Study of virucidal effects of disinfectants against murine norovirus and feline calicivirus, surrogates of human norovirus

Human noroviruses (HuNoV) are amongst the leading causes of acute non-bacterial gastroenteritis in humans and annually constitute a global public health problem involving numerous people with great medical, sanitary and economic consequences. The effects of disinfectants against viruses and more specifically against highly resistant viruses such as HuNoV in the environment are little known and data, sometimes empirically obtained, originate from effects observed with bacteria or enveloped viruses. The aim of this thesis is to evaluate disinfectant effects against HuNoV. Since in vitro culture of HuNoV remains difficult, genetically and morphologically similar viral surrogates, are utilised as indirect tools to obtain data about the virucidal effects of disinfectants. The murine norovirus (MNV) and feline calicivirus (FCV) are two frequently used HuNoV surrogates, for which an in vitro cell culture system and a plaque assay protocol exist. In the first study, the virucidal effect of seven disinfectants was evaluated in suspension tests and in two carriers tests (stainless steel and the latex gloves), using two parameters, the infectious viral titre and the genomic copy number. This first study demonstrated that three disinfectants were able to induce a viral titre reduction of more than three log10 for the two surrogates in all three kinds of tests. The disinfectants were halogen, an oxidizing agent and a mix composed of quaternary ammonium compounds (QAC), an alcohol and an aldehyde. The three disinfectants also showed a significant effect on the genomic copy number of MNV and FCV in all three kinds of tests. In conclusion, this first study demonstrates that the three disinfectants should be considered as disinfectants with likely efficiency against the HuNoV and that their use should be recommended for disinfection of surfaces or materials potentially contaminated by the HuNoV. The use of touchless disinfection technologies is gaining increasing importance due to their automatization (limited reliance on human factors), safe use and beneficial economic impact (staff is available for other work). It has been conclusively demonstrated that the environment and contaminated surfaces of health institutes and food processing industries can be a source of infection and have been involved in HuNoV transmission amongst the population in numerous instances. H2O2 nebulization is a system that aerosolizes a solution, causing it to form liquid droplets in the air. The goal of the second part of this thesis is to evaluate the effect of nebulization on the two main HuNoV surrogates, MNV and FCV, on two different surfaces, i.e. glass and stainless steel, representing the surfaces typically present in field conditions. The H2O2 nebulization was shown to be efficient, mediating a mean viral titre reduction of both surrogates of more than 4 log10, and shouldhenceforth be considered as virucidal. The reductions of genomic copies were relatively low, confirming that this parameter is not an adequate tool for the determination of virucidal efficiency of a system nebulizing H2O2. In order to reduce the risk of contamination and increase the security of consumers, patients and employees, the nebulization of H2O2 should be recommended for use as a disinfection system, complementing conventional disinfection processes in places potentially contaminated by HuNoV. After the evaluation of the effects of several disinfectants against the MNV and the FCV on the viral titre and the genomic copy number, investigation of the effect of disinfectants was continued by exploring the effect of these disinfectants on the binding step of MNV on RAW 264.7 cells. The aim of this third study was to identify whether the binding step, the first step of the viral replicative cycle, was modified after the use of disinfectants on MNV and whether this mechanism explained the virucidal effect observed in the previous studies. Via epifluorescent microscopy analysis and an indirect immunofluorescence assay, viral attachment was not observed after contact of MNV with alcohol (ethanol and isopropanol), H2O2, chlorhexidine, benzylammonium-chloride (BAC), didecyldimethyl-ammoniumchloride (DAC) at a concentration of 0.08 % or glutaraldehyde. Viral attachment was still partially observed after contact of MNV with the sodium hypochlorite or DAC at a concentration of 0.04 %. All tested disinfectants partially or totally inhibit the binding step, probably due a modification or a destruction of the MNV capsid. In conclusion, any disinfectants utilized in a disinfection process should include either a halogen product, oxidizing agents or a mix of QAC with an alcohol and an aldehyde in order to guarantee a virucidal effect against viruses such as the HuNoV. The nebulization of hydrogen peroxide should be employed both preventively and in the course of HuNoV outbreaks in places with HuNoV contamination. Amongst different mechanisms of action of virucidal disinfectants, one mechanism against MNV could be the inhibition of cellular receptor binding via structural modification of the viral capsid.Les norovirus humains (HuNoV) sont une des causes majeures de gastro-entérites aiguës non-bactériennes chez l’homme et constituent un réel problème de santé publique impliquant chaque année et dans le monde entier, de nombreux