Ο ρόλος του μεταβολισμού της α-synuclein: Μελέτη της επίδρασης του μηχανισμού αποικοδόμησης στη μετάδοση της παθολογίας

Η α-συνουκλεΐνη (ASYN) είναι μια πρωτεΐνη που εντοπίζεται στα προσυναπτικά άκρα των νευρώνων. Ο ρόλος της πρωτεΐνης δεν είναι πλήρως διευκρινισμένος. Θεωρείται ότι συμμετέχει στη ρύθμιση της έκκρισης και στρατολόγησης κυστιδίων μέσω αλληλεπίδρασης της με επιφανειακά λιπίδια. Η συσσώρευση της και η δημιουργία ολιγομερών μορφών της πρωτεΐνης οδηγεί σε τοξικότητα και προτείνεται πως συμμετέχει στην παθογένεση της νόσου του Parkinson (PD). Η ανεξέλεγκτη συσσώρευση είναι πιθανόν να οφείλεται σε βλάβη των μηχανισμών αποικοδόμησης. Παράλληλα, η μετάδοση της νόσου έχει σχετιστεί με την έκκριση της ASYN εντός και εκτός εξωσωμάτων με ένα μηχανισμό διάδοσης τύπου πρίον. Η PD χαρακτηρίζεται από επιλεκτική απώλεια των ντοπαμινεργκών νευρώνων της μέλαινας ουσίας του εγκεφάλου και την παρουσία πρωτεϊνικών εγκλείστων που ονομάζονται σωμάτια Lewy. Στη συγκεκριμένη διπλωματική εργασία, εξετάζεται η επίδραση δύο ενζύμων στη συσσώρευση αλλά και την έκκριση της ASYN. Τα ένζυμα αυτά είναι η γλυκοσερεβροσιδάση (GCase) και η L-DOPA αποκαρβοξυλάση (DDC). Παράλληλα, προσδιορίζεται και ο πιθανός ρόλος των μηχανισμών αποικοδόμησης στις παρατηρούμενες μεταβολές. Συγκεκριμένες έρευνες δείχνουν ότι μεταλλαγές στο γονίδιο GBA1 που κωδικοποιεί το λυσοσωμικό ένζυμο GCase συνδέονται με αυξημένο ρίσκο ανάπτυξης συνουκλεϊνοπαθειών όπως η PD. Εξαιτίας της ύπαρξης μελετών που επιβεβαιώνουν τη συσχέτιση της γλυκοσερεβροσιδάσης με την ASYN πραγματοποιήθηκε in vivo πειραματικός σχεδιασμός. Χρησιμοποίθηκαν διαγονιδιακοί μύες που εκφράζουν την ανθρώπινη μεταλλαγμένη Α53Τ-ASYN, με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της στον εγκέφαλο. Πραγματοποιήθηκε μερική αναστολή της ενεργότητας γλυκοσερεβροσιδάσης με τον ομοιοπολικό αναστολέα Conduritol B epoxide (CBE). Ο αναστολέας χορηγήθηκε μέσω της ενδοπεριτοναϊκής οδού. Ακολούθησε απομόνωση του εγκεφάλου και στη συνέχεια, ελέγχθηκε η ενζυμική ενεργότητα της GCase καθώς και η ενεργότητα του πρωτεασώματος στο τμήμα του φλοιού. Επιπροσθέτως, προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της ενδοκυτταρικής ASYN και της φωσφορυλιωμένης παθολογικής μορφής της στο μεσεγκέφαλο, το ραβδωτό σώμα και τον εγκεφαλικό φλοιό. Τέλος, για τον έλεγχο της διαδικασίας έκκρισης της ASYN, επαναλήφθηκε η in vivo διαδικασία αναστολής του ενζύμου και απομονώθηκε ολόκληρος ο εγκέφαλος. Xρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση εξωσωμάτων και τον προσδιορισμό της ποσότητας τους, μέσω ανίχνευσης της συγκέντρωσης του ενζύμου ακετυλοχολινεστεράση που βρίσκεται στις μεμβράνες τους. Παράλληλα, προσδιορίστηκε η μεταβολή της ποσότητας ASYN , τόσο του μονομερούς όσο και των ολιγομερών τοξικών μορφών της που βρίσκονται εντός των εξωσωμάτων. Τα αποτελέσματα της εργασίας υποδεικνύουν ότι η απώλεια λειτουργίας της GCase, σε μύες οι οποίοι φέρουν τη μετάλλαξη A53T της ASYN, οδηγεί σε αύξηση του μονομερούς ASYN στο μεσεγκέφαλο και των ολιγομερών μορφών στο ραβδωτό σώμα. Συμπληρωματικά, παρατηρήθηκε ότι αυξάνεται τόσο η έκκριση των εξωσωμάτων όσο και οι ολιγομερείς μορφές ASYN εντός αυτών. Η μελέτη μας συμπεριλαμβάνει την επίδραση του ενζύμου L-DOPA αποκαρβοξυλάση (DDC), στα επίπεδα ASYN. Το ένζυμο καταλύει την αποκαρβοξυλίωση της L-3,4-διυδροξυφαινυλαλανίνης (L-DOPA) σε ντοπαμίνη (DA). Τα επίπεδα του νευροδιαβιβαστή αυτού μειώνονται στο ραβδωτό σώμα κατά τη νόσο Parkinson λόγω του θανάτου μεγάλου ποσοστού ντοπαμινεργικών νευρώνων. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν in vitro πειράματα χρησιμοποιώντας το κυτταρικό σύστημα ευκαρυωτικών κυττάρων CHO (Chinese Hamster Ovary cells) τα οποία εκφράζουν σε πολύ χαμηλά επίπεδα τη DDC με μη ανιχνεύσιμη ενζυμική ενεργότητα. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της επίδρασης του ενζύμου DDC και των πρόσφατα χαρακτηρισμένων ανθρώπινων ισομορφών του, DDC-3 και alt-DDC, στις τοξικές ολιγομερείς μορφές της ASYN ενδοκυτταρικά. Επιπλέον, εξετάστηκαν οι πιθανές μεταβολές της εκκρινόμενης ASYN που βρίσκεται ελεύθερη στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων είτε εγκλείεται εντός των εξωσωμάτων. Παράλληλα, προσδιορίστηκαν οι μεταβολές στον αριθμό των εκκρινόμενων εξωσωμάτων ανάλογα με την παρουσία των διαφορετικών ανθρώπινων ισομορφών. Τέλος, ελέγθηκε ο μηχανισμός αποικοδόμησης μέσω αυτοφαγίας ανάλογα με την ύπαρξη των ισομορφών, προκειμένου να προσεγγιστούν τα αίτια των παρατηρούμενων μεταβολών της ASYN. Ο έλεγχος έγινε μέσω παρατήρησης των δεικτών αυτοφαγίας LC3Ι, LC3 II και P62 που σχετίζονται με το σχηματισμό και την πορεία των αυτοφαγικών κυστιδίων. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας δείχνουν ότι οι ανθρώπινες ισομορφές της DDC επηρεάζουν τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ολιγομερών ASYN. Παράλληλα, φαίνεται ότι πιθανόν να τροποποιούν την έκκριση εξωσωμάτων και την εκκρινόμενη ASYN εντός αυτών. Συμπληρωματικά, οι ισομορφές ίσως να επηρεάζουν και τη διαδικασία της μακροαυτοφαγίας κάτι που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ερμηνεία των παρατηρούμενων μεταβολών της ASYN.Α-synuclein (ASYN) is a presynaptic neuronal protein whose exact role has not yet been defined. It is considered to participate in vesicle fusion with plasma membrane through interaction with surface lipids. ASYN aggregation and formation of oligomeric species leads to toxicity and is proposed to participate in Parkinson’s disease (PD) pathogenesis. A dysfunction in degradation mechanisms could lead to protein aggregation. Also, ASYN secretion has been linked to PD transmission following a prion-like mechanism. PD is characterized by selective loss of dopaminergic neurons in substantia nigra of the brain and the presence of intracellular inclusions called Lewy Bodies (LB). This project demonstrates the effect of two different enzymes in ASYN aggregation and secretion. The enzymes referred are: Glucocerebrosidase (GCase) and L-DOPA decarboxylase (DDC). A possible role of degradation mechanisms in changes observed is also examined. As it has been demonstrated, mutations in GBA1 gene which encodes GCase enzyme are linked to a higher risk in developing synucleinopathies such as PD. Due to this relation, an in vivo experiment was designed. Transgenic mice expressing A53T-ASYN mutation were used. It has been considered that this mutation leads to elevated aggregation of ASYN in the brain. Partial inhibition of GCase has been performed, using the covalent inhibitor Conduritol B epoxide (CBE), which has been injected intraperitoneally in A53T mice. After the isolation of the brain, a GCase assay and proteasome activity assay were performed, using the cortex of the brain. Intracellular ASYN and phosphorylated ASYN were also identified for the midbrain, striatum and cortex. Finally, the same in vivo procedure was repeated in order to isolate the whole brain and to examine changes in secretion. Exosomes were isolated and quantified by identifying the concentration of acetylocholinesterase, an enzyme found in exosomal membranes. Changes in monomer and toxic oligomeric species of ASYN engulfed in these exosomes were also examined. The results demonstrate that loss of GCase function in A53T transgenic mice, leads to an increase of ASYN monomer in the midbrain and an increase of ASYN oligomers in striatum. It has also been observed that exosome secretion as well as toxic oligomeric species of exosome associated ASYN are increased in case of GCase inhibition. The work demonstrated here, includes the effect of L-DOPA Decarboxylase (DDC) in ASYN levels. The enzyme catalyzes the decarboxylation of L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) to dopamine (DA). Dopamine levels are decreased in the striatum during PD due to increased death of dopaminergic neurons. Specifically, in vitro experiments were performed using CHO (Chinese Hamster Ovary cells) cell line, in which DDC activity is not detected and DDC expression is very low. The aim of this study is to determine the effect of human DDC and two of its recently characterized human isoforms DDC-3 και Alt-DDC, in toxic intracellular ASYN oligomeric species. Furthermore, possible changes in free or exosome associated secreted ASYN, were studied. Moreover, changes in exosome number were identified in cell lines expressing full-length and truncated human DDC isoforms. Finally, in order to understand further what could contribute in the changes observed in ASYN levels, degradation mechanism of autophagy was studied. Changes in autophagy specific markers LC3Ι, LC3 II and P62 were observed. These markers are associated with the procedure of autophagic vesicles formation. Our results demonstrate that human DDC isoforms could affect intracellular levels of ASYN oligomeric species. Additionally, it is proposed that they may modulate exosome secretion and exosome associated ASYN. Furthermore, it is possible that human DDC and its isoforms might modulate macroautophagy and this observation could be used for the interpretation of the changes in intracellular and extracellular ASYN levels

Towards a scalable, closed and automated platform for the production of cost-efficient allogeneic cell therapies: showcase of an exemplar iNK process

Please click Additional Files below to see the full abstract