Role of transcription factors in the functional development of gamma-delta T lymphocytes

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014O contacto contínuo com o exterior e a vasta exposição a patogéneos levou a que, durante a evolução, organismos superiores desenvolvessem mecanismos de protecção especializados. O sistema imunitário, constituído por um vasto número de células e tecidos especializados, pode ser subdividido em dois grupos – sistema imune inato ou adaptativo – de acordo com o tipo de resposta que é desenvolvido. As células do sistema imune inato, maioritariamente localizadas em locais de alto contacto com o exterior (p.e. o epitélio), caracterizam-se pela sua resposta não especializada – e portanto, inata – que permite um rápido controlo de infecções. As células T γδ, natural killer (NK) e macrófagos são exemplos de células pertencentes a este tipo de imunidade. Por outro lado, células do sistema imune adaptativo como as células T e células B, possuem a capacidade de desenvolver uma resposta mais duradora e especializada, que lhes permite não só combater mais eficazmente uma infecção mas também desenvolver uma memória imunitária. Uma característica funcional partilhada entre as células do sistema imune inato e adaptativo é a produção de citocinas. A sua produção e consequente secreção permitem uma melhor e mais eficaz resolução de uma infecção, através do recrutamento e activação de células do sistema imune para o local afectado. Os linfócitos T γδ em conjunto com os linfócitos T αβ CD4, produzem citocinas pro-inflamatórias como o IFN-γ e a IL-17A. Todavia, as células T γδ distinguem-se dos últimos pela sua rápida capacidade de resposta a estímulos externos, através da produção e secreção de citocinas na periferia. Esta característica advém da diferenciação dos seus progenitores em células T γδ especializadas na produção de IFN- γ (CD27+) ou de IL-17A (CD27-) no timo, ao passo que linfócitos T CD4 abandonam o timo sob a forma de linfócitos naïve, necessitando de estímulos prolongados para que se diferenciem em linfócitos T efectores. Os mecanismos moleculares que regulam os processos de diferenciação e produção de citocinas encontram-se extensamente estudados em linfócitos T αβ. O factor de transcrição T-bet, por exemplo, regula a diferenciação dos linfócitos T CD4 em linfócitos Th1 CD4 bem como a produção de IFN-γ. Contudo, pouco é conhecido relativamente aos reguladores da produção de citocinas nos linfócitos T αβ. Por esta razão propusemo-nos estudar o papel de alguns dos factores de transcrição na regulação da transcrição de citocinas como o IFN- γ e IL-17A. O paralelismo entre os linfócitos Th1 CD4 produtores de IFN- γ e os linfócitos T γδ 27+ e entre os linfócitos Th17 CD4 produtores de IL-17A e os linfócitos T γδ27- levou-nos a escolher como objecto de estudo vários factores de transcrição associados à produção destas citocinas nos linfócitos T CD4. Tendo isto, escolhemos o T-bet e o factor de transcrição Eomes, envolvido na produção de IFN-γ em linfócitos T CD8. Associados à diferenciação dos linfócitos T CD4 em Th17, vários factores de transcrição foram ainda associados à regulação da transcrição de IL-17A nestas mesmas células. De entre estes os factores de eleição para o nosso estudo foram o ROR-γt, BATF e o RORα. De modo a estudar o papel de cada factor de transcrição nos linfócitos Tγδ usámos ratinhos geneticamente modificados, nos quais cada um destes factores de transcrição se encontra deletado. Para o estudo do factor de transcrição Eomes, recorremos ao uso de ratinhos nos quais apenas células que expressam o gene RAG1 - células T e B - apresentam a deleção específica para o factor de transcrição Eomes, visto a deleção total ser letal durante a embriogénese. Através de estudos in vitro usando diversas condições de estimulação (citocinas e anticorpos monoclonais), foi-nos possível aferir quais destas permitem induzir a produção de IFN-γ em linfócitos T γδ27+ e de IL-17A em linfócitos T γδ27-. De forma a determinar o impacto que a ausência de cada factor de transcrição teria na produção de IFN-γ e IL-17A, optámos pelo o uso dos anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 no caso dos linfócitos T 27+ e das citocinas IL-1β mais IL-23 no caso dos linfócitos T γδ27-. É de salientar que na presença de IL-1β e IL-23 os linfócitos T γδ27-, como já anteriormente descrito pelo laboratório, demonstraram não só a capacidade de produzir outras citocinas em simultâneo – como a IL-17F e a IL-22 – mas também a capacidade de co-produzir IFN-γ e IL-17A. Os nossos resultados in vitro demonstraram que, na ausência de T-bet, os linfócitos T γδ 27+ possuem a mesma capacidade de produção de IFN-γ apesar de o número de linfócitos que produz esta citocina ser menor. Este resultado sugere que os linfócitos T γδ27+ possam depender parcialmente do T-bet. Por outro lado, a ausência do factor de transcrição Eomes não revelou diferenças na produção de IFN-γ, demonstrando que os linfócitos T γδ27+ não requerem Eomes para a produção de IFN- γ. Já a produção de IFN-g pelos linfócitos T γδ27- não sofreu quaisquer alterações na ausência tanto do factor de transcrição T-bet assim como na do Eomes. Estes resultados sugerem então que