individus avec des conséquences médicales, sanitaires et économiques importantes. Les effets des désinfectants sur les virus et plus particulièrement sur des virus très résistants dans l’environnement tels que les HuNoV sont assez peu connus. L’objectif de cette thèse est d’évaluer l’effet des désinfectants sur les HuNoV. La culture in vitro de ces derniers étant très difficile et à un stade préliminaire, l’utilisation de virus substituts, proches génétiquement et morphologiquement des HuNoV, est un moyen indirect d’obtenir des informations sur l’effet virucide des désinfectants. Les deux virus substituts des HuNoV, couramment utilisés et pour lesquels un système de culture in vitro et une méthode de détermination des plages de lyse existent, sont le norovirus murin (MNV) et le calicivirus félin (FCV). Dans la première étude, l’effet virucide de sept désinfectants a été évalué au niveau de deux paramètres, le titre viral infectieux et le nombre de copies génomiques, dans des tests en suspension et dans deux tests sur support (l’acier inoxydable et le latex de gants). Cette première étude a permis de démontrer que trois classes de désinfectants permettaient d’obtenir une réduction de plus de trois log10 du titre viral des deux virus substituts dans les trois types de tests évalués : les désinfectants composés soit d’un halogéné, soit d’agents oxydants soit d’un mélange d’ammoniums quaternaires (QAC) avec un alcool et un aldéhyde. Ces trois désinfectants ont aussi montré un effet significatif sur le nombre de copies génomiques des deux virus substituts dans les trois types de tests. Le résultat de cette première étude démontre qu’un halogéné, des agents oxydants et un mélange de QAC, d’alcool et d’aldéhyde sont des désinfectants efficaces sur deux virus substituts des HuNoV et leur utilisation est donc recommandée pour la désinfection de surfaces ou de matériels potentiellement contaminés par les HuNoV. L’utilisation de technologies de désinfection par voie aérienne est en plein essor, du fait de leur automatisation (l’erreur due au facteur humain est limitée), de la sécurité d’utilisation et de son gain économique (le personnel est disponible pour d’autres tâches). De plus, l’environnement et les surfaces contaminées des établissements de santé, des industries de production et detransformation (où des denrées alimentaires sont manipulées) sont une source d’infection et participent à la transmission des HuNoV au sein de la population humaine. La nébulisation de H2O2 est un système répartissant une solution de H2O2 sous forme de gouttelettes dans l’air et le but de cette deuxième partie est d’évaluer l’effet de la nébulisation sur les deux principaux virus substituts des HuNoV, MNV et FCV, sur deux types de surface, le verre et l’acier inoxydable, représentatives de surfaces rencontrées dans les conditions de terrain. La nébulisation est efficace et peut être considéré comme virucide puisque la réduction moyenne du titre viral des deux virus substituts est supérieure à 4 log10. Les réductions des nombres de copies génomiques ont été relativement peu importantes et confirment donc que ce paramètre n’est pas un outil adéquat dans la détermination de l’efficacité virucide d’un désinfectant à base de peroxyde d’hydrogène. La nébulisation de H2O2 devrait être fréquemment recommandée et utilisée comme moyen de désinfection, de manière complémentaire à une désinfection conventionnelle dans les lieux potentiellement contaminés par les HuNoV afin de réduire le risque de contamination et d’augmenter la sécurité des consommateurs, des patients et des employés. Après l’évaluation des effets de plusieurs désinfectants sur le MNV et le FCV au niveau du titre viral et du nombre de copies génomiques, l’investigation de l’effet des désinfectants s’est poursuivie en explorant l’effet de ces substances sur la phase d’attachement du MNV aux cellules RAW 264.7. L’objectif de cette troisième étude était d’identifier si la phase d’attachement, première étape du cycle viral, était modifiée après utilisation de désinfectants sur le MNV et si ce mécanisme d’action expliquait l’effet virucide constaté dans les études précédentes. Via une observation par microscopie en florescence et un immunomarquage indirect, l’attachement du virus n’était plus observé après contact entre le MNV et des alcools (éthanol et isopropanol), du peroxyde d’hydrogène, de la chlorhexidine, du chlorure de benzalkonium (BAC), du chlorure de didécyldiméthylammonium (DAC) 0,08 %, ou du glutaraldéhyde. L’attachement viral est encore partiellement observé après contact entre le MNV et l’hypochlorite de sodium ou le DAC 0,04 %. Tous les désinfectants testés inhibent donc partiellement ou totalement la phase d’attachement, probablement suite à une modification ou une destruction de la capside de MNV. En conclusion, il est recommandé que les désinfectants utilisés dans des procédés de désinfection conventionnelle contiennent soit un produit halogéné, soit des agents oxydants soit un mélange de QAC, d’alcool et d’aldéhyde afin de garantir un effet virucide sur des virus tels que les HuNoV. La nébulisation de peroxyde d’hydrogène devrait être promue et proposée dans les établissements sujets aux contaminations par les HuNoV, de manière préventive ou pour enrayer une épidémie à NoV. La modification de la phase d’attachement du MNV semble être un des mécanismes d’action des virucides suggérant une altération de la conformation de la capside virale

