Adição de produtos químicos e ensaios de electro-coagulação e electro-oxidação para o (pré) tratamento das águas residuais provenientes dos lagares de produção de azeite

Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia do Ambiente, Perfil SanitáriaO presente trabalho engloba uma caracterização do sector do azeite, a nível mundial e em Portugal. As águas ruças, efluente líquido da indústria de produção de azeite, são um problema ambiental relevante, uma vez que, as características que apresentam inviabilizam o seu tratamento, através de muitos dos processos convencionais, até níveis que permitam uma descarga directa no meio hídrico ou em Colector Municipal. Relativamente às questões ambientais e os efluentes/resíduos produzidos no sector de produção de azeite, particularmente as águas ruças, foi efectuada uma abordagem aos diferentes processos de extracção de azeite existentes e a sua contribuição para a quantidade/qualidade dos efluentes líquidos e resíduos produzidos. Foram referidas diferentes tecnologias de tratamento e estudos que foram encontrados na pesquisa bibliográfica efectuada, bem como uma caracterização das águas ruças, de uma forma geral, no que respeita aos principais parâmetros. Com o intuito de avaliar o pré-tratamento de águas