estes linfócitos apresentam um diferente mecanismo na regulação da transcrição do IFN-γ. Contudo, as experiências in vitro nem sempre replicam a realidade in vivo. Por esta razão e com o intuito de compreender os mecanismos de regulação da produção destas citocinas recorremos a dois modelos murinos – EAE e Listeria monocytogenes – nos quais foi demonstrada a presença de linfócitos T γδ27- produtores de IFN- γ. Contudo, o modelo experimental de esclerose múltipla (EAE), não nos permitiu observar a produção de IFN- γ em linfócitos T γδ. No entanto, através do uso do modelo de infecção (Listeria monocytogenes) foi possível observar que a ausência de T-bet leva a um desaparecimento completo das células co-produtoras de IFN- γ e IL-17A. Estes resultados sugerem assim, que linfócitos T γδ27- requererem o factor de transcrição T-bet para a produção de IFN- γ. A análise da produção de IL-17A em linfócitos T γδ27- demonstrou que estes são inteiramente dependentes do factor de transcrição ROR γt. Verificámos ainda que esta dependência não se encontra limitada à produção de IL-17A estendendo-se também ao desenvolvimento de uma população específica de linfócitos T γδ27- que apenas produz IL-17A, designada CCR6+ γδ27-. Foi também possível observar que os linfócitos T γδ27- não requerem os factores de transcrição BATF e RORα para a produção de IL-17A. Durante esta análise, contrariamente ao esperado, foi ainda detectado um aumento no número de linfócitos T γδ27- que produziam IL-17A na ausência do RORα. Estes resultados levaram-nos a prosseguir um estudo mais detalhado sobre o papel do RORα em linfócitos T γδ27-. Para estudar o papel do factor de transcrição ROR em células T γ foram usados ratinhos que expressam uma forma truncada, não funcional, do factor RORα. Ao investigar o papel do RORα nos linfócitos T γδ, deparámo-nos que o aumento no número de células produtoras de IL-17A não se devia a um impacto na diferenciação dos linfócitos T CCR6+ γδ27-. No entanto, observámos um aumento da proporção de linfócitos T γδ expressando a cadeia Vγ4 (maioritariamente produtores de IL-17A) e uma diminuição na proporção de linfócitos T γδ expressando a cadeia Vγ1 (maioritariamente produtores de IFN- γ) no seu TCR. Este aumento foi não só detectado na periferia como também no timo, em linfócitos T γδ imaturos (CD24+), sugerindo a existência de um papel do ROR no rearranjo das cadeias gamma do TCR dos linfócitos T γδ. Mais ainda, podemos observar que o aumento no número de linfócitos produtores de IL-17A, após estimulo com IL-1β mais IL-23 durante a noite, não se devia apenas a um aumento do número de linfócitos Vγ4, mas também a um aumento do número de células produtoras de IL-17A de entre a população Vγ1-Vγ4-, que acreditamos ser constituída por linfócitos T Vγ6+ γδ. Estes resultados sugerem assim que o factor de transcrição RORα possui dois papéis distintos em linfócitos T γδ , através do controlo do rearranjo das cadeias gamma dos linfócitos T γδ e da regulação da produção de IL-17 em linfócitos T V 1-Vγ 4- γδ. Em suma, os nossos resultados sugerem a existência de algumas semelhanças nos mecanismos de regulação da produção de IL-17A e IFN-γ entre os linfócitos Th1 CD4 e os linfócitos T γδ27+ e γδ27-. Especificamente, estes resultados parecem sugerir um papel do factor de transcrição RORa no desenvolvimento e produção de IL-17A em linfócitos T γδ.γδ T cells are a major source of the proinflammatory cytokines IFN- γ and IL-17, together with αβ CD4 T helper cells. However in stark contrast with the latter, one of the main features of γδ T cells is their briskness at cytokine production in the periphery. This is mostly attributable to their programmed phenotype(s) that distinguishes IFN- γ-producing CD27+ (γδ27+) and IL-17-producing CD27- (γδ27-) subsets. Importantly, γδ27+ cells are stably committed to express Ifng but not Il17, whereas γδ27- cells spontaneously make IL-17 but can be induced to produce IFN-γ (as well as IL-17F, IL-22, GM-CSF) under specific inflammatory conditions. Our understanding of the transcriptional regulators of the production of these cytokine in both γδ T cell subsets lags behind that of CD4 T cells. Here we show that γδ T cells do not rely entirely on the same transcriptional mechanisms for their functional differentiation. Remarkably, IFN- γ production by both γδ27+ and IL17+ γδ27- T cells relies on the Th1 transcription factor (TF) T-bet but is dispensable of Eomes. This suggests a T-bet-dependent module for IFN- γ production shared by conventional CD4 T cells and innate-like γδ T cells. By contrast and to our surprise, regarding the Th17 TFs and IL-17 production, neither BATF nor RORα showed to be required by γδ27- T cells, which appear to depend solely on RORγt. Interestingly, mice lacking RORα showed an increased number of IL-17-producing Vγ1-Vγ4- cells upon stimulation as well as a change in the proportion of Vγ4+ and Vγ1+ γδ T cells. Together our findings illustrate a simpler mechanism for regulation of cytokine production by γδ T cells which allows a faster response to stimulus. In addition, our work revealed a role for RORα in the development of certain γδ T cell subsets as well as in the functional differentiation of IL-17-production

