Novel strategies for singlet molecular oxygen O2(1Δg) generation and detection in cells

En aquesta tesi s'han utilitzat diferents estratègies per obtenir control en la producció i detecció de diferents espècies reactives d'oxigen (ROS), especialment per a l'oxigen singlet (1O2). En la primera part de la tesi, l'enfoc principal consisteix en entendre la generació de ROS i intentar potenciar-ne el seu efecte. En primer lloc, demostrem que la modificació de diferents fotosensibilitzadors afegint-hi un catió de trifenilfosfoni com a element diana produeix derivats amb una excel·lent activitat fotoantimicrobiana contra bacteris Gram-positius (S. aureus i E. faecalis). En segon lloc, descobrim una sèrie de nous aspectes de la reacció de “-phenyl quenching” per derivats de 9-fenilfenalenona. La fototoxicitat d’aquests derivats ja es troba esmentada en el llibre: “L'origen de les espècies” de C. Darwin. També es suggereix una via metabòlica mediada per la reacció BPQ en la biosíntesi dels pigments vegetals derivats de fluorones. A més, si el grup fenil és substituït per altres grups arils, s'observa diferencies en la reacció de BPQ. En tercer lloc, s’ha demostrat que diferents antraquinones d’origen natural indueixen fototoxicitat en biofilms de C. tropicalis a causa de la generació de O2•, tenint l’1O2 un rol menor. En quart lloc, es demostra el fàrmac antitumoral Doxorubicina produeix quantitats significants d’1O2, però es redueix la seva generació quan es complexa amb el ADN. En cinquè lloc, s’ha estudiat l’efecte d’adsorció o unió covalent d’un fotosensibilitzador a nanopartícules mesoporoses de sílice. A més a més, s’han derivatitzat per afegir-hi elements diana. Sisè i últim, s’ha estudiat les propietats fotoquímiques d’una nova diada que conté un bromo-bodipy com a fotosensibilitzador i trampa química de ROS (que desactiva la capacitat del bromo-bodipy de generar 1O2). Un cop oxidada la trampa química, la diada recupera la capacitat de generar 1O2 i causar dany cel·lular. S’observa diferents propietats foto-antitumorals d’aquesta diada en funció de l’estrès cel·lular o de la localització cel·lular. En la segona part de la tesi, s'ha centrat en la detecció de ROS. En primer lloc, s’han dissenyat, sintetitzat i caracteritzat nanosondes fluorescents per la detecció d'1O2 en sistemes biològics. La nanovehiculització elimina algunes de les limitacions de les diferents sondes fluorescents d’1O2. En aquest sentit, diverses sondes tals com SOSG, ADPA o furil-vinil-naftooxazol s’han unit covalentment a nanopartícules utilitzant diferents cadenes espaiadores per tal d’optimitzar la seva reactivitat front 1O2. A diferència de quan es troben lliures en solució, les nanosondes són fàcilment internalitzades per cèl·lules eucariotes i procariotes i es minimitza la interacció amb proteïnes (com per exemple, l’albúmina de sèrum boví). Les diferents nanosondes responen a l’1O2 generat intracel·lular. Com a prova de concepte, també s’ha desenvolupat una nanosonda fluorescent per la detecció no selectiva de ROS, basada en 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina. En segon lloc, s’ha caracteritzat la estructura i reactivitat de la sonda fluorescent: CellROX Deep Red. En tercer lloc, s’ha desenvolupat la primera sonda d’optoacústica per la detecció de ROS basada en l’oxidació de la tetrametilbenzidina. S’ha aconseguit detectar 1O2 produït per bacteris utilitzant tal sonda. Finalment i com a prova de concepte, s’ha dissenyat un “self-reporter” nanofotosensibilitzador. El nanosistema és capaç de produir i detectar 1O2 simultàniament. Aquest nanodispositiu s'ha utilitzat amb èxit per la fotoinactivació de S. aureus, observant-se una correlació entre el canvi de fluorescència de la sonda i la mort bacteriana.En esta