Proteomics in food: Quality, safety, microbes, and allergens

Food safety and quality and their associated risks pose a major concern worldwide regarding not only the relative economical losses but also the potential danger to consumer's health. Customer's confidence in the integrity of the food supply could be hampered by inappropriate food safety measures. A lack of measures and reliable assays to evaluate and maintain a good control of food characteristics may affect the food industry economy and shatter consumer confidence. It is imperative to create and to establish fast and reliable analytical methods that allow a good and rapid analysis of food products during the whole food chain. Proteomics can represent a powerful tool to address this issue, due to its proven excellent quantitative and qualitative drawbacks in protein analysis. This review illustrates the applications of proteomics in the past few years in food science focusing on food of animal origin with some brief hints on other types. Aim of this review is to highlight the importance of this science as a valuable tool to assess food quality and safety. Emphasis is also posed in food processing, allergies, and possible contaminants like bacteria, fungi, and other pathogens

Mass spectrometric analysis of protein modifications in heated milk

Milch und Milchprodukte nehmen in der Ernährung des Menschen eine zentrale Rolle ein und bieten ihm nicht nur im Säuglingsalter eine ideale Quelle aller Nährstoffe für ein gesundes Wachstum. Einen besonders wertvollen Inhaltsstoff stellen dabei die Milchproteine dar, die aufgrund ihrer guten Verdaubarkeit sowie ihrer günstigen Aminosäurezusammensetzung eine sehr hohe biologische Wertigkeit aufweisen. Im Zuge der industriellen Verarbeitung werden jedoch Milchprodukte in der Regel zum Erreichen einer mikrobiellen Stabilität oder aus technologischen Gründen erhitzt. Währenddessen kommt es zu einer Vielzahl chemischer Reaktionen, die die ernährungsphysiologischen Eigenschaften der Milchproteine bedeutend verändern können. In der sogenannten Maillard-Reaktion, die auch als nicht-enzymatische Glykierung bezeichnet wird, reagiert die Aminogruppe eines proteingebundenen Lysins mit der Carbonylfunktion des Milchzuckers Lactose zum Amadoriprodukt, welches im Folgenden zu einem sehr heterogenen Produktspektrum abgebaut wird. Zudem unterliegen Milchproteine diversen Oxidationsreaktionen, die den Abbau essentieller Aminosäuren nach sich ziehen. Parallel dazu führen Quervernetzungen der Proteine zu einem erschwerten enzymatischen Angriff während der Verdauung, so dass als Folge der Hitzebehandlung die biologische Wertigkeit der Milchproteine drastisch reduziert werden kann. Eine sorgfältige Kontrolle der industriellen Behandlung und die Aufklärung der dabei ablaufenden Reaktionen sind daher von großer Bedeutung. In den letzten Jahren hat sich die Massenspektrometrie als wertvolle Technik erwiesen, das Milchproteom eingehender zu erforschen und Strukturveränderungen der Milchproteine während der thermischen Behandlung zu charakterisieren. Als besonders schonende Ionisierungsmethode findet dabei die Matrix\-unterstützte Laserdesorptions-/Ionisierungs-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) Anwendung. Im Zuge dieser Dissertation wurde MALDI-TOF-MS zur systematischen Untersuchung von Proteinmodifikationen während der Erhitzung von Milch und Milchprodukten eingesetzt. Zunächst wurden Modifikationen analysiert, die beim Erhitzen von Molkenproteinen in Milchmodellen entstehen, wobei eine partielle enzymatische Hydrolyse die Identifizierung der Modifikationsstellen in der Aminosäuresequenz erlaubte. Anschließend wurden verschiedene Techniken zur Proteinabtrennung getestet, um die Proteinveränderungen von thermisch behandelten Milchprodukten analysieren zu können. Die detektierten Modifikationen in verschiedenen Handelsproben wurden relativ quantifiziert. Weiterhin wurde mittels MALDI-TOF-MS die bislang nicht komplett aufgeklärte niedermolekulare Proteinfraktion der Milch näher charakterisiert. Im letzten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde ein massenspektrometrischer Ansatz zur Beurteilung der thermischen Behandlung von Milch mit verschiedenen klassischen Methoden verglichen. Im ersten Projekt wurden die beiden wichtigsten Molkenproteine α-Lactalbumin bzw. β-Lactoglobulin mit Lactose in den Konzentrationen, die in der Milch vorliegen, in einem Puffer, der die Salzkonzentrationen der Milch nachahmte, erhitzt und