Maturity-Onset Diabetes of the Young (MODY) in Portugal: Novel GCK, HNFA1 and HNFA4 Mutations

Maturity-onset diabetes of the young (MODY) is a frequently misdiagnosed type of diabetes, which is characterized by early onset, autosomal dominant inheritance, and absence of insulin dependence. The most frequent subtypes are due to mutations of the GCK (MODY 2), HNF1A (MODY 3), and HNF4A (MODY 1) genes. We undertook the first multicenter genetic study of MODY in the Portuguese population. The GCK, HNF1A, and HNF4A genes were sequenced in 46 unrelated patients that had at least two of the three classical clinical criteria for MODY (age at diagnosis, family history, and clinical presentation). The functional consequences of the mutations were predicted by bioinformatics analysis. Mutations were identified in 23 (50%) families. Twelve families had mutations in the GCK gene, eight in the HNF1A gene, and three in the HNF4A gene. These included seven novel mutations (GCK c.494T>C, GCK c.563C>G, HNF1A c.1623G>A, HNF1A c.1729C>G, HNF4A c.68delG, HNF4A c.422G>C, HNF4A c.602A>C). Mutation-positive patients were younger at the time of diagnosis when compared to mutation-negative patients (14.3 vs. 23.0 years, p = 0.011). This study further expands the spectrum of known mutations associated with MODY, and may contribute to a better understanding of this type of diabetes and a more personalized clinical management of affected individuals