tesis se han utilizado distintas estrategias para obtener el control en la producción y detección de diferentes especies reactivas de oxígeno (ROS), especialmente para el oxígeno singlete (1O2). En la primera parte de la tesis, el enfoque principal consiste en entender la generación de ROS e intentar potenciar su efecto. En primer lugar, demostramos que la modificación de distintos fotosensibilizadores, añadiendo un catión de trifenilfosfonio como elemento diana, produce derivados con una excelente actividad fotoantimicrobiana contra bacterias Gram-positivas (S. aureus y E. faecalis). En segundo lugar, descubrimos una serie de nuevos aspectos de la reacción de "-phenyl quenching" por derivados de 9-fenilfenalenona. La fototoxicidad de estos derivados ya se encuentra mencionada en el libro: "el origen de las especies" de C. Darwin. También se sugiere una vía metabólica mediada por la reacción BPQ en la biosíntesis de los pigmentos vegetales derivados de fluorenonas. Además, si el grupo fenilo es sustituido por otros grupos arilos, se observan diferencias en la reacción de BPQ. En tercer lugar, se ha demostrado que distintas antraquinonas de origen natural inducen fototoxicidad en biofilms de C. tropicalis debido a la generación de O2•, teniendo el 1O2 un rol menor. En cuarto lugar, se demuestra que el fármaco antitumoral Doxorubicina produce cantidades significantes de 1O2, pero se reduce su generación cuando se compleja con el ADN. En quinto lugar, se ha estudiado el efecto de adsorción o unión covalente de un fotosensibilizador a nanopartículas mesoporosas de sílice. Además, se han derivatizado para añadir elementos diana. Sexto y último, se han estudiado las propiedades fotoquímicas de una nueva diada que contiene un bromo-bodipy como fotosensibilizador y trampa química de ROS (que desactiva la capacidad del bromo-bodipy para generar 1O2). Una vez oxidada la trampa química, la diada recupera la capacidad para generar 1O2 y causar daño celular. Se observan diferentes propiedades foto-antitumorales de esta diada en función del estrés celular o de la localización celular. La segunda parte de la tesis, se ha centrado en la detección de ROS. En primer lugar, se han diseñado, sintetizado y caracterizado nanosondas fluorescentes para la detección de 1O2 en sistemas biológicos. La nanovehiculización elimina algunas de las limitaciones de las distintas sondas fluorescentes de 1O2. En este sentido, varias sondas tales como SOSG, ADPA o furilo-vinilo-naftooxazol se han unido covalentemente a nanopartículas utilizando distintas cadenas espaciadoras para optimizar su reactividad frente 1O2. A diferencia de cuando se encuentran libres en solución, las nanosondas son fácilmente internalizadas por células eucariotas y procariotas y se minimiza la interacción con proteínas (como por ejemplo con la albúmina de suero bovino). Las distintas nanosondas responden al 1O2 generado intracelular. Como prueba de concepto, también se ha desarrollado una nanosonda fluorescente para la detección no selectiva de ROS, basada en 2',7'-diclorodihidrofluoresceina. En segundo lugar, se ha caracterizado la estructura y reactividad de la sonda fluorescente: CellROX Deep Red. En tercer lugar, se ha desarrollado la primera sonda de optoacústica para la detección de ROS basada en la oxidación de la tetrametilbenzidina. Se ha logrado detectar 1O2 producido por bacterias emprando tal sonda. Finalmente, y como prueba de concepto, se ha diseñado un "self-reporter" nanofotosensibilitzador. El nanosistema es capaz de producir y detectar 1O2 simultáneamente. Este nanodispositivo ha sido utilizado con éxito para la fotoinactivación de S. aureus, observándose una correlación entre el cambio de fluorescencia de la sonda y la muerte bacteriana.In this