Strukturveränderungen mittels MALDI-TOF-MS untersucht. Der nicht behandelte Standard sowie das ohne Lactose inkubierte Protein dienten als Kontrolle. Aufgrund ihrer spezifischen Massenänderung im Vergleich zum unmodifizierten Protein konnten die Modifizierungen, die im Laufe der Erhitzung entstanden, identifiziert werden. Im intakten Protein wurden Addukte von α-Lactalbumin und β-Lactoglobulin mit null bis vier Lactosemolekülen beobachtet. Für eine bessere Auflösung und einen genaueren Einblick in die Struktur und die Position der Modifikationen in der Proteinsequenz wurde eine partielle enzymatische Hydrolyse mit der Endoproteinase AspN durchgeführt. Dabei konnten im inkubierten α-Lactalbumin Lactulosyllysin sowie dessen Abbauprodukt Nε-Carboxymethyllysin (CML) an Lysin 5 detektiert werden. Eine weitere Glykierung am N-Terminus konnte dabei nicht ausgeschlossen werden. Zudem wurde die Oxidation von Lysin 5 zum Lysinaldehyd beobachtet. Massenveränderungen von je 16 Da ließen auf die Bildung von Cysteinsulfensäure an Cystein 28, 111 und 120 oder von Hydroxytryptophan an Tryptophan 26, 104 und 118 schließen. Die zusätzliche Inkubation von α-Lactalbumin mit Wasserstoffperoxid zeigte die Oxidation von Methionin 90 zu Methioninsulfoxid auf, was vermuten lässt, dass eine entsprechende Reaktion auch während der Erhitzung mit Lactose auftrat. Als zuckerunabhängige Reaktion cyclisierte die N-terminale Glutaminsäure zu einem Pyrrolidon. In β-Lactoglobulin führte die Inkubation mit Lactose zum Amadoriprodukt an Lysin 47 und entweder an Lysin 138 oder 141, das bei anhaltender Erhitzung teilweise zu CML abgebaut wurde. Lysin 8 wurde selektiv zu Lysinaldehyd oxidiert. Des Weiteren wurde an Methionin 7, 24 und 145 die Oxidation zum Sulfoxid beobachtet. Die Oxidation von β-Lactoglobulin mittels Wasserstoffperoxid führte zusätzlich zur Bildung von Methioninsulfoxid an Methionin 107. Diese Aminosäure wurde im Spektrum des mit Lactose inkubierten β-Lactoglobulins nicht abgedeckt, es ist jedoch zu vermuten, dass auch während der Reaktion mit Lactose Methionin 107 oxidiert wurde. Außerdem bewirkte die thermische Behandlung entweder die Oxidation von Methionin 24 zu Methioninsulfon oder von Tryptophan 19 zu N-Formylkynurenin oder zu Hydroxytryptophan. Im Folgenden wurden verschiedene Milchprodukte aus dem Handel auf ihre Modifikationen der Molkenproteine untersucht. Mit der direkten Vermessung mittels MALDI-TOF-MS gelang die Detektion von einem bis zu drei Lactose- bzw. Hexoseaddukten. Durch eine metallaffinitätschromatographische Aufreinigung vor der massenspektrometrischen Vermessung wurde eine Zunahme der Signalintensität sowie ein teilweise deutlich verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis erzielt, was eine empfindlichere Detektion der Modifikationen erlaubte. Da vor einer partiellen enzymatischen Hydrolyse eine Isolierung der Proteine erforderlich ist, wurden drei verschiedene Methoden zur Proteinauftrennung getestet. Mittels Immunoaffinitätschromatographie konnten α-Lactalbumin und β-Lactoglobulin von den restlichen Milchproteinen abgetrennt werden. Auch glykiertes α-Lactalbumin wurde dabei erfasst. Vorversuche zeigten, dass es außerdem möglich ist, im Anschluss an die Proteinisolierung einen Verdau mit der Endoproteinase AspN durchzuführen. Die eindimensionale Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) von Milch resultierte ebenfalls in einer sehr guten Trennung der meisten Milchproteine. Mit einer zusätzlichen isoelektrischen Fokussierung ließen sich außerdem genetische Varianten und Proteine mit unterschiedlichem Phosphorylierungsgrad trennen. Die Analyse von mit Lactose inkubierten Modellproteinen machte außerdem deutlich, dass mit Hilfe der zweidimensionalen SDS-PAGE modifizierte Proteine angereichert werden können. Die folgenden Versuche mit verschiedenen Handelsproben wurden mittels eindimensionaler SDS-PAGE mit anschließender partieller enzymatischer Hydrolyse unter Verwendung der Endoproteinase AspN durchgeführt, wobei sich die Analyse auf die Modifikationen von β-Lactoglobulin beschränkte. Zunächst wurde anhand der bereits untersuchten Modellproteine eine leichte Verminderung der Spektrenqualität nach dem Verdau im Gel festgestellt. Bei der Analyse von erhitzter Rohmilch konnte das Amadoriprodukt an Lysin 47 und 138 oder 141 sowie Methioninsulfoxid an Methionin 7, 24 und 145 detektiert werden. In den Handelsproben wurden exakt die gleichen Glykierungsstellen im Protein ermittelt. Eine relative