Characterisation of microbial attack on archaeological bone

As part of an EU funded project to investigate the factors influencing bone preservation in the archaeological record, more than 250 bones from 41 archaeological sites in five countries spanning four climatic regions were studied for diagenetic alteration. Sites were selected to cover a range of environmental conditions and archaeological contexts. Microscopic and physical (mercury intrusion porosimetry) analyses of these bones revealed that the majority (68%) had suffered microbial attack. Furthermore, significant differences were found between animal and human bone in both the state of preservation and the type of microbial attack present. These differences in preservation might result from differences in early taphonomy of the bones. © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved

NEOTROPICAL XENARTHRANS: a data set of occurrence of xenarthran species in the Neotropics

Xenarthrans—anteaters, sloths, and armadillos—have essential functions for ecosystem maintenance, such as insect control and nutrient cycling, playing key roles as ecosystem engineers. Because of habitat loss and fragmentation, hunting pressure, and conflicts with domestic dogs, these species have been threatened locally, regionally, or even across their full distribution ranges. The Neotropics harbor 21 species of armadillos, 10 anteaters, and 6 sloths. Our data set includes the families Chlamyphoridae (13), Dasypodidae (7), Myrmecophagidae (3), Bradypodidae (4), and Megalonychidae (2). We have no occurrence data on Dasypus pilosus (Dasypodidae). Regarding Cyclopedidae, until recently, only one species was recognized, but new genetic studies have revealed that the group is represented by seven species. In this data paper, we compiled a total of 42,528 records of 31 species, represented by occurrence and quantitative data, totaling 24,847 unique georeferenced records. The geographic range is from the southern United States, Mexico, and Caribbean countries at the northern portion of the Neotropics, to the austral distribution in Argentina, Paraguay, Chile, and Uruguay. Regarding anteaters, Myrmecophaga tridactyla has the most records (n = 5,941), and Cyclopes sp. have the fewest (n = 240). The armadillo species with the most data is Dasypus novemcinctus (n = 11,588), and the fewest data are recorded for Calyptophractus retusus (n = 33). With regard to sloth species, Bradypus variegatus has the most records (n = 962), and Bradypus pygmaeus has the fewest (n = 12). Our main objective with Neotropical Xenarthrans is to make occurrence and quantitative data available to facilitate more ecological research, particularly if we integrate the xenarthran data with other data sets of Neotropical Series that will become available very soon (i.e., Neotropical Carnivores, Neotropical Invasive Mammals, and Neotropical Hunters and Dogs). Therefore, studies on trophic cascades, hunting pressure, habitat loss, fragmentation effects, species invasion, and climate change effects will be possible with the Neotropical Xenarthrans data set. Please cite this data paper when using its data in publications. We also request that researchers and teachers inform us of how they are using these data

Global variation in postoperative mortality and complications after cancer surgery: a multicentre, prospective cohort study in 82 countries