thesis, different strategies have been used in order to gain control in reactive oxygen species (ROS) production and detection, especially for singlet oxygen (1O2). In the first part of the thesis, the main focus is towards understanding ROS generation and try to potentiate its effect. First, we demonstrate that modification of different photosensitisers with the triphenylphosphonium cation yields derivatives with an excellent photoantimicrobial activity against Gram‐positive bacteria (i.e., S. aureus and E. faecalis). Second, we uncover a number of new aspects of -phenyl quenching reaction in 9-phenylphenalenone scaffold, whose phototoxicity was already mentioned in Darwin’s Origin of Species. It is suggested an excited state-mediated metabolic pathway in the biosynthesis of fluorone plant pigments. Moreover, if phenyl moiety is substituted for other aryl groups, it is observed that the electrocyclic ring opening back to ground state ketones have lifetimes between miliseconds and picoseconds. Third, we demonstrate that the main photosensitizing mechanism, involved in the photo-induced C. tropicalis antibiofilm activity by natural anthraquinones, is via O2• production, whereas 1O2 participation seems of lesser importance. Fourth, we demonstrate that doxorubicin produces significant amounts of 1O2, however, this is largely suppressed when bound to DNA. Fifth, we studied the effect of PS adsorption or covalently bond onto the surface of mesoporous silica nanoparticles. Moreover, we further derivatitze them for attach targeting elements. Sixth and last, we studied the activation a new dyad comprising a bromo-bodipy, which acts as PS, plus a non-selective ROS chemical trap, which quenches the ability of bromo-bodipy to produce 1O2. For that aPS we observe a differential behaviour in function of the cellular stress or even in function of the organelle. In the second part of the thesis, focus has been shifted towards ROS detection. First, we designed, synthesized, and characterized biocompatible fluorescent nanoprobes for 1O2 detection in biological systems that circumvents many of the limitations of the different molecular 1O2 fluorescent probes. Under that purpose different 1O2 probes (Singlet Oxygen Sensor Green, anthracene dipropionic acid and furyl-vinyl-naphthoxazole) were covalently linked to nanoparticles core using different architectures to optimize their response to 1O2. In contrast to its molecular counterpart, the optimum nanoprobes are readily internalized by prokaryotic and eukaryotic cells and they do not interact with proteins (i.e. bovine serum albumin). Furthermore, the spectral characteristics do not change inside cells, and the probe responds to intracellular generated 1O2 with the corresponding change in fluorescence. As a proof of concept, a non-selective ROS fluorescent nanoprobe, based on diacetyl 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein, has been synthetized and successfully used for detecting intracellular ROS. Second, we have performed the chemical characterization of the CellROX Deep Red, a new commercial non-selective ROS fluorescent probe, ascertained its putative chemical structure and evaluated its reactivity towards different reactive oxygen/nitrogen species and light in solution. Third, we developed the first ROS optoacoustic probe based on the oxidation of tetramethylbenzidine and successfully used for detecting 1O2 produced by bacteria. Finally, as proof of concept we have designed a self-reporter nanophotosensitizer. The nanosystem is capable to produce and detect the 1O2 generated simultaneously. It has been successfully used for S. aureus photoinactivation in which a correlation was observed between fluorescent change of the probe and bacterial cellular death