Quantifizierung des Lactulosyllysins erlaubte eine quantitative Abschätzung der hitzeinduzierten Schädigung. Dabei erwiesen sich eine Kondensmilch und eine pulverförmige Säuglingsnahrung als die am stärksten belasteten Proben. Eine Beurteilung der Proteinoxidation stellte sich als schwierig heraus, da die Aufarbeitung zu einer vermehrten Bildung von Methioninsulfoxid führte. Tendenziell war ein erhöhter Gehalt an Methioninsulfoxid in den Handelsproben zu verzeichnen, jedoch waren die Unterschiede zu Rohmilch nicht signifikant. Um die bislang wenig erforschte niedermolekulare Proteinfraktion der Milch näher zu charakterisieren, wurde im nächsten Abschnitt dieser Arbeit eine metallaffinitätschromatographische Aufreinigung der Milch mit anschließender massenspektrometrischer Vermessung durchgeführt. Damit konnten für den Massenbereich von ca. 1000 - 6000 Da Spektren mit übersichtlich angeordneten Signalen und einem sehr guten Signal-Rausch-Verhältnis generiert werden. Zwei der Peptide konnten mittels MALDI-TOF/TOF-MS Fragmenten des αs1-Caseins zugeordnet werden. Beim Erhitzen von Rohmilch bei 72 °C, 85 °C bzw. 120 °C wurden fünf neue Peptide mit den Massen 1974,4, 2218,7, 3730,1, 4297,8 bzw. 4436,8 Da detektiert, die relativ quantifiziert wurden. Die Bildung war deutlich abhängig von der Erhitzungsdauer bzw. -temperatur. Im nächsten Schritt wurde das Peptidprofil von handelsüblichen Milchproben während der Lagerung analysiert. Dabei konnten in hocherhitzter, bei Kühlschranktemperaturen gelagerter Milch keine Veränderungen detektiert werden, während die Lagerung von ultrahocherhitzter Milch bei Raumtemperatur zu einem signifikanten Anstieg des Peptids mit der Masse von 4340,4 Da führte, einem Fragment von αs1-Casein. In gelagerter Sterilmilch, bei der aufgrund der drastischen Bedingungen bei der Herstellung von keiner Enzymaktivität ausgegangen wird, wurde keine entsprechende Zunahme des Peptids nachgewiesen. Daraus kann gefolgert werden, dass dieses enzymatisch gebildet wurde. Die Analyse verschiedener Milchtypen aus dem Handel zeigte die Relevanz der Erhitzungsversuche für reale Proben auf: Während in keiner der pasteurisierten Proben die hitzeinduzierten Peptide detektierbar waren, konnten sie in unterschiedlicher Intensität in einer hocherhitzten und in allen ultrahocherhitzten Milchproben nachgewiesen werden. Zudem zeigten die Spektren weitere Unterschiede in der Signalintensität einiger Peptide auf, was vermutlich auf unterschiedliche Rinderrassen oder Laktationsstadien zurückzuführen war. Die vorgestellte Methode erlaubt somit einen umfassenden Einblick in die niedermolekulare Proteinfraktion der Milch, was in der Milchindustrie zur Kontrolle der Hitzebehandlung oder technologischer Eigenschaften genutzt werden könnte. Im abschließenden Abschnitt dieser Arbeit wurde eine neue massenspektrometrische Methode zur Beurteilung der thermischen Behandlung von Milch mit klassischen Hitzeindikatoren verglichen. Als etablierte Analysemethoden dienten die kolorimetrische Bestimmung des Gehalts an bei pH 4,6 löslichem Gesamtprotein nach Lowry, die chromatographische Ermittlung der Konzentration von bei pH 4,6 löslichem α-Lactalbumin bzw. β-Lactoglobulin  alle drei als Maß für die Proteindenaturierung  sowie die fluorimetrische Vermessung des FAST-Indexes als Maß für die Bildung fluoreszierender Verbindungen im Laufe der Maillard-Reaktion. Darüber hinaus wurde als zu testende Methode der relative Anteil des Amadoriprodukts von α-Lactalbumin mittels MALDI-TOF-MS bestimmt. Vorteil letzterer Analytik war ihre sehr schnelle und einfache Durchführung und ihre Eignung für stärker erhitzte Proben und komplexere Matrices wie z. B. Säuglingsmilchnahrung. Hingegen stießen die aufgeführten klassischen Techniken schnell an ihre Grenzen, da sie nur in einem begrenzten Erhitzungsintervall einen Rückschluss auf die thermische Behandlung zuließen. Der getestete massenspektrometrische Hitzeparameter stand in exponentiellem Zusammenhang mit allen klassischen Indikatoren, lediglich der FAST-Index nahm anfangs erst linear mit der Amadoriproduktbildung zu, um anschließend exponentiell zu korrelieren. Die Berechnung der Korrelationskoeffizienten ergab Werte zwischen 0,968 und 0,997. Die Korrelationskurve war dabei abhängig von der Temperatur, nur zwischen dem relativen Gehalt des Amadoriprodukts an α-Lactalbumin und der Konzentration an bei pH 4,6 löslichem α-Lactalbumin wurde ein von der Erhitzungstemperatur unabhängiger Zusammenhang festgestellt. Die erhaltenen Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die getestete massenspektrometrische Methode eine wertvolle Alternative zu den Techniken darstellt, die bislang zur Bewertung der thermischen Belastung eingesetzt werden. Zusammenfassend ist festzustellen, dass die weitreichenden Einsatzmöglichkeiten der MALDI-TOF-MS in der Milchanalytik aufgezeigt werden konnten. Die MALDI-TOF-MS erlaubte es einerseits, Proteinmodifizierungen während der thermischen Behandlung zu identifizieren und zu lokalisieren, was Vorhersagen über ernährungsphysiologische Eigenschaften erlaubt. Andererseits konnte die Technik erfolgreich dazu eingesetzt werden, das noch immer nicht komplett aufgeklärte niedermolekulare Proteom der Milch näher zu charakterisieren, was vor allem technologische Bedeutung hat und in Bezug auf die bioaktive Wirkung von Milch eine Rolle spielen könnte. Schließlich konnte zusätzlich gezeigt werden, dass MALDI-TOF-MS auch bei der schnellen Kontrolle der Hitzebelastung von Milchprodukten eine Alternative zu den bisher vorhandenen Methoden darstellt.Milk and dairy products are of major importance in human nutrition and represent an ideal source of all nutrients for a healthy growth. Among those, the milk proteins are an especially important species, featuring a very high nutritional value owing to their good digestibility and their favorable amino acid composition. However, during industrial processing dairy products are usually heated to obtain microbial stability or for technological purposes. Thereby, a multitude of chemical reactions takes place, significantly changing the nutritional properties of the milk proteins. In the non-enzymatic glycation, the so-called Maillard reaction, the nitrogen of a protein-bound amino group, preferentially a lysine residue, reacts with the carbonyl function of the milk sugar lactose to form the Amadori product, which subsequently undergoes a series of further reactions yielding a great variety of chemical structures. Additionally, milk proteins are subjected to various oxidation reactions, leading to the degradation of essential amino acids. Furthermore, cross linking reactions in the advanced stage of the Maillard reaction additionally reduce protein digestibility. Therefore, the nutritional value of the milk proteins might be drastically reduced in the course of thermal treatment. Hence, careful control of the industrial processing and the elucidation of the implicated reactions are an important challenge. During the last years, mass spectrometric techniques have been established as a reliable tool for the investigation of the milk proteom and the characterization of heat induced structural changes of the milk proteins. In this regard, matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) has gained increased attention, as it represents a very soft ionization method. In this dissertation, MALDI-TOF-MS was used for the systematic analysis of protein modifications during the heat treatment of milk and dairy products. First of all, modifications of whey proteins which were formed in heated milk models were analyzed. Partial enzymatic hydrolysis of the proteins allowed the identification of the modification sites in the amino acid sequence. In the following, several techniques for protein separation were tested for their suitability for the analysis of dairy products. Detected modifications in commercially available samples were relatively quantified. Furthermore, the low molecular protein fraction of milk, which has not been fully understood so far, was characterized by means of MALDI-TOF-MS. The last project dealt with the comparison of a new mass spectrometric approach for the evaluation of the thermal treatment of milk with several classical methods. Solutions of the two main whey proteins α-lactalbumin and β-lactoglobulin, respectively, were heated with lactose in a milk-resembling buffer in concentrations that are usually found in milk. Structural changes were monitored via MALDI-TOF-MS. The non-treated commercially available standard as well as the heated protein without the addition of sugar served as controls. By means of their specific mass shift in comparison to the native unmodified signal, protein modifications could be identified. The Amadori product was determined as main glycation product. α-Lactalbumin and β-lactoglobulin species with zero to four lactose adducts could be identified in the intact protein. To achieve a better resolution of the modifications and to get a more detailed insight into the nature and site of further modifications, a partial enzymatic hydrolysis was carried out prior to the mass spectrometric analysis by using the endoproteinase AspN. Thus, upon incubation of α-lactalbumin with lactose, lactulosyllysine and its degradation product Nε-carboxymethyllysine (CML) were identified at lysine 5, whereas glycation at the N-terminus could not be excluded. Furthermore, the oxidation of lysine 5 to lysine aldehyde was observed. Mass shifts of 16 Da indicated the formation of cysteine sulfenic acid at cysteine 28, 111, and 120 or of hydroxytryptophan at tryptophan 26, 104, and 118. Incubation of the protein with hydrogen peroxide led to the oxidation of methionine 90 to methionine sulfoxide, so it stands to reason that an analogous reaction took place during the heating with lactose. As a sugar independent reaction, the N-terminal glutamic acid cyclized to a pyrrolidone. Regarding β-lactoglobulin, the incubation with lactose led to the formation of the Amadori product at lysine 47 and either at lysine 138 or 141, which subsequently reacted to CML. Lysine 8 was selectively modified to lysine aldehyde. Methionine 7, 24, and 145 were oxidized to methionine sulfoxide. Upon treatment of β-lactoglobulin with hydrogen peroxide, the formation of methionine sulfoxide at methionine 107 was observed. In contrast, following the reaction of β-lactoglobulin with lactose, the peptide containing this amino acid could not be detected. However, it seems very likely that methionine 107 was also oxidized. Finally, the thermal treatment resulted in the oxidation either of methionine 24 to methionine sulfone or of tryptophan 19 to N-formylcynurenine or to hydroxytryptophan. In the next step, different dairy products were analyzed with regard to their modifications of the whey proteins. By direct measurement via MALDI-TOF-MS, the detection of one up to three lactose adducts was achieved. The purification of the samples with a technique based on metal affinity chromatography led to an increase of the signal intensities as well as to an improvement of the signal-to-noise ratio, allowing a more sensitive detection of the modifications. Since an isolation of the proteins is necessary prior to partial enzymatic hydrolysis, three different methods for the separation of proteins were tested. By means of immunoaffinity chromatography, α-lactalbumin and β-lactoglobulin, respectively, could be isolated from the rest of the milk proteins. Also glycated α-lactalbumin was captured. Furthermore, preliminary experiments showed that it is possible to perform a digestion with the endoproteinase AspN after the isolation of the proteins. One-dimensional sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) also resulted in a very good separation of most of the milk proteins. With an additional isoelectric focusing, genetic variants and proteins with different phosphorylation degree could be separated. Moreover, the analysis of model proteins which were incubated with lactose showed that two-dimensional gel electrophoresis renders the separation of modified proteins possible. The following experiments with commercially available dairy products were performed with one-dimensional SDS-PAGE and subsequent partial enzymatic hydrolysis by using the endoproteinase AspN. Only modifications of β-lactoglobulin were investigated. Firstly, a slight decrease of the spectra quality after in-gel-digest was observed in the model proteins which had already been analyzed previously. In heated raw milk, the Amadori product could be detected at lysine 47 and 138 or 141 as well as methionine sulfoxide at methionine 7, 24, and 145. Commercially available dairy products showed the same modifications in the amino acid sequence. The relative quantification allowed a quantitative evaluation of the heat induced protein damage. One condensed milk and one infant formula turned out to be the most affected samples. However, it was difficult to assess the protein oxidation since the sample preparation entailed an increased artefactual formation of methionine sulfoxide. Industrial heat treatment tended to result in higher contents of methionine sulfoxide in the analyzed products. The differences compared to raw milk, however, were not significant. In order to characterize the low molecular protein fraction of milk, which has not yet been fully elucidated, milk was purified by means of metal affinity chromatography and subsequently measured via MALDI-TOF-MS. Applying this technique, spectra with clearly arranged signals and a very good signal-to-noise ratio could be generated. Two of the detected peptides were identified as fragments of αs1-casein via MALDI-TOF/TOF-MS. After heating raw milk at 72 °C, 85 °C, or 120 °C, five new peptides with masses of 1974.4, 2218.7, 3730.1, 4297.8, and 4436.8 Da, respectively, were built, which were relatively quantified. Their formation was clearly dependent on hea

