Children exposure to multiple mycotoxins through food consumption: a holistic approach for risk assessment

Food ingestion is considered a major route of human exposure to chemical contaminants, namely mycotoxins. Considering their toxic and carcinogenic effects, mycotoxins exposure assessment assumes particular importance, especially when vulnerable populations as children, are involved. Although there are increasing evidences of mycotoxins co-contamination in food, scarce data are available concerning children exposure to multiple mycotoxins, their bioaccessibility and the potential toxic effects resulting from intestinal exposure. Addressing these considerations, this thesis main objectives were: to characterize Portuguese children (under 3 years old) exposure to multiple mycotoxins through food consumption; to determine mycotoxins bioaccessibility in foods usually consumed by children; to evaluate intestinal toxic effects associated to mycotoxins exposure; and, to characterize the risk associated to the consumption of foods, considering data from exposure assessment, bioaccessibility and intestinal toxicity assays. The present thesis applied for the first time a holistic approach, gathering results obtained through different first-line methodologies, comprising probabilistic tools to estimate mycotoxins daily intake and in vitro assays to determine bioaccessibility and toxic effects. Results revealed a potential health concern for aflatoxins exposure with regard to the high percentiles of children intake. For the first time, a potential synergism was described relatively to the combined intestinal toxic effects of patulin and ochratoxin A, two known enterotoxins. The obtained results reinforce the importance to use a holistic approach to multiple mycotoxins risk assessment, especially for vulnerable populations as children. Particular attention should be dedicated to evaluate the consequences of intestinal exposure to mycotoxins, in particular to their impact on the development of intestinal diseases; RESUMO: EXPOSIÇÃO DE CRIANÇAS A MÚLTIPLAS MICOTOXINAS ATRAVÉS DO CONSUMO DE ALIMENTOS: UMA ABORDAGEM HOLÍSTICA À AVALIAÇÃO DE RISCO A ingestão de alimentos é considerada a principal via de exposição humana a contaminantes químicos, dos quais se destacam as micotoxinas. Em virtude dos seus efeitos tóxicos e carcinogénicos, é fundamental avaliar a exposição a estes compostos, particularmente em populações vulneráveis, como é o caso das crianças. Nos últimos anos, alguns estudos têm dedicado especial atenção à co-contaminação de alimentos por micotoxinas. No entanto, são ainda escassos os dados disponíveis relativos à exposição das crianças a múltiplas micotoxinas assim como a sua bioacessibilidade e potenciais efeitos tóxicos a nível intestinal. Neste contexto, a presente Tese teve como principais objetivos: caracterizar a exposição das crianças portuguesas (idade inferior a 3 anos) a múltiplas micotoxinas através da alimentação; determinar a bioacessibilidade das micotoxinas nos alimentos habitualmente consumidos pelas crianças; avaliar os efeitos tóxicos intestinais associados à exposição simultânea a micotoxinas; e, caracterizar o risco associado ao consumo de alimentos, coligindo resultados da avaliação da exposição, bioacessibilidade e toxicidade intestinal. A presente Tese desenvolveu pela primeira vez uma abordagem holística, reunindo resultados obtidos através de diferentes metodologias, nomeadamente ferramentas probabilísticas para estimar a ingestão diária de micotoxinas e ensaios in vitro para determinar a bioacessibilidade e efeitos tóxicos. Os principais resultados revelaram, pela primeira vez, que a exposição a aflatoxinas pode representar um risco potencial para as crianças que apresentaram os percentis mais elevados de ingestão. Foram também descritos efeitos sinérgicos inéditos decorrentes da exposição intestinal simultânea a duas enterotoxinas: patulina e ocratoxina A. Os resultados obtidos reforçam a importância da implementação de uma abordagem holística para a avaliação de risco de misturas de micotoxinas, em especial quando envolvidas populações vulneráveis como as crianças. As potenciais consequências da exposição intestinal a micotoxinas deverão ainda ser ponderadas, principalmente no que respeita às implicações no desenvolvimento de doenças intestinais

Enterobacter sakazakii on milk powder formula for children: implementation of the detection method and microbiologic evaluation of samples trade in Lisbon district

