Couplage entre introduction et réparation des cassures double brin pendant les réarrangements programmés du génome de Paramecium tetraurelia

L élimination programmée d ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l introduction de cassures double brin (CDB) de l ADN et la préservation de l intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n y a pas de jonctions d excision formées et les extrémités cassées s accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L hypothèse d une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l utilisation de microhomologie, a été émise. C est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome.Programmed elimination of germline specific DNA has been described in several eukaryotic organisms. These rearrangements are initiated through introduction of DNA double strand breaks (DSB). To ensure genome integrity, efficient repair is needed. In Paramecium tetraurelia, the genome is widely rearranged during development of a new somatic nucleus after introduction of tens of thousands of DSBs by the domesticated transposase PiggyMac (Pgm)These rearrangements consist in: the precise excision of thousands of unique and non coding sequences called IESs that interrupt 47% of genes in the germline; and the heterogeneous elimination of repeated sequences. It leads to internal deletions of variable sizes or to chromosome fragmentation with telomere addition at DNA ends.Implication of the Non Homologous End Joining Pathway (NHEJ) in precise IES excision has been proved. In cells depleted for Ligase IV or XRCC4, DSBs at IES boundaries are introduced normally but broken DNA ends accumulate without being repaired nor degraded. The repair pathway implicated in heterogeneous rearrangements is still unknown. An hypothesis would be that heterogeneous rearrangements involve a Ku independent alternative NHEJ (alt-NHEJ) pathway characterized by end resection and use of microhomologies. During my thesis I studied the role of Ku proteins in programmed genome rearrangements.Two KU70 genes and three KU80 genes has been identified in the Paramecium genome. KU70a and KU80c are specifically induced during programmed genome rearrangements. Encoded proteins localize in developing somatic nuclei. Gene extinction by RNA interference experiments proved that these genes are necessary for programmed genome rearrangements. At molecular level, non rearranged DNA is amplified in cells depleted for Ku. And more surprisingly, no programmed DSBs are introduced at IES boundaries in these cells.My results indicate that Ku is a part of a pre excision complex with the domesticated transposase Pgm and necessary for the introduction of programmed DSB during programmed genome rearrangements.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Functional specialization of Piwi proteins in Paramecium tetraurelia from post-transcriptional gene silencing to genome remodelling

Proteins of the Argonaute family are small RNA carriers that guide regulatory complexes to their targets. The family comprises two major subclades. Members of the Ago subclade, which are present in most eukaryotic phyla, bind different classes of small RNAs and regulate gene expression at both transcriptional and post-transcriptional levels. Piwi subclade members appear to have been lost in plants and fungi and were mostly studied in metazoa, where they bind piRNAs and have essential roles in sexual reproduction. Their presence in ciliates, unicellular organisms harbouring both germline micronuclei and somatic macronuclei, offers an interesting perspective on the evolution of their functions. Here, we report phylogenetic and functional analyses of the 15 Piwi genes from Paramecium tetraurelia. We show that four constitutively expressed proteins are involved in siRNA pathways that mediate gene silencing throughout the life cycle. Two other proteins, specifically expressed during meiosis, are required for accumulation of scnRNAs during sexual reproduction and for programmed genome rearrangements during development of the somatic macronucleus. Our results indicate that Paramecium Piwi proteins have evolved to perform both vegetative and sexual functions through mechanisms ranging from post-transcriptional mRNA cleavage to epigenetic regulation of genome rearrangements

Transposition du bacteriophage Mu : domaines fonctionnels de la transposase virale et role de la proteine FIS d'E. Coli

CNRS T Bordereau / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueSIGLEFRFranc

Réarrangements du génome chez Paramecium tetraurelia (ligases ADN et voies de End-Joining)

De façon spectaculaire, à chaque cycle sexuel, le cilié Paramecium remodèle l'intégralité de son génome somatique. Ce processus implique notamment l'excision de dizaines de milliers de courtes séquences (IES), présentant un dinucléotide 5'-TA-3' à chacune de leurs bornes. Les IES interrompant les séquences codantes, leur élimination précise est nécessaire à la survie de la descendance. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double-brin (CDB), dont la géométrie de 4 bases sortantes en 5' centrées sur le TA, permettrait un recollement des extrémités suite à une maturation minimale. Toutefois, les acteurs protéiques impliqués dans l'assemblage final et précis des gènes somatiques restent à établir. En me focalisant sur l'étape finale de réparation, j'ai tout d'abord caractérisé in silico les ligases ADN dépendantes de l'ATP de la paramécie. L'analyse fonctionnelle de la Ligase IV et de son partenaire Xrcc4, impliqués dans une voie cellulaire canonique de réparation des CDB (Non Homologous End-Joining ou NHEJ), a montré qu'ils étaient indispensables à la réparation des CDB introduites lors de l'excision des IES. Mes résultats ont mené à un modèle actualisé d'excision des IES de type couper & recoller . J'ai pu y inclure les acteurs protéiques avérés, ou supposés, notamment pour la protection des extrémités cassées et pour l'étape de maturation contrôlée, points déterminants pour une réparation précise hautement reproductible. Ainsi, la paramécie constituerait un excellent organisme modèle pour l'étude de l'implication de la voie NHEJ dans la réparation précise de CDB introduites de façon programmée à l'échelle d'un génome entier.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Global trends of whole-genome duplications revealed by the ciliate Paramecium tetraurelia.

The duplication of entire genomes has long been recognized as having great potential for evolutionary novelties, but the mechanisms underlying their resolution through gene loss are poorly understood. Here we show that in the unicellular eukaryote Paramecium tetraurelia, a ciliate, most of the nearly 40,000 genes arose through at least three successive whole-genome duplications. Phylogenetic analysis indicates that the most recent duplication coincides with an explosion of speciation events that gave rise to the P. aurelia complex of 15 sibling species. We observed that gene loss occurs over a long timescale, not as an initial massive event. Genes from the same metabolic pathway or protein complex have common patterns of gene loss, and highly expressed genes are over-retained after all duplications. The conclusion of this analysis is that many genes are maintained after whole-genome duplication not because of functional innovation but because of gene dosage constraints