Comprehensive Analysis of Nonenzymatic Post-Translational β‑Lactoglobulin Modifications in Processed Milk by Ultrahigh-Performance Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry

Nonenzymatic post-translational protein modifications (nePTMs) result in changes of the protein structure that may severely influence physiological and technological protein functions. In the present study, ultrahigh-performance liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry (UHPLC–ESI-MS/MS) was applied for the systematic identification and site-specific analysis of nePTMs of β-lactoglobulin in processed milk. For this purpose, β-lactoglobulin, which had been heated with lactose under conditions to force nePTM formation (7 d/60 °C), was screened for predicted modifications by using full scans and enhanced resolution scan experiments combined with enhanced product ion scans. Thus, the main glycation, glycoxidation, oxidation, and deamidation products of lysine, arginine, methionine, cysteine, tryptophan, and asparagine, as well as the N-terminus, were identified. Using these MS data, a very sensitive scheduled multiple reaction monitoring method suitable for the analysis of milk products was developed. Consequently, 14 different PTM structures on 25 binding sites of β-lactoglobulin were detected in different milk products

Analysis of the peptide profile of milk and its changes during thermal treatment and storage

In this study a new method was developed for analysis of the low molecular weight protein fraction of milk, allowing a simple and fast overview of the peptide profile of various milk samples. For this purpose, immobilized metal affinity chromatography (IMAC) was coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS). By this technique, two major peptides in milk could be identified as fragments of alpha-s1-casein. During heat treatment of raw milk, five new peptides were generated, the origin of which could be assigned to the casein fraction. Storage experiments with extended shelf life milk at 4 degrees C did not show any changes in the peptide profile, whereas in ultra high temperature milk stored at room temperature, one peptide increased significantly, which was identified as the N-terminus of alpha-s1-casein. The peptide was assumed to be formed in an enzymatic reaction, which was confirmed in a storage experiment with sterilized milk. Analyses of different commercially available milk samples confirmed the results obtained with the heated and stored milk. Furthermore, differences in the peptide profiles of the samples, probably due to different cow breeds or lactation stages, were observed. These results establish IMAC prior to MALDI-TOF-MS as a valid tool for the rapid analysis of the peptide profile of milk

Modified Peptides as Indicators for Thermal and Nonthermal Reactions in Processed Milk

Site-specific relative quantification of β-lactoglobulin modifications in heated milk and dairy products was performed to determine their thermal and nonthermal origins and to evaluate marker candidates for milk processing. Therefore, formation kinetics of 19 different structures at 26 binding sites were analyzed by ultrahigh-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring (UHPLC-MS/MS/MRM) after specific protein hydrolysis. The results indicate that (i) site-specific analysis of lactulosyllysine may be a more sensitive marker for mild heat treatment than its overall content; (ii) <i>N</i>^ε-carboxymethyllysine, N-terminal ketoamide, and asparagine deamidation are of thermal origin and may be good markers for rather intensive heat treatment, whereas <i>N</i>^ε-carboxyethyllysine reflects thermal and nonthermal processes; (iii) the relevance of methylglyoxal-derived arginine modifications is low compared to that of other modifications; (iv) oxidation of methionine and cysteine is a rather weak indicator of thermal impact; and (v) the tryptophan modifications formylkynurenine and kynurenine are of nonthermal origin and further degraded during processing