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaEnterobacter sakazakii é um bacilo Gram negativo móvel, pertencente à família Enterobacteriaceae; considerado um microrganismo emergente, tem sido recentemente classificado como um perigo severo para populações restritas, podendo causar a morte, sequelas crónicas graves ou estados mórbidos de longa duração. A população de risco é essencialmente o grupo das crianças com idade inferior a 1 ano, apresentando os imunocomprometidos e os recém-nascidos com baixo peso à nascença um risco agravado, cuja taxa de mortalidade apresenta valores compreendidos entre 20 e 80%. As fórmulas infantis em pó têm sido identificadas como o veículo deste agente em algumas situações em que este microrganismo tem sido implicado. Assim, o presente trabalho teve como objectivos a implementação da metodologia de pesquisa do E. sakazakii em fórmulas lácteas em pó, de acordo com a norma ISO/TS 22964:2006, bem como a comparação da eficiência dos meios cromogénicos ESIA, DFI e ChromoCult, na detecção do E. sakazakii, e avaliar, quer a ocorrência de E. sakazakii, quer a qualidade microbiológica, em algumas amostras comercializadas no distrito de Lisboa. Foram analisadas 15 amostras desidratadas, verificando-se que a técnica de detecção apresentou melhores percentagens de recuperação quando foram utilizados os meios DFI e ChromoCult, em comparação com o meio ESIA; não foi detectado E. sakazakii em nenhuma das amostras analisadas. A avaliação da qualidade microbiológica confirma a ideia de que as fórmulas lácteas infantis em pó não são produtos estéreis, dado que todas as amostras apresentaram contagem de microrganismos aeróbios a 30 ºC superiores a 1.0x101 ufc/g, com excepção de 5 amostras que, no entanto, evidenciaram também a presença de outros microrganismos. Apenas 13% das amostras apresentaram contagens de bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae, mas somente quando utilizada a contagem pela técnica do NMP, o que revela níveis de contaminação reduzidos. O único microrganismo patogénico encontrado foi Bacillus cereus, em 40% das amostras, com uma contagem inferior a 1.0x102 ufc/g, sendo que, dos 6 isolados de B. cereus, apenas uma estirpe se revelou produtora de toxina diarreica. Assim, pode concluir-se que, se não forem tomadas as medidas preventivas correctas, a ocorrência de contaminação pode resultar em graves consequências, principalmente para os grupos de risco referidos.ABSTRACT Enterobacter sakazakii is a mobile Gram negative rod, from the Enterobacteriaceae family; an emerging microorganism, recently classified as a serious danger to restricted populations, able to cause death, chronic sequels or prolonged morbid states. The risk population is mainly the group of children with less than 1 year of age, presenting an increased risk those with immune system deficiencies or newborns with under-weight, whose mortality rates stands between 20 and 80%. In some cases, in which this microorganism has been implicated, powder milk formulas seem to be the vehicle. The main goals of this work are the implementation of a research method for E. sakazakii in powder milk formulas, according to the standard ISO/TS 22964:2006, and the comparison of the efficiency of the chromogenic medium ESIA, DFI and ChromoCult, for its detection, as well the evaluation of the occurrence of E. sakazakii and the microbiologic quality of the children milk powder formulas samples available on the market in Lisbon district, through hygiene markers and identification of pathogenic elements. Fifteen dehydrated samples have been analysed, being the DFI and ChromoCult the medium which gave the most reliable results, compared with the ESIA medium. E. sakazakii has not been identified on any of the samples. The evaluation of the microbiologic quality reinforces the idea that children milk powder formulas are not sterile products, since all the samples presented aerobic microorganisms counts above 1.0x101 cfu/g, at 30 ºC, with the exception of five of them, in wich was demonstrated and proven the presence of other microorganisms when searching pathogenic elements; only 13% of the samples presented bacteria from the Enterobacteriaceae family, using the MPN technique, revealing reduced count levels. The only pathogen detected, in 40% of the samples, was Bacillus cereus, with a count less than 1.0x102 cfu/g, with only one of the isolates presenting the ability to produce diarrheagenic toxin. In conclusion, if the appropriated preventive measures are not taken, serious consequences may be produced, especially at the risks groups