Mécanismes et conséquences de l'internalisation du récepteur du "glucose-dependent insulinotropic polypeptide"

L'internalisation et le trafic intracellulaire sont des mécanismes cruciaux dans la régulation de la signalisation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dans lesquels les -arrestines jouent un rôle central. Des agonistes biaisés qui sont capables d'activer sélectivement les voies de signalisation dépendantes des protéines G ou dépendantes des -arrestines ont été récemment identifiés. D'autre part, le concept selon lequel la signalisation des RCPG serait limitée à la membrane cellulaire a été contesté sur la base des données qui démontrent que de nombreux RCPG induisent du signal aussi bien à partir d'endosomes qu'au niveau de la surface cellulaire. Le glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) est une hormone incrétine essentielle dans l'homéostasie glucidique postprandiale. Elle exerce ses fonctions en se liant à un récepteur couplé aux protéines G, le RGIP qui est impliquée dans divers processus physiologiques et physiopathologiques. À ce jour, l'internalisation et le trafic intracellulaire du RGIP ainsi que leurs mécanismes moléculaires sous-jacents n'ont pas été étudié en détail. Dans ce contexte, le but de notre travail était d'abord d'étudier ces mécanismes et ensuite de caractériser le profil d'internalisation du N-acétyl-GIP, un analogue du GIP connu pour être résistant à la dégradation par le DPP-IV. Enfin, nous avons étudié si, en plus de sa signalisation à la membrane cellulaire, le RGIP est capable d'induire une signalisation à partir d'endosomes. Dans cette étude, nous montrons d'abord que l'internalisation du RGIP est un processus impliquant la clathrine, le complexe AP-2 et la dynamine, mais pas la région C-terminale du récepteur, ni les -arrestines1/2. Nous avons également montré que le N-acétyl-GIP, qui présente une activité agoniste pleine sur la production d'AMPc et sur la sécrétion d'insuline dans les cellules MIN-6-B1, n'est pas capable de stimuler l'internalisation du RGIP. Cela suggère que le N-acétyl-GIP pourrait être un agoniste biaisé du RGIP induisant préférentiellement la voie d'activation de Gs comparativement à un adressage du récepteur vers des puits recouverts de clathrine. Nous avons également réussi à observer une persistance au cours du temps de la production d'AMPc induite par le GIP. Le signal persistant dépend de l'internalisation du RGIP et est irréversible après lavage du GIP de la membrane cellulaire. De plus, nous avons détecté d'une manière directe la forme active de Gs au niveau d'endosomes contenant le RGIP en utilisant des plasmides codant pour des Nanobodies fusionnés à la GFP. Enfin, en utilisant un biosenseur FRET d'AMPc dirigé à la surface des endosomes précoces, nous avons également pu détecter d'une manière directe la production d'AMPc spécifiquement à la surface des endosomes contenant le RGIP internalisé. À notre connaissance, cette dernière observation est la première de ce genre, prouvant le concept de signalisation à partir d'endosomes par une approche de détection directe. Les résultats de cette étude apportent des informations quant à la régulation pharmacologique de l'internalisation et de la signalisation du RGIP, ouvrant des perspectives prometteuses dans le domaine du GIP.Internalization and trafficking are crucial mechanisms regulating G-protein coupled receptors (GPCRs) signaling in which -arrestins play a central role. Biased agonists which selectively activate either G protein or -arrestin signaling pathway were identified. On the other hand, the concept of GPCR signaling being restricted to cell membrane has been contested on the basis of data demonstrating GPCR signaling from endosomes as well as from the cell surface. Glucose insulinotropic polypeptide (GIP) is an incretin hormone essential in post-prandial glucose homeostasis. It exerts its functions through binding to a G protein-coupled receptor, GIPR which is involved in various physiological and pathological processes. To date, GIPR internalization and trafficking and the underlying molecular mechanisms have not been investigated in detail. In this context, the aim of our work was to study these mechanisms and to characterize the internalization profile of N-Acetyl-GIP, a GIP analogue resistant to DPP-IV degradation. Finally, we investigated if GIPR signaling can occur from endosomes alongside its signaling at the cell membrane. In this study, we first report that GIPR internalization involves clatherin, AP-2 and dynamin but not C-terminal region of the GIPR nor -arrestin1/2. Moreover, N-Acetyl-GIP, which fully stimulated cAMP production and insulin secretion from MIN-6-B1 cells, did not stimulate internalization of the GIPR. This suggests that N-Acetyl-GIP could be a biased GIPR agonist preferentially inducing Gs activation pathway over directing the receptor to clathrin-coated pits. We have also succeeded to witness a sustainability in GIP-induced cAMP production. The sustained signal was dependent on GIPR internalization and unreversed by GIP removal from the cell membrane. Moreover, we directly detected the active form of Gas in early endosomes containing GIPR using a genetically encoded GFP tagged nanobody. Finally, using a FRET sensor of cAMP targeted to the surface of early endosomes, we also directly detected cAMP production specifically at the surface of endosomes containing internalized GIPR. The latter observation is the first of this kind, proving the endosomal signaling concept by a direct detection approach. This study brings new insights into the pharmacological regulation of GIPR internalization and signaling, opening promising perspectives in GIP field