Axonal domains:role for paranodal junction in node of Ranvier assembly

SummaryA new study shows that communication between axons and glia at the paranodal junction can orchestrate the formation of the node of Ranvier

Open Babel: An open chemical toolbox

Background: A frequent problem in computational modeling is the interconversion of chemical structures between different formats. While standard interchange formats exist (for example, Chemical Markup Language) and de facto standards have arisen (for example, SMILES format), the need to interconvert formats is a continuing problem due to the multitude of different application areas for chemistry data, differences in the data stored by different formats (0D versus 3D, for example), and competition between software along with a lack of vendorneutral formats. Results: We discuss, for the first time, Open Babel, an open-source chemical toolbox that speaks the many languages of chemical data. Open Babel version 2.3 interconverts over 110 formats. The need to represent such a wide variety of chemical and molecular data requires a library that implements a wide range of cheminformatics algorithms, from partial charge assignment and aromaticity detection, to bond order perception and canonicalization. We detail the implementation of Open Babel, describe key advances in the 2.3 release, and outline a variety of uses both in terms of software products and scientific research, including applications far beyond simple format interconversion. Conclusions: Open Babel presents a solution to the proliferation of multiple chemical file formats. In addition, it provides a variety of useful utilities from conformer searching and 2D depiction, to filtering, batch conversion, and substructure and similarity searching. For developers, it can be used as a programming library to handle chemical data in areas such as organic chemistry, drug design, materials science, and computational chemistry. It is freely available under an open-source license fro

Mortality and pulmonary complications in patients undergoing surgery with perioperative SARS-CoV-2 infection: an international cohort study

Background: The impact of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) on postoperative recovery needs to be understood to inform clinical decision making during and after the COVID-19 pandemic. This study reports 30-day mortality and pulmonary complication rates in patients with perioperative SARS-CoV-2 infection. Methods: This international, multicentre, cohort study at 235 hospitals in 24 countries included all patients undergoing surgery who had SARS-CoV-2 infection confirmed within 7 days before or 30 days after surgery. The primary outcome measure was 30-day postoperative mortality and was assessed in all enrolled patients. The main secondary outcome measure was pulmonary complications, defined as pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or unexpected postoperative ventilation. Findings: This analysis includes 1128 patients who had surgery between Jan 1 and March 31, 2020, of whom 835 (74·0%) had emergency surgery and 280 (24·8%) had elective surgery. SARS-CoV-2 infection was confirmed preoperatively in 294 (26·1%) patients. 30-day mortality was 23·8% (268 of 1128). Pulmonary complications occurred in 577 (51·2%) of 1128 patients; 30-day mortality in these patients was 38·0% (219 of 577), accounting for 81·7% (219 of 268) of all deaths. In adjusted analyses, 30-day mortality was associated with male sex (odds ratio 1·75 [95% CI 1·28–2·40], p\textless0·0001), age 70 years or older versus younger than 70 years (2·30 [1·65–3·22], p\textless0·0001), American Society of Anesthesiologists grades 3–5 versus grades 1–2 (2·35 [1·57–3·53], p\textless0·0001), malignant versus benign or obstetric diagnosis (1·55 [1·01–2·39], p=0·046), emergency versus elective surgery (1·67 [1·06–2·63], p=0·026), and major versus minor surgery (1·52 [1·01–2·31], p=0·047). Interpretation: Postoperative pulmonary complications occur in half of patients with perioperative SARS-CoV-2 infection and are associated with high mortality. Thresholds for surgery during the COVID-19 pandemic should be higher than during normal practice, particularly in men aged 70 years and older. Consideration should be given for postponing non-urgent procedures and promoting non-operative treatment to delay or avoid the need for surgery. Funding: National Institute for Health Research (NIHR), Association of Coloproctology of Great Britain and Ireland, Bowel and Cancer Research, Bowel Disease Research Foundation, Association of Upper Gastrointestinal Surgeons, British Association of Surgical Oncology, British Gynaecological Cancer Society, European Society of Coloproctology, NIHR Academy, Sarcoma UK, Vascular Society for Great Britain and Ireland, and Yorkshire Cancer Research