© 2021 The Author(s). Published by Elsevier Ltd. This is an Open Access article under the CC BY-NC-ND 4.0 licenseBackground: 80% of individuals with cancer will require a surgical procedure, yet little comparative data exist on early outcomes in low-income and middle-income countries (LMICs). We compared postoperative outcomes in breast, colorectal, and gastric cancer surgery in hospitals worldwide, focusing on the effect of disease stage and complications on postoperative mortality. Methods: This was a multicentre, international prospective cohort study of consecutive adult patients undergoing surgery for primary breast, colorectal, or gastric cancer requiring a skin incision done under general or neuraxial anaesthesia. The primary outcome was death or major complication within 30 days of surgery. Multilevel logistic regression determined relationships within three-level nested models of patients within hospitals and countries. Hospital-level infrastructure effects were explored with three-way mediation analyses. This study was registered with ClinicalTrials.gov, NCT03471494. Findings: Between April 1, 2018, and Jan 31, 2019, we enrolled 15 958 patients from 428 hospitals in 82 countries (high income 9106 patients, 31 countries; upper-middle income 2721 patients, 23 countries; or lower-middle income 4131 patients, 28 countries). Patients in LMICs presented with more advanced disease compared with patients in high-income countries. 30-day mortality was higher for gastric cancer in low-income or lower-middle-income countries (adjusted odds ratio 3·72, 95% CI 1·70–8·16) and for colorectal cancer in low-income or lower-middle-income countries (4·59, 2·39–8·80) and upper-middle-income countries (2·06, 1·11–3·83). No difference in 30-day mortality was seen in breast cancer. The proportion of patients who died after a major complication was greatest in low-income or lower-middle-income countries (6·15, 3·26–11·59) and upper-middle-income countries (3·89, 2·08–7·29). Postoperative death after complications was partly explained by patient factors (60%) and partly by hospital or country (40%). The absence of consistently available postoperative care facilities was associated with seven to 10 more deaths per 100 major complications in LMICs. Cancer stage alone explained little of the early variation in mortality or postoperative complications. Interpretation: Higher levels of mortality after cancer surgery in LMICs was not fully explained by later presentation of disease. The capacity to rescue patients from surgical complications is a tangible opportunity for meaningful intervention. Early death after cancer surgery might be reduced by policies focusing on strengthening perioperative care systems to detect and intervene in common complications. Funding: National Institute for Health Research Global Health Research Unit

Effects of hospital facilities on patient outcomes after cancer surgery: an international, prospective, observational study

© 2022 The Author(s). Published by Elsevier Ltd. This is an Open Access article under the CC BY 4.0 licenseBackground: Early death after cancer surgery is higher in low-income and middle-income countries (LMICs) compared with in high-income countries, yet the impact of facility characteristics on early postoperative outcomes is unknown. The aim of this study was to examine the association between hospital infrastructure, resource availability, and processes on early outcomes after cancer surgery worldwide. Methods: A multimethods analysis was performed as part of the GlobalSurg 3 study—a multicentre, international, prospective cohort study of patients who had surgery for breast, colorectal, or gastric cancer. The primary outcomes were 30-day mortality and 30-day major complication rates. Potentially beneficial hospital facilities were identified by variable selection to select those associated with 30-day mortality. Adjusted outcomes were determined using generalised estimating equations to account for patient characteristics and country-income group, with population stratification by hospital. Findings: Between April 1, 2018, and April 23, 2019, facility-level data were collected for 9685 patients across 238 hospitals in 66 countries (91 hospitals in 20 high-income countries; 57 hospitals in 19 upper-middle-income countries; and 90 hospitals in 27 low-income to lower-middle-income countries). The availability of five hospital facilities was inversely associated with mortality: ultrasound, CT scanner, critical care unit, opioid analgesia, and oncologist. After adjustment for case-mix and country income group, hospitals with three or fewer of these facilities (62 hospitals, 1294 patients) had higher mortality compared with those with four or five (adjusted odds ratio [OR] 3·85 [95% CI 2·58–5·75]; p<0·0001), with excess mortality predominantly explained by a limited capacity to rescue following the development of major complications (63·0% vs 82·7%; OR 0·35 [0·23–0·53]; p<0·0001). Across LMICs, improvements in hospital facilities would prevent one to three deaths for every 100 patients undergoing surgery for cancer. Interpretation: Hospitals with higher levels of infrastructure and resources have better outcomes after cancer surgery, independent of country income. Without urgent strengthening of hospital infrastructure and resources, the reductions in cancer-associated mortality associated with improved access will not be realised. Funding: National Institute for Health and Care Research