Una visión moderna sobre la desactivación de cetonas aromáticas por beta-fenilos

La desactivación por beta fenilos (en inglés, Beta Phenylquenching o BPQ) es una reacción que se produce a partirdel estado triplete de cetonas aromáticas con un grupofenilo en posición beta. Esta revisión presenta las principalescaracterísticas que definen la reacción de BPQ. Sediscute el mecanismo de reacción y los efectos de los sustituyentes,disolventes y la restricción de la rotación de losgrupos fenilo

On the mechanism of Candida tropicalis biofilm reduction by the combined action of naturally-occurring anthraquinones and blue light

The photoprocesses involved in the photo-induced Candida tropicalis biofilm reduction by two natural anthraquinones (AQs), rubiadin (1) and rubiadin-1-methyl ether (2), were examined.Production of singlet oxygen (1O2) and of superoxide radical anion (O2·−) was studied. Although it was not possible to detect the triplet state absorption of any AQs in biofilms, observation of 1O2 phosphorescence incubated with deuterated Phosphate Buffer Solution, indicated that this species is actually formed in biofilms. 2 was accumulated in the biofilm to a greater extent than 1 and produced measurable amounts of O2·− after 3h incubation in biofilms.The effect of reactive oxygen species scavengers on the photo-induced biofilm reduction showed that Tiron (a specific O2 ·− scavenger) is most effective than sodium azide (a specific 1O2 quencher). This suggests that O2 ·− formed by electron transfer quenching of the AQs excited states, is the main photosensitizing mechanism involved in the photoinducedantibiofilm activity, whereas 1O2 participation seems of lesser importance.Fil: Marioni, Juliana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; ArgentinaFil: Bresolí Obach, Roger. Universitat Ramon Llull; EspañaFil: Agut, Montserrat. Universitat Ramon Llull; EspañaFil: Comini, Laura Raquel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacia; ArgentinaFil: Cabrera, Jose Luis. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacia; ArgentinaFil: Paraje, María Gabriela. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; ArgentinaFil: Nonell, Santi. Universitat Ramon Llull; EspañaFil: Núñez Montoya, Susana Carolina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas Físicas y Naturales. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentin

High photostability in non-conventional coumarins with far-red/NIR emission through azetidinyl substitution

Replacement of electron-donating N,N-dialkyl groups with three or four-membered cyclic amines (e.g., aziridine and azetidine, respectively) has been described as a promising approach to improve some of the drawbacks of conventional fluorophores, including low fluorescent quantum yields (F) in polar solvents. In this work we have explored the influence of azetidinyl substitution on non-conventional coumarin-based COUPY dyes. Two azetidine-containing scaffolds were first synthesized in four linear synthetic steps and easily transformed into far-red/NIR-emitting fluorophores through N-alkylation of the pyridine moiety. Azetidine introduction in COUPY dyes resulted in enlarged Stokes' shifts with respect the N,N-dialkylamino-containing parent dyes, but the F were not significantly modified in aqueous media, which is in contrast with previously reported observations in other fluorophores. However, azetidinyl substitution led to an unprecedented improvement in the photostability of COUPY dyes and high cell permeability was retained since the fluorophores accumulated selectively in mitochondria and nucleoli of HeLa cells. Overall, our results provide valuable insights for the design and optimization of novel fluorophores operating in the far-red/NIR region, since we have demonstrated that three important parameters (Stokes' shifts, F and photostability) cannot be always simultaneously addressed by simply replacing a N,N-dialkylamino group with azetidine, at least in non-conventional coumarin-based fluorophores

Selective Photokilling of Human Pancreatic Cancer Cells Using Cetuximab-Targeted Mesoporous Silica Nanoparticles for Delivery of Zinc Phthalocyanine

Background: Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and innovative cancer therapy based on the photodynamic effect. In this study, we sought to determine the singlet oxygen production, intracellular uptake, and in vitro photodynamic therapy potential of Cetixumab-targeted, zinc(II) 2,3,9,10,16,17,23,24-octa(tert-butylphenoxy))phthalocyaninato(2-)-N29,N30,N31,N32 (ZnPcOBP)- loaded mesoporous silica nanoparticles against pancreatic cancer cells. Results: The quantum yield (Φ∆) value of ZnPcOBP was found to be 0.60 in toluene. In vitro cellular studies were performed to determine the dark- and phototoxicity of samples with various concentrations of ZnPcOBP by using pancreatic cells (AsPC-1, PANC-1 and MIA PaCa-2) and 20, 30, and 40 J/cm2 light fluences. No dark toxicity was observed for any sample in any cell line. ZnPcOBP alone showed a modest photodynamic activity. However, when incorporated in silica nanoparticles, it showed a relatively high phototoxic effect, which was further enhanced by Cetuximab, a monoclonal antibody that targets the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). The cell-line dependent photokilling observed correlates well with EGFR expression levels in these cells. Conclusions: Imidazole-capped Cetuximab-targeted mesoporous silica nanoparticles are excellent vehicles for the selective delivery of ZnPcOBP to pancreatic cancer cells expressing the EGFR receptor. The novel nanosystem appears to be a suitable agent for photodynamic therapy of pancreatic tumor