The influence of the genetic background on the development of diabetes mellitus and associated renal lesions in GIPRdn-transgenic mice

Diabetic nephropathy is one of the most important sequelas of diabetes mellitus. The pathogenically relevent processes underlying this disease are only insufficiently understood, and existing mouse models fail to recreate the human disease in all its aspects. Therefore, much effort has been put into the development of novel mouse models of DN. Recently, the impact of the genetic background on the development of renal lesions has come into the focus of research. Transgenic mice expressing a dominant negative glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (GIPRdn-tg mice), controlled by the rat proinsulin 2 promotor, were chosen as a model of diabetes. To investigate strain dependent morphological differences and their possible influence on susceptibility to develop DN, GIPRdn-tg mice were investigated on a genetic background prone to albuminuria (FVB/N) and on a background noted for its relative resistance to the development of renal injury (C57BL/6J). Eight male GIPRdn-tg FVB/N, GIPRdn-tg C57BL/6J mice and their respective wildtype controls at the age of six months were analysed. Clinical parameters were investigated, and morphological kidney parameters were analysed quantitative stereologically, semiquantitatively and qualitatively. Clinically, GIPRdn-tg FVB/N mice developed severe hyperglycemia, polydypsia, polyuria and showed elevated systolic blood pressure levels compared to wild-type FVB/N mice. The GIPRdn-tg FVB/N mice displayed an increase in daily albumin excretion of approximately 12 times compared to wild-type FVB/N. Compared to C57BL/6J-wt mice, GIPRdn-tg C57BL/6J mice developed only mildly increased casual blood glucose concentrations and polyuria. Albuminuria or elevated blood pressure in GIPRdn-tg C57BL/6J mice compared to wild-type C57BL/6J were not observed. The results of the present study indicate that pronounced straindependent differences in the diabetic metabolic state exist between GIPRdn-tg FVB/N and GIPRdn-tg C57BL/6J mice. FVB/N-wt mice displayed a higher kidney volume, comparable nephron endowment, higher mean and total glomerular volume, higher mean podocyte volume and lower podocyte number compared to C57BL/6J-wt mice, showing that statistically significant differences in kidney morphology are present between the FVB/N and C57BL/6J strain. GIPRdn-tg mice on the FVB/N background showed pronounced glomerulosclerosis, renal hypertrophy and glomerular hypertrophy with mesangial expansion, dilated and distorted glomerular capillaries, podocyte hypertrophy, reduced podocyte numbers and GBM thickening compared to FVB/N-wt mice. GIPRdn-tg mice on the C57BL/6J background displayed an only slightly increased kidney and mean glomerular volume and mild podocyte hypertrophy compared to C57BL/6J-wt mice. Reduced podocyte numbers, dilation of glomerular capillaries or GBM thickening compared to C57BL/6J-wt mice were not observed. GIPRdn-tg FVB/N mice displayed a higher glomerulosclerosis index, higher mean and total glomerular volume, higher mean podocyte volume, lower podocyte number and higher glomerular basement thickness compared to GIPRdntg C57BL/6J mice. The differences already present in quantitative morphological kidney parameters between wild-type mice of the both strains are exacerbated by the presence of diabetes. The strain-dependent differences in clinical parameters like hyperglycemia, blood pressure and albuminuria may influence susceptibility to renal lesions, but strain-dependent variations in mean glomerular volume, podocyte volume and podocyte number also appear to play a role in both genetic backgrounds. The mild presentation of renal lesions in GIPRdn-tg C57BL/6J may be partially attributable to the lower casual blood glucose concentrations, but other models of diabetes have reported similar findings in diabetic C57BL/6J mice displaying higher blood glucose concentrations. This suggests that kidney morphology is also at least partially responsible for the low susceptibility to the development of renal lesions in the C57BL/6J strain. In summary, this study demonstrates the importance of choosing the right genetic background for murine models of DN, based on its susceptibility to develop severe renal lesions. In the light of the predisposing factors displayed by FVB/N mice and the correspondingly more severe renal lesions displayed by diabetic FVB/N mice, GIPRdn-tg FVB/N mice can be endorsed as a useful mouse model of DN. GIPRdn-tg C57BL/6J mice are less suitable as a model of DN due to the C57BL/6J