Comparative virucidal efficacy of seven disinfectants against murine norovirus and feline calicivirus, surrogates of human norovirus

Human noroviruses (HuNoV) are the leading cause of acute nonbacterial gastroenteritis in humans and can be transmitted either by person-to-person contact or by consumption of contaminated food. Knowledge of an efficient disinfection for both hands and food contact surfaces is helpful for the food sector and provides precious information for public health. The aim of this study was to evaluate the effect of seven disinfectants belonging to different groups of biocides (alcohol, halogen, oxidizing agents, quaternary ammonium compounds, aldehyde and biguanide) on infectious viral titre and on genomic copy number. Due to the absence of a cell culture system for HuNoV, two HuNoV surrogates such as murine norovirus (MNV) and feline calicivirus (FCV), were used and the tests were performed in suspension, on gloves and on stainless steel discs. When, as criteria of efficacy, a log reduction > 3 of the infectious viral titre on both surrogates and in the three tests is used, the most efficacious disinfectants in this study appear to be biocidal products B, C and D, representing the halogens, the oxidizing agents group and a mix of QAC, alcohol and aldehyde, respectively. In addition, these three disinfectants also elicited a significant effect on genomic copy number for both surrogate viruses and in all three tests. The results of this study demonstrate that a halogen compound, oxidizing agents and a mix of QAC, alcohol and aldehyde are advisable for HuNoV disinfection of either potentially contaminated surfaces or materials in contact with foodstuffs

Effect of biocides on murine norovirus and feline calicivirus, surrogates of human norovirus, in suspension, glove and stainless steel disc tests

Human noroviruses (HuNoV) are one of the major agents of human gastroenteritis and transmission occurs mainly by the faecal-oral route. The purpose of this work was to test biocide products on surrogate viruses of HuNoV in order to get information on the residual viral infectivity and on the integrity of viral genomes after biocide treatment in various conditions. Murine norovirus (MNN) and feline calicivirus (FCV) have been chosen as HuNoV surrogates because presenting comparable structure and physico-chemical properties. Two biocide products have been chosen, Ethanol (70%) and Kenocid 2100® (Peracetic acid and hydrogen peroxide) and used in 3 different conditions (in suspension, on gloves and on stainless steel discs). The biocide product was tested according to Afnor norm EN 14476. The reduction of viral titre was inferred and RNA extraction followed by a 1 step RT-qPCR was performed. If biocides products tested are able to show a 4 log reduction of the viral infectious titre, they are considered as effective. Efficacy against HuNoV can be extrapolated from these results. MNV is sensitive to Ethanol and Kenocid 2100® with and without any effect on genomic copy numbers respectively. FCV is sensitive to Kenocid 2100® with an effect on genomic copy numbers but is resistant to EtOH. The absence of effect of Kenocid 2100® on genomic copy numbers of MNV indicates this biocide product does not interfere directly on the viral genome. It may likely act on the viral structure, the capsid for example. This project is financed by Federal Public Service, Health, Food Chain Safety and Environment, in Belgium (RT 10/6 TRAVIFOOD)

Molecular detection of HAV by a new one step real time RT-PCR

Introduction and objectives Hepatitis A virus (HAV) is a RNA virus with a single-stranded positive sense genome and the only species of the genus Hepatovirus of the Picornaviridae family. Belgium and European countries in general, are countries with a low prevalence and the majority of adults can be infected. HAV is mainly transmitted by the fecal-oral route and even if foodborne outbreaks account for less than 5 % of the reported cases per year, the source of infection cannot be identified in 50 % of the reported cases. Therefore the contribution of foodborne infection is probably underestimated. Viral loads in food samples are lower than in clinical samples and their detection requires refined molecular detection methods. Methods A one step real-time RT-PCR to detect HAV, with new primers (HAV F2 and HAV R2) and probe (HAV P2) was performed directly on HAV diluted suspensions and on food samples (dates) and was compared with a ready-to-use commercial kit. Before the one step real time RT-PCR, a preliminary step combining concentration of viral particles with polyethyleneglycol and centrifugation was used on food samples. Results Real time RT-PCR one step with HAV F2/R2/P2 is more efficient but less sensitive than the commercial kit. It could be used to confirm a positive sample or to detect HAV in an unknown sample. With cell cultured HAV, the limit of detection (LOD) is 1.25 infectious particles in volume tested by RT-PCR or 102 TCID50/ml. In food samples, LOD is between 25 infectious particles and 250 infectious particles in volume tested by RT-PCR or between 104 and 105 TCID50/ml. Several hypotheses could explain these results: the loss of viral particles during the extraction process, the low efficiency of RNA extraction and interference of food on molecular detection. Conclusion Molecular detection of virus in food samples remains a challenge and the protocol of extraction should be improved and adapted at each food category to increase the sensitivity of detection in food matrices characterized by a low viral contamination.Travifoo