NanoSOSG: A Nanostructured Fluorescent Probe for the Detection of Intracellular Singlet Oxygen

A biocompatible fluorescent nanoprobe for singlet oxygen (1O2) detection in biological systems was designed, synthesized, and characterized, that circumvents many of the limitations of the molecular probe Singlet Oxygen Sensor Green® (SOSG). This widely used commercial singlet oxygen probe was covalently linked to a polyacrylamide nanoparticle core using different architectures to optimize the response to 1O2. In contrast to its molecular counterpart, the optimum SOSG-based nanoprobe, which we call NanoSOSG, is readily internalized by E. coli cells and does not interact with bovine serum albumin. Furthermore, the spectral characteristics do not change inside cells, and the probe responds to intracellularly generated 1O2 with an increase in fluorescence

Redesigning the coumarin scaffold into small bright fluorophores with far-red to NIR emission and large Stokes' shifts useful for cell imaging

Among the palette of previously described fluorescent organic molecules, coumarins are ideal candidates for developing cellular and molecular imaging tools due to their high cell permeability and minimal perturbation of living systems. However, blue-to-cyan fluorescence emission is usually difficultin in vivo applications due to the inherent toxicity and poor tissue penetration of short visible light wavelengths. Here, we introduce a new family of coumarin-based fluorophores, nicknamed COUPY, with promising photophysical properties, including emission in the far-red/near-infrared (NIR) region, large Stokes shifts, high photostability, and excellent brightness. COUPY fluorophores were efficiently synthesized in only three linear synthetic steps from commercially available precursors, with the N-alkylation of a pyridine moiety being the key step at the end of the synthetic route, as it allows for the tuning of the photophysical properties of the resulting dye. Owing to their low molecular weights, COUPY dyes show excellent cell permeability and accumulate selectively in nucleoli and/or mitochondria of HeLa cells, as their far-red/NIR fluorescence emission is easily detected at a concentration as low as 0.5 μ M after an incubation of only 20 min. We anticipate that these coumarin scaffolds will open a way to the development of novel coumarin-based far-red to NIR emitting fluorophores with potential applications for organelle imaging and biomolecule labeling

NanoDCFH-DA: a silica based nanostructured fluorogenic probe for the detection of reactive oxygene species

A biocompatible fluorescent nanoprobe for the detection of reactive oxygen species in biological systems has been designed, synthesized and characterized, circumventing some of the limitations of the molecular probe diacetyl 2',7'-dihidrochlorodihydrofluorescein (DCFH-DA). It has been synthesized the nanoparticulate forme of DCFH-DA by convalently attaching the widely used fluorescent probe DCFH-DA to a mesoporous silica nanoparticle though a linker, The reactivity of nanoDCFH-DA has been tested toward several reactive oxygen species. In addition, it has been proven to slow down DCFH-DA reaction with molecular oxygen and it hampers from interactions with proteins. As a final piece of evidence, in vitro studies showed that the nanoprobe is internalized HeLa cancer cells, thus being capable of detecting intracellularly generated reactive oxygen species. To sum up, it can be stated that nanoDCFH-DA overcomes two major problems of free DCFH-DA, namely oxidation of the probe by air and interaction with proteins in biological systems. This 'nano' approach has thus proven useful to extend the utility of an existing and valuable fluorescent probe to complex biological systems

Optical control of pain in vivo with a photoactive mGlu5 receptor negative allosteric modulator