genetic background’s apparent resistance to the development of DN, but may offer valuable insight into the mechanisms of resistance to diabetes and renal disease.Die diabetische Nephropathie stellt eine der bedeutendsten Folgeerkrankungen von Diabetes dar. Die der Erkrankung zugrunde liegenden pathogenen Prozesse sind bisher nur unzureichend bekannt und derzeitige Mausmodelle sind nicht in der Lage, die Erkrankung des Menschen vollständig darzustellen. Daher wird viel Aufwand in die Entwicklung neuer Mausmodelle für die diabetische Nephropathie investiert. In letzter Zeit rückte vor allem der Einfluss des genetischen Hintergrundes in den Fokus der Forschung. Transgene Mäuse, die einen dominant-negativen glukoseabhängigen insulinotropen Polypeptidrezeptor unter der Kontrolle des Ratten Proinsulin 2 Promotors exprimieren (GIPRdn-tg Mäuse) wurden als Diabetesmodell ausgewählt. Um Licht auf stammabhängige Unterschiede in der quantitativen Morphologie der Niere und deren möglichen Einfluss auf die Empfänglichkeit für die Entwicklung von diabetische Nephropathie zu werfen, wurden GIPRdn-tg Mäuse auf einem zu Albuminurie neigenden (FVB/N) und einem für Nierenläsionen eher unempfindlichen (C57BL/6J) genetischen Hintergrund untersucht. Die Analysen erfolgten an je acht sechs Monate alten GIPRdn-tg FVB/N-Mäusen, GIPRdn-tg C57BL/6J-Mäusen und den zugehörigen Wildtyp-Kontrolltieren und umfassten klinische und klinisch-chemische sowie qualitative, semiquantitative und quantitativ-morphologische Untersuchungen der Nieren. Klinisch zeigten GIPRdn-tg FVB/N-Mäuse hochgradige Hyperglykämie, Polydypsie, Polyurie, erhöhten Blutdruck, sowie eine gegenüber FVB/N-wt Mäusen um den Faktor zwölf erhöhte täglich ausgeschiedene Albuminmenge im Urin. GIPRdn-tg C57BL/6J-Mäuse zeigten nur geringfügig erhöhte Blutglukosespiegel und geringgradige Polyurie im Vergleich zu C57BL/6J-wt Mäusen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass zwischen GIPRdn-tg FVB/N- und C57BL/6J-Mäusen erhebliche stammabhängige Unterschiede in der diabetischen Stoffwechsellage bestehen. FVB/N-Mäuse wiesen im Vergleich zu C57BL/6J-Mäusen eine ähnliche Glomerulumanzahl, ein höheres Nieren-, Glomerulum- und Podozytenvolumen und eine niedrigere Podozytenzahl auf. Dies zeigt, das signifikante stammabhängige Unterschiede in der Nierenmorphologie zwischen FVB/N- und C57BL/6J-Mäusen bestehen. GIPRdn-tg FVB/N-Mäuse zeigten im Vergleich zu FVB/N-wt Mäusen Glomerulosklerose, renale, glomeruläre und podozytäre Hypertrophie, dilatierte glomeruläre Kapillaren, eine erniedrigte Podozytenzahl und einer Verdickung der glomerulären Basalmembran (GBM). Dagegen wiesen GIPRdn-tg C57BL/6J vs. C57BL/6-wt Mäuse nur wenig erhöhte Nieren-, Glomerulum- und Podozytenvolumina auf. Im Vergleich zu GIPRdn-tg C57BL/6J wiesen GIPRdn-tg FVB/N Mäuse einen höheren Glomeruloskleroseindex, ein höheres mittleres Glomerulum- und Podozytenvolumen, eine niedrigere Podozytenzahl und eine höhere GBM-Dicke auf. Die zwischen den Wildtyp-Mäusen beider Stämme bestehenden renalen morphologischen Unterschiede werden bei Vorhandensein von Diabetes noch ausgeprägter. Die stammabhängigen Unterschiede in Parametern wie Hyperglykämie, Blutdruck undAlbuminurie können möglicherweise die Empfänglichkeit gegenüber renalen Veränderungen beeinflussen, aber auch stammabhängige Differenzen im mittleren Glomerulum- und Podozytenvolumen und der Podozytenzahl scheinen eine Rolle in beiden genetischen Hintergründen zu spielen. Die geringfügige Ausprägung der renalen Alterationen in GIPRdn-tg C57BL/6J Mäusen mag teilweise in den niedrigeren Blutglukosekonzentrationen begründet sein. Andere Diabetesmodelle liefern jedoch trotz höherer Blutglukosekonzentrationen vergleichbare Ergebnisse für C57BL/6J-Mäuse. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Nierenmorphologie ebenfalls einen Einfluss auf die niedrigere Empfänglichkeit des C57BL/6J-Stammes für die Entwicklung von Nierenläsionen hat. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Auswahl eines für Nierenläsionen prädisponierten genetischen Hintergrundes für Mausmodelle diabetischer Nephropathie eine wichtige Rolle spielt. Angesichts der Faktoren, die FVB/N-Mäuse für diabetische Nephropathie zu prädisponieren scheinen und der entsprechend schwereren Nierenläsionen, können GIPRdn-tg FVB/N-Mäuse als Modell für DN empfohlen werden. Dagegen erscheinen GIPRdn-tg C57BL/6JMäuse auf Grund der relativen Unempfindlichkeit des genetischen Hintergrundes gegenüber Nierenläsionen als Modell für DN weniger geeignet, sie sind allerdings als Modell für die Untersuchung von Resistenzfaktoren gegenüber Diabetes oder Nephropathien von Interesse