Optimalisation d’une RT-PCR en temps réel pour la détection du virus de l’hépatite A

En Belgique, l’incidence de l’hépatite A (HAV) est de 1,2 cas pour 100000 habitants. La population présente une faible immunité contre le HAV puisque seulement 50 % de la population possèdent des anticorps anti-HAV après l’âge de 30 ans. Ainsi un grand nombre d’individus reste susceptible de contracter une infection par le HAV. Les sources de contamination sont principalement le contact de personne à personne mais aussi la consommation d’aliments (crus ou « ready-to-eat) contaminés. Cette contamination peut provenir de l’eau d’irrigation pour les fruits et légumes, de l’eau de mer pour les mollusques bivalves ou de la manipulation de l’homme lors des différentes étapes entre la récolte et la vente du produit. Dans ce projet, une nouvelle RT-PCR spécifique pour la détection du HAV est développée et évaluée. Pour choisir de nouvelles amorces et sondes, des alignements sont réalisés avec les séquences de 19 souches de HAV (DNASTAR Lasergene) afin de cibler les régions les plus conservées du génome du HAV. Cinq nouveaux couples d’amorces ciblant plusieurs régions hautement conservées du génome de HAV ont été sélectionnés et testés à différentes températures d’hybridation et différentes concentrations en utilisant un agent se liant à l’ADN double brin (SYBR Green). Une sonde fluorescente, de type FAM, spécifique de l’amplicon délimité par le couple d’amorces fournissant les meilleurs résultats a été dessinée et utilisée avec la technologie d’hydrolyse de sonde à deux concentrations différentes. Des dilutions d’un facteur 10 de la suspension de la souche HM175 (HAV) ont été testées par le couple d’amorces et la sonde choisit pour établir ainsi une limite de détection. La spécificité du couple d’amorce choisit a été testé en présence de différents picornavirus et virus entériques et de 3 génotypes de HAV (IA, IB et IIIA). Le plasmide Sybricon019 et ses amorces spécifiques ont été utilisés comme contrôle interne d’amplification (IAC). Un contrôle positif a aussi été créé afin de s’assurer du fonctionnement correct de la PCR en temps réel. Parmi les 5 couples d’amorces sélectionnés, le couple HAV-F2/HAV-R2 permet d’obtenir les valeurs de Ct les plus faibles avec une concentration optimale de 300nM pour les amorces sens et anti-sens. Ce couple d’amorces cible la région VP1/VP3 du génome du HAV. Différentes températures d’hybridation ont été testées et la température la plus élevée (60°C) a été sélectionnée pour limiter le risque d’amplification aspécifique. Pour augmenter la spécificité, une sonde, HAV P2, spécifique de l’amplicon délimité par les amorces HAV-F2 et HAV-R2, est utilisée à la concentration de 250nM. Des dilutions d’un facteur 10 d’une suspension de HAV, 107 à 101 particules infectieuses par ml (déterminées par TCID50), donnent respectivement des valeurs de Ct de 19,2 à 38,4 et les dilutions de 100 à 10-2 particules infectieuses par ml ne donnent aucune amplification. La limite de détection est donc de 10 particules infectieuses par ml. La spécificité des amorces et de la sonde pour la détection du HAV est correcte puisque les trois génotypes de HAV, IA, IB et IIIA, ont été détectés alors que les différents picornavirus et virus entériques n’ont donné aucun signal fluorescent d’amplification. L’optimalisation d’un nouveau couple d’amorce et d’une sonde (HAV-F2, -R2 et -P2) ciblant une région hautement conservée du génome permet de détecter le virus HAV par RT-PCR. La région ciblée (VP1/VP3) diffère de la plupart des méthodes de détection de HAV par PCR en temps réelle décrites à ce jour. La seconde étape consiste à réaliser une série de tests dans différentes matrices alimentaires à risque (fruits de mer, fruits et légumes crus) dans le but de détecter des échantillons naturellement contaminés par le HAV.Travifoo