Light-operated drugs constitute a major target in drug discovery, since they may provide spatiotemporal resolution for the treatment of complex diseases (i.e. chronic pain). JF-NP-26 is an inactive photocaged derivative of the metabotropic glutamate type 5 (mGlu5) receptor negative allosteric modulator raseglurant. Violet light illumination of JF-NP-26 induces a photochemical reaction prompting the active-drug's release, which effectively controls mGlu5 receptor activity both in ectopic expressing systems and in striatal primary neurons. Systemic administration in mice followed by local light-emitting diode (LED)-based illumination, either of the thalamus or the peripheral tissues, induced JF-NP-26-mediated light-dependent analgesia both in neuropathic and in acute/tonic inflammatory pain models. These data offer the first example of optical control of analgesia in vivo using a photocaged mGlu5 receptor negative allosteric modulator. This approach shows potential for precisely targeting, in time and space, endogenous receptors, which may allow a better management of difficult-to-treat disorders

Novel strategies for singlet molecular oxygen O2(1Δg) generation and detection in cells

En aquesta tesi s'han utilitzat diferents estratègies per obtenir control en la producció i detecció de diferents espècies reactives d'oxigen (ROS), especialment per a l'oxigen singlet (1O2). En la primera part de la tesi, l'enfoc principal consisteix en entendre la generació de ROS i intentar potenciar-ne el seu efecte. En primer lloc, demostrem que la modificació de diferents fotosensibilitzadors afegint-hi un catió de trifenilfosfoni com a element diana produeix derivats amb una excel·lent activitat fotoantimicrobiana contra bacteris Gram-positius (S. aureus i E. faecalis). En segon lloc, descobrim una sèrie de nous aspectes de la reacció de “-phenyl quenching” per derivats de 9-fenilfenalenona. La fototoxicitat d’aquests derivats ja es troba esmentada en el llibre: “L'origen de les espècies” de C. Darwin. També es suggereix una via metabòlica mediada per la reacció BPQ en la biosíntesi dels pigments vegetals derivats de fluorones. A més, si el grup fenil és substituït per altres grups arils, s'observa diferencies en la reacció de BPQ. En tercer lloc, s’ha demostrat que diferents antraquinones d’origen natural indueixen fototoxicitat en biofilms de C. tropicalis a causa de la generació de O2•, tenint l’1O2 un rol menor. En quart lloc, es demostra el fàrmac antitumoral Doxorubicina produeix quantitats significants d’1O2, però es redueix la seva generació quan es complexa amb el ADN. En cinquè lloc, s’ha estudiat l’efecte d’adsorció o unió covalent d’un fotosensibilitzador a nanopartícules mesoporoses de sílice. A més a més, s’han derivatitzat per afegir-hi elements diana. Sisè i últim, s’ha estudiat les propietats fotoquímiques d’una nova diada que conté un bromo-bodipy com a fotosensibilitzador i trampa química de ROS (que desactiva la capacitat del bromo-bodipy de generar 1O2). Un cop oxidada la trampa química, la diada recupera la capacitat de generar 1O2 i causar dany cel·lular. S’observa diferents propietats foto-antitumorals d’aquesta diada en funció de l’estrès cel·lular o de la localització cel·lular. En la segona part de la tesi, s'ha centrat en la detecció de ROS. En primer lloc, s’han dissenyat, sintetitzat i caracteritzat nanosondes fluorescents per la detecció d'1O2 en sistemes biològics. La nanovehiculització elimina algunes de les limitacions de les diferents sondes fluorescents d’1O2. En aquest sentit, diverses sondes tals com SOSG, ADPA o furil-vinil-naftooxazol s’han unit covalentment a nanopartícules utilitzant diferents cadenes espaiadores per tal d’optimitzar la seva reactivitat front 1O2. A diferència de quan es troben lliures en solució, les nanosondes són fàcilment internalitzades per cèl·lules eucariotes i procariotes i es minimitza la interacció amb proteïnes (com per exemple, l’albúmina de sèrum boví). Les diferents nanosondes responen a l’1O2 generat intracel·lular. Com a prova de concepte, també s’ha desenvolupat una nanosonda fluorescent per la detecció no