Clinical and pathological characterization of a novel transgenic animal model of diabetes mellitus expressing a dominant negative glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (GIPR dn)

Clinical and pathological characterization of a novel transgenic animal model of diabetes mellitus expressing a dominant negative glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (GIPR dn) Gastrointestinal hormones like glucose-dependent insulinotropic polypeptide have recently been shown to be involved in the pathogenesis of diabetes mellitus in humans and animals models of diabetes mellitus. The aim of this study was to characterize a novel transgenic mouse model expressing a dominant negative glucosedependent insulinotropic polypeptide receptor (GIPRdn) under the control of the rat insulin gene promoter and their non-transgenic counterparts. Detailed analysis of clinical parameters was performed, including urine glucose, blood or serum glucose and serum insulin values. In addition, oral and subcutaneous glucose tolerance tests were performed, and HbA1c levels and various serum parameters were determined. The detection of the daily food and water intake and the daily urine volume was performed in two age groups. Further, body and organ weights were determined. Qualitative and quantitative morphological changes of the pancreas and the kidneys were investigated in several age groups. Some of the parameters were studied in different diet groups, one of them received standard rodent chow, and the other received a carbohydrate-restricted diet until four months of age. All transgenic mice studied exhibited severe glucosuria from 21 days of age onwards. From 30 days of age onwards, GIPRdn transgenic males and females showed severe hyperglycemia and hypoinsulinemia (p<0.05). In male transgenic animals, the fasted body weight was found to be lower than in age-matched male control mice. The daily food and water intake and the 24-hour urine volume were significantly higher in all transgenic animals investigated. Histological and immunohistochemical survey of the pancreas revealed a striking change of the islet cell composition and distribution. Further, quantitative- stereological analysis of the pancreas revealed a significant reduction of the total volumes of pancreatic islets, B-cells in the islets and isolated B-cells in the exocrine pancreas indicating neogenesis of islets. Kidney changes included renal and glomerular hypertrophy, glomerulosclerosis and tubulo-interstitial changes. In conclusion, transgenic mice expressing a dominant negative GIP receptor under the control of the rat insulin gene promoter develop a severe diabetic phenotype and striking 138 histological changes of the endocrine pancreas. Further, advanced diabetesassociated organ lesions, particularly of the kidney were observed and therefore, GIPRdn transgenic mice are considered a valuable model for studying long-term complications of diabetes mellitus.Klinische und pathomorphologische Befunde bei einem neuartigen transgenen diabetischen Tiermodell, das einen dominant negativen glucose-dependent insulinotropic polypeptide Rezeptor (GIPR dn) exprimiert. In den letzten Jahren wurde beim Studium der Pathogenese des Diabetes mellitus die Aufmerksamkeit zunehmend auf die Beteiligung gastrointestinaler Hormone wie zum Beispiel glucose-dependent insulinotropic polypeptide gerichtet. Ziel dieser Studie war es, bei einem neuartigen transgenen Tiermodell, klinische und pathomorphologische Veränderungen eingehend zu charakterisieren. Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um transgene Mäuse, die einen dominant negativen glucosedependent insulinotropic polypeptide Rezeptor (GIPRdn) unter der Kontrolle des Ratteninsulingenpromotors exprimieren und um nicht-transgene Geschwistertiere. Es erfolgte eine detaillierte Untersuchung Diabetes-relevanter klinischer Parameter, unter der Berücksichtigung von Harnglukoseausscheidung, Blut- bzw. Serumglukose- und Seruminsulinwerten. Zusätzlich wurden orale und subkutane Glukosetoleranztests durchgeführt und HbA1c -Werte sowie verschiedene Serumparameter bestimmt. Die tägliche Futter- und Wasseraufnahme und das tägliche Harnvolumen wurden bei zwei Altersgruppen gemessen. Körper- und Organgewichte wurden ebenfalls erfasst. Die Erfassung morphologischer und histopathologischer Veränderungen des Pankreas und der Nieren erfolgte sowohl qualitativ als auch quantitativ-stereologisch an mehreren Altersgruppen. Einige der untersuchten Parameter wurden an Tieren, die mit Haltungsfutter gefüttert wurden und an Vergleichstieren erhoben, die bis zum Alter von 4 Monaten mit einer kohlenhydratarmen Diät ernährt wurden. Alle untersuchten transgenen Tiere zeigten ab einem Alter von 21 Tagen eine schwere Glukosurie. Im Alter von 30 Tagen zeigten GIPRdn transgene männliche und weibliche Mäuse eine hochgradige Hyperglykämie und eine hochgradige Hypoinsulinämie. Bei männlich- transgenen Tieren war das Köpergewicht im Vergleich zu gleichgeschlechtlichen 139 Kontrolltieren reduziert (p<0.05). Die tägliche Futter- und Wasseraufnahme und das tägliche Harnvolumen war bei allen untersuchten transgenen Tieren signifikant höher als bei Kontrolltieren. Histologische und immunhistochemische Untersuchungen am Pankreas zeigten schwere Veränderungen der Zusammensetzung und Verteilung der Inselzellen auf. Diese qualitativen Befunde konnten durch quantitativstereologische Untersuchungen eingehend charakterisiert werden. Das Gesamtvolumen der Pankreasinseln und der B-Zellen in den Inseln war bei GIPRdn transgenen Mäusen signifikant niedriger als bei Kontrolltieren. Gleiches gilt für das Gesamtvolumen isolierter B-Zellen im exokrinen Pankreas, die als Indikator für Inselneogenese angesehen werden. Die festgestellten Nierenveränderungen umfassen renale und glomeruläre Hypertrophie, Glomerulosklerose und tubulointerstitielle Veränderungen. Die quantitativ-stereologische Auswertung konnte die subjektiven Befunde bestätigen, sowohl das Nierenvolumen als auch das mittlere Glomerulumvolumen waren bei transgenen Mäusen signifikant erhöht. Aus den erhobenen Befunden ergibt sich die Schlussfolgerung, dass transgene Mäuse, die einen dominant-negativen GIP Rezeptor unter der Kontrolle des Ratteninsulingenpromoters exprimieren eine hochgradigen diabetischen Phänotyp und prägnante histologische Veränderungen am endokrinen Pankreas entwickeln. Weiterhin konnten Diabetes-assoziierte Alterationen diverser Organe, insbesondere der Niere festgestellt werden, woraufhin GIPRdn transgene Mäuse als ein wertvolles Tiermodell für die Untersuchung diabetischer Spätkomplikationen angesehen werden

Dissecting the physiology and pathophysiology of glucagon-like peptide-1

Copyright © 2018 Paternoster and Falasca. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other forums is permitted, provided the original author(s) and the copyright owner(s) are credited and that the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with these terms. An aging world population exposed to a sedentary life style is currently plagued by chronic metabolic diseases, such as type-2 diabetes, that are spreading worldwide at an unprecedented rate. One of the most promising pharmacological approaches for the management of type 2 diabetes takes advantage of the peptide hormone glucagon-like peptide-1 (GLP-1) under the form of protease resistant mimetics, and DPP-IV inhibitors. Despite the improved quality of life, long-term treatments with these new classes of drugs are riddled with serious and life-threatening side-effects, with no overall cure of the disease. New evidence is shedding more light over the complex physiology of GLP-1 in health and metabolic diseases. Herein, we discuss the most recent advancements in the biology of gut receptors known to induce the secretion of GLP-1, to bridge the multiple gaps into our understanding of its physiology and pathology

Caractérisation de la région promotrice du gène codant pour le récepteur du peptide insulinotrope dépendant du glucose humain

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Rôles des anomalies de récepteurs hormonaux dans la physiopathologie des tumeurs surrénaliennes

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal