhältnis zurückgeführt wurde. Mit 70 mM SrCl2 vernetzte Scaffolds blieben in RPMI+ über 21 Tage stabil. Die anhaltende Freisetzung von Vernetzungsionen über den Kultivierungszeitraum war unabhängig vom Alginattyp, aber abhängig von der Art des verwendeten Mediums. Innerhalb der ionisch vernetzten Scaffolds liegt die umgekehrt thermisch gelierende MC bei 37°C mit hoher Wahrscheinlichkeit teilweise geliert vor. Die Freisetzung von nicht gelierter MC konnte in Abhängigkeit der Temperatur gezeigt werden und wurde in allen getesteten Scaffold-varianten in unterschiedlicher Menge beobachtet. Bei Permeabilitätsanalysen folgte die im Kammersystem beobachtete allgemeine Kinetik der Diffusion dem normalen Verlauf der Diffusion durch Hydrogele. Die Permeabilität für Glukose war zwischen den Materialien vergleichbar, d.h. es konnte weder ein Einfluss des Alginat-Typs und der Vernetzungsdichte, noch des Vorhandenseins bzw. der Freisetzung von MC über die Zeit nachgewiesen werden. Die Permeabilität für Insulin muss aufgrund der Bindung an die Diffusionskammer und der mangelnden Stabilität der Gelscheiben in weiteren Experimenten verifiziert werden. Eine vorläufige Schlussfolgerung aus den hier vorgestellten Ergebnissen ist eine leicht verringerte Permeabilität in Alg/MC-Gelen im Vergleich zu reinen Alginatgelen. INS-1 wurden erfolgreich in Alg/MC geplottet. Die Überlebensrate direkt nach dem Plotten war in Anbetracht der Raten immortalisierter mesenchymaler Stammzellen vergleichsweise gering, INS-1 erholten sich jedoch innerhalb einer Woche und proliferierten innerhalb der Scaffolds zu großen metabolisch aktiven Zellclustern. Dies war abhängig von der Sterilisationsmethode: Die Verwendung autoklavierter sowie UV-sterilisierter MC resultierte in Pasten die das Überleben unterstützten. Im Gegensatz dazu führte die Verwendung von mit überkritischem CO2 sterilisierter MC nicht zur Entwicklung von Zellclustern. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende Ratteninseln lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Vergleichbar mit Kontrollinseln in Suspensionskultur betrug die Viabilität geplotteter Inseln über einen Zeitraum von 14 Tagen 70-80 %. Der DNA-Gehalt der Scaffolds reduzierte sich über insgesamt 21 Tage stark. In allen über 7 Tage analysierten Inseln war eine begrenzte Menge apoptotischer Kerne vorhanden. In den Kontrollinseln waren diese bevorzugt zentral, in den geplotteten Inseln bevorzugt peripher lokalisiert. Die Anzahl der apoptotischen Kerne unterschied sich zwischen den Kontrollinseln und den geplotteten Inseln nicht signifikant. Insgesamt blieben die Morphologie und die Viabilität der Inseln während des Einbringens in die Mischung und beim Plotten erhalten. Die pankreatischen Hormone Insulin und Glukagon wurden in der Kontrolle und der geplotteten Inseln in angemessener Verteilung und Lokalisation nachgewiesen. Die Stimulation der Ratteninseln wurde über insgesamt 7 Isolationen verifiziert und zeigte eine geringere ab-solute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln als aus den Kontrollinseln, aber an Tag 4 und 7 der Kultur einen vergleichbaren aus dem GSIR berechneten Stimulationsindex (SI). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Insulinsekretion bei sukzessiv variierender Stimulation mit Glukose dem Verlauf der Glukosekonzentration folgt. Dies zeigt, dass die geplotteten Inseln die externe Glukosekonzentration nachweislich wahrnehmen und entsprechend reagieren. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die absolute Insulinsekretion aus den geplotteten Inseln zwar geringer war als die der Kontrollinseln, die relative Funktionalität in den geplotteten Scaffolds jedoch erhalten blieb. Zur Validierung der Ergebnisse von adulten Ratteninseln wurden in einer vorläufigen Studie die potentiell klinisch translatierbaren, aber empfindlicheren, NICC verwendet. Metabolisch aktive, Insulin enthaltende NICC, lagen innerhalb der Scaffolds gleichmäßig verteilt vor. Die Viabilität der NICC war mit etwa 60 % vergleichsweise gering, aber vergleichbar mit der der Kontroll-NICC und änderte sich über einen Kultivierungszeitraum von 21 Tagen nicht signifikant. In allen geplotteten NICC konnten lebendige Zellen nachgewiesen werden, während eine geringe Anzahl Kontroll-NICC in der Lebendfärbung fast kein Signal zeigten. Die Anzahl der apoptotischen Kerne nahm im Verlauf von 7 Tagen bei den geplotteten, nicht aber bei den Kontroll-NICC signifikant zu. Die pankreatischen Hormone Insulin, Glukagon und Somatostatin wurden in einer geringen Anzahl von zufällig innerhalb der Cluster verteilten Zellen über einen Zeitraum von 7 Tagen nachgewiesen. Die Funktionalität wurde weder durch das Einbringen in das Material noch durch das Plotten beeinflusst. Unter Verwendung eines GLP-1-Analogons zur Amplifikation der Reaktion zeigten geplottete und Kontroll-NICC eine vergleichbare Funktionalität. Der SI nahm im Laufe der Kultivierungszeit jedoch ab und lag nach 14 bzw. 21 Tagen Kultur in geplotteten und Kontrollproben unter 2. Schlussfolgerungen: Die adaptierte Alg/MC-Mischung zeigte ausreichende Stabilität und Permeabilität für das Plotten pankreatischer Inseln. In einer Proof-of-Concept-Studie mit adulten Ratteninseln wurde gezeigt, dass die hier adaptierte Alg/MC-Mischung generell für das Plotting lebendiger und funktionaler pankreatischer Inseln geeignet ist. Vorläufige Ergebnisse, die mit einer geringen Anzahl von Wiederholungen und Proben erstellt wurden, deuten darauf hin, dass Alg/MC auch ein grundlegend geeignetes Material für das Plotten von NICC ist. Die weitere Charakterisierung und insbesondere die weitere Materialadaption zur Unterstützung des Überlebens und der Ausreifung von NICC in vitro werden in einer Folgestudie vorgenommen werden.:Table of contents Abbreviations 1 1 Motivation 3 2 Introduction and state of the art 5 2.1 Pancreatic islets and diabetes mellitus type 1 5 2.1.1 Anatomy and function of the pancreas and pancreatic islets 5 2.1.2 Insulin biosynthesis, release and function 7 2.1.3 Diabetes mellitus type 1 (T1D) 9 2.1.4 Current treatment options for T1D 11 2.2 Surgical replacement of β-cells 13 2.2.1 Islet transplantation 13 2.2.2 Xenotransplantation 15 2.2.3 Encapsulation of islets 17 2.3 3D bioprinting in medical research 22 2.3.1 Extrusion-based 3D bioprinting 22 2.3.2 Bioplotting of islets 24 3 Materials & Methods 26 3.1 Cell culture 26 3.1.1 Cell lines 26 3.1.2 Primary islets from rat 26 3.1.3 Neonatal porcine islet-like cell clusters 27 3.2 Material preparation and characterisation 27 3.2.1 Hydrogel preparation 27 3.2.2 3D plotting of cell-free hydrogels for material characterisation 28 3.2.3 Rheological characterisation 28 3.2.4 Quantification of ion release 29 3.2.5 Determination of methylcellulose content 29 3.2.6 Preparation of cell-free hydrogel discs 29 3.2.7 Permeability measurements 30 3.3 Plotting and characterisation of cell-laden constructs 32 3.3.1 Incorporation of cells & scaffold preparation 32 3.3.2 Staining methods for the characterisation of (embedded) cells 32 3.3.3 Functional analysis of islets: Glucose stimulated insulin release (GSIR) 34 3.4 Statistics 35 4 Results 36 4.1 Adaptation & characterisation of cell-free Alg/MC 36 4.1.1 Paste viscosity and scaffold stability 36 4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions 38 4.1.3 Permeability for glucose & insulin 42 4.2 Adaptation & characterisation of islet cell incorporation into the Alg/MC blend 58 4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and behaviour 58 4.2.2 Incorporation of pancreatic islets into the highly viscous Alg/MC blend 61 4.2.3 Needle diameter for the plotting of pancreatic islets 64 4.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 66 4.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 66 4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 74 4.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 80 4.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted NICC 80 4.4.2 Functionality of bioplotted NICC 87 5 Discussion 92 5.1 Cell-free Alg/MC 93 5.1.1 Gel viscosity and crosslinking of alginate 93 5.1.2 Release of MC 99 5.1.3 Permeability for glucose & insulin 106 5.2 Cell incorporation into Alg/MC 118 5.2.1 Incorporation of β-cells 118 5.2.2 Incorporation of pancreatic islets 119 5.3 Plotting of adult murine pancreatic islets 121 5.3.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 121 5.3.2 Functionality of bioplotted murine islets 124 5.4 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC) 127 5.4.1 Distribution, morphology and viability of bioplotted murine islets 127 5.4.2 Functionality of bioplotted NICC 130 Summary 134 Zusammenfassung 137 References 140 Addendum 172 A.1 Supplementary data for the results 172 Supplementary data for “4.1.1. Paste viscosity and scaffold stability” 172 Supplementary data for “4.1.2 Scaffold composition during incubation under cell culture conditions” 173 Supplementary data for “4.1.3 Permeability for glucose & insulin” 175 Supplementary data for “4.2.1 Sterilisation of MC: influence on β-cell survival and beha-viour” 178 Supplementary data for “4.3.2 Functionality of bioplotted murine islets” 182 Supplementary data for “4.4.2 Functionality of bioplotted NICC” 187 A.2 Supplementary data for the discussion 189 Supplementary data for “5.1.1. Gel viscosity and crosslinking of alginate” 189 Supplementary data for “5.1.2. MC release” 191 Supplementary data for “5.1.3 Permeability for glucose & insulin” 195 Supplementary data for “5.2.1 Incorporation of β-cells” 197 Supplementary data for “5.4.1 Plotting of neonatal porcine islet-like cell clusters (NICC)” 198 List of figures 196 List of tables 197 List of publications 198 Acknowledgements 20

Homogeneous and reproducible mixing of highly viscous biomaterial inks and cell suspensions to create bioinks

Highly viscous bioinks offer great advantages for the three-dimensional fabrication of cell-laden constructs by microextrusion printing. However, no standardised method of mixing a high viscosity biomaterial ink and a cell suspension has been established so far, leading to non-reproducible printing results. A novel method for the homogeneous and reproducible mixing of the two components using a mixing unit connecting two syringes is developed and investigated. Several static mixing units, based on established mixing designs, were adapted and their functionality was determined by analysing specific features of the resulting bioink. As a model system, we selected a highly viscous ink consisting of fresh frozen human blood plasma, alginate, and methylcellulose, and a cell suspension containing immortalized human mesenchymal stem cells. This bioink is crosslinked after fabrication. A pre-crosslinked gellan gum-based bioink providing a different extrusion behaviour was introduced to validate the conclusions drawn from the model system. For characterisation, bioink from different zones within the mixing device was analysed by measurement of its viscosity, shape fidelity after printing and visual homogeneity. When taking all three parameters into account, a comprehensive and reliable comparison of the mixing quality was possible. In comparison to the established method of manual mixing inside a beaker using a spatula, a significantly higher proportion of viable cells was detected directly after mixing and plotting for both bioinks when the mixing unit was used. A screw-like mixing unit, termed “HighVisc”, was found to result in a homogenous bioink after a low number of mixing cycles while achieving high cell viability rates

Chemical structure and biological activity of a highly branched (1 → 3,1 → 6)- _-d-glucan from Isochrysis galbanaIrina.

International audiencetA highly branched (1 → 3,1 → 6)- -d-glucan was isolated from the microalga Isochrysis galbana Parke(Isochrysidales, Haptophyta). The polysaccharide structure was analyzed by methylation and Smithdegradation, as well as by ESI and MALDI TOF mass spectrometry and NMR spectroscopy. The glucanwas shown to contain a (1 → 6)-linked backbone, where every residue is substituted at position 3 byGlc, which in turn may be substituted at C-6 by a single Glc or by rather short (up to tetrasaccharide)oligosaccharide chains. All the 3-linked Glc residues are present in these side chains. In the biologicalactivity experiments it was demonstrated that the polysaccharide directly inhibits the proliferation ofU937 human leukemic monocyte lymphoma cells and therefore has potential anti-tumor activity

Spectroscopic and Redox Studies of Valence-Delocalized [Fe₂S₂]⁺ Centers in Thioredoxin-like Ferredoxins

Reduced forms of the C56S and C60S variants of the thioredoxin-like <i>Clostridium pasteurianum</i> [Fe₂S₂] ferredoxin (<i>Cp</i>Fd) provide the only known examples of valence-delocalized [Fe₂S₂]⁺ clusters, which constitute a fundamental building block of all higher nuclearity Fe–S clusters. In this work, we have revisited earlier work on the <i>Cp</i>Fd variants and carried out redox and spectroscopic studies on the [Fe₂S₂]^2+,+ centers in wild-type and equivalent variants of the highly homologous and structurally characterized <i>Aquifex aeolicus</i> ferredoxin 4 (<i>Aae</i>Fd4) using EPR, UV–visible–NIR absorption, CD and variable-temperature MCD, and protein–film electrochemistry. The results indicate that the [Fe₂S₂]⁺ centers in the equivalent <i>Aae</i>Fd4 and <i>Cp</i>Fd variants reversibly interconvert between similar valence-localized <i>S</i> = 1/2 and valence-delocalized <i>S</i> = 9/2 forms as a function of pH, with p<i>K</i>_a values in the range 8.3–9.0, because of protonation of the coordinated serinate residue. However, freezing high-pH samples results in partial or full conversion from valence-delocalized <i>S</i> = 9/2 to valence-localized <i>S</i> = 1/2 [Fe₂S₂]⁺ clusters. MCD saturation magnetization data for valence-delocalized <i>S</i> = 9/2 [Fe₂S₂]⁺ centers facilitated determination of transition polarizations and thereby assignments of low-energy MCD bands associated with the Fe–Fe interaction. The assignments provide experimental assessment of the double exchange parameter, <i>B</i>, for valence-delocalized [Fe₂S₂]⁺ centers and demonstrate that variable-temperature MCD spectroscopy provides a means of detecting and investigating the properties of valence-delocalized <i>S</i> = 9/2 [Fe₂S₂]⁺ fragments in higher nuclearity Fe–S clusters. The origin of valence delocalization in thioredoxin-like ferredoxin Cys-to-Ser variants and Fe–S clusters in general is discussed in light of these results