selectiva de ROS, basada en 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina. En segon lloc, s’ha caracteritzat la estructura i reactivitat de la sonda fluorescent: CellROX Deep Red. En tercer lloc, s’ha desenvolupat la primera sonda d’optoacústica per la detecció de ROS basada en l’oxidació de la tetrametilbenzidina. S’ha aconseguit detectar 1O2 produït per bacteris utilitzant tal sonda. Finalment i com a prova de concepte, s’ha dissenyat un “self-reporter” nanofotosensibilitzador. El nanosistema és capaç de produir i detectar 1O2 simultàniament. Aquest nanodispositiu s'ha utilitzat amb èxit per la fotoinactivació de S. aureus, observant-se una correlació entre el canvi de fluorescència de la sonda i la mort bacteriana.En esta tesis se han utilizado distintas estrategias para obtener el control en la producción y detección de diferentes especies reactivas de oxígeno (ROS), especialmente para el oxígeno singlete (1O2). En la primera parte de la tesis, el enfoque principal consiste en entender la generación de ROS e intentar potenciar su efecto. En primer lugar, demostramos que la modificación de distintos fotosensibilizadores, añadiendo un catión de trifenilfosfonio como elemento diana, produce derivados con una excelente actividad fotoantimicrobiana contra bacterias Gram-positivas (S. aureus y E. faecalis). En segundo lugar, descubrimos una serie de nuevos aspectos de la reacción de "-phenyl quenching" por derivados de 9-fenilfenalenona. La fototoxicidad de estos derivados ya se encuentra mencionada en el libro: "el origen de las especies" de C. Darwin. También se sugiere una vía metabólica mediada por la reacción BPQ en la biosíntesis de los pigmentos vegetales derivados de fluorenonas. Además, si el grupo fenilo es sustituido por otros grupos arilos, se observan diferencias en la reacción de BPQ. En tercer lugar, se ha demostrado que distintas antraquinonas de origen natural inducen fototoxicidad en biofilms de C. tropicalis debido a la generación de O2•, teniendo el 1O2 un rol menor. En cuarto lugar, se demuestra que el fármaco antitumoral Doxorubicina produce cantidades significantes de 1O2, pero se reduce su generación cuando se compleja con el ADN. En quinto lugar, se ha estudiado el efecto de adsorción o unión covalente de un fotosensibilizador a nanopartículas mesoporosas de sílice. Además, se han derivatizado para añadir elementos diana. Sexto y último, se han estudiado las propiedades fotoquímicas de una nueva diada que contiene un bromo-bodipy como fotosensibilizador y trampa química de ROS (que desactiva la capacidad del bromo-bodipy para generar 1O2). Una vez oxidada la trampa química, la diada recupera la capacidad para generar 1O2 y causar daño celular. Se observan diferentes propiedades foto-antitumorales de esta diada en función del estrés celular o de la localización celular. La segunda parte de la tesis, se ha centrado en la detección de ROS. En primer lugar, se han diseñado, sintetizado y caracterizado nanosondas fluorescentes para la detección de 1O2 en sistemas biológicos. La nanovehiculización elimina algunas de las limitaciones de las distintas sondas fluorescentes de 1O2. En este sentido, varias sondas tales como SOSG, ADPA o furilo-vinilo-naftooxazol se han unido covalentemente a nanopartículas utilizando distintas cadenas espaciadoras para optimizar su reactividad frente 1O2. A diferencia de cuando se encuentran libres en solución, las nanosondas son fácilmente internalizadas por células eucariotas y procariotas y se minimiza la interacción con proteínas (como por ejemplo con la albúmina de suero bovino). Las distintas nanosondas responden al 1O2 generado intracelular. Como prueba de concepto, también se ha desarrollado una nanosonda fluorescente para la detección no selectiva de ROS, basada en 2',7'-diclorodihidrofluoresceina. En segundo lugar, se ha caracterizado la estructura y reactividad de la sonda fluorescente: CellROX Deep Red. En tercer lugar, se ha desarrollado la primera sonda de optoacústica para la detección de ROS basada en la oxidación de la tetrametilbenzidina. Se ha logrado detectar 1O2 producido por bacterias emprando tal sonda. Finalmente, y como prueba de concepto, se ha diseñado un "self-reporter" nanofotosensibilitzador. El nanosistema es capaz de producir y detectar 1O2 simultáneamente. Este nanodispositivo ha sido utilizado con éxito para la fotoinactivación de S. aureus, observándose una correlación entre el cambio de fluorescencia de la sonda y la muerte bacteriana.In this thesis, different strategies have been used in order to gain control in reactive oxygen species (ROS) production and detection, especially for singlet oxygen (1O2). In the first part of the thesis, the main focus is towards understanding ROS generation and try to potentiate its effect. First, we demonstrate that modification of different photosensitisers with the triphenylphosphonium cation yields derivatives with an excellent photoantimicrobial activity against Gram‐positive bacteria (i.e., S. aureus and E. faecalis). Second, we uncover a number of new aspects of -phenyl quenching reaction in 9-phenylphenalenone scaffold, whose phototoxicity was already mentioned in Darwin’s Origin of Species. It is suggested an excited state-mediated metabolic pathway in the biosynthesis of fluorone plant pigments. Moreover, if phenyl moiety is substituted for other aryl groups, it is observed that the electrocyclic ring opening back to ground state ketones have lifetimes between miliseconds and picoseconds. Third, we demonstrate that the main photosensitizing mechanism, involved in the photo-induced C. tropicalis antibiofilm activity by natural anthraquinones, is via O2• production, whereas 1O2 participation seems of lesser importance. Fourth, we demonstrate that doxorubicin produces significant amounts of 1O2, however, this is largely suppressed when bound to DNA. Fifth, we studied the effect of PS adsorption or covalently bond onto the surface of mesoporous silica nanoparticles. Moreover, we further derivatitze them for attach targeting elements. Sixth and last, we studied the activation a new dyad comprising a bromo-bodipy, which acts as PS, plus a non-selective ROS chemical trap, which quenches the ability of bromo-bodipy to produce 1O2. For that aPS we observe a differential behaviour in function of the cellular stress or even in function of the organelle. In the second part of the thesis, focus has been shifted towards ROS detection. First, we designed, synthesized, and characterized biocompatible fluorescent nanoprobes for 1O2 detection in biological systems that circumvents many of the limitations of the different molecular 1O2 fluorescent probes. Under that purpose different 1O2 probes (Singlet Oxygen Sensor Green, anthracene dipropionic acid and furyl-vinyl-naphthoxazole) were covalently linked to nanoparticles core using different architectures to optimize their response to 1O2. In contrast to its molecular counterpart, the optimum nanoprobes are readily internalized by prokaryotic and eukaryotic cells and they do not interact with proteins (i.e. bovine serum albumin). Furthermore, the spectral characteristics do not change inside cells, and the probe responds to intracellular generated 1O2 with the corresponding change in fluorescence. As a proof of concept, a non-selective ROS fluorescent nanoprobe, based on diacetyl 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein, has been synthetized and successfully used for detecting intracellular ROS. Second, we have performed the chemical characterization of the CellROX Deep Red, a new commercial non-selective ROS fluorescent probe, ascertained its putative chemical structure and evaluated its reactivity towards different reactive oxygen/nitrogen species and light in solution. Third, we developed the first ROS optoacoustic probe based on the oxidation of tetramethylbenzidine and successfully used for detecting 1O2 produced by bacteria. Finally, as proof of concept we have designed a self-reporter nanophotosensitizer. The nanosystem is capable to produce and detect the 1O2 generated simultaneously. It has been successfully used for S. aureus photoinactivation in which a correlation was observed between fluorescent change of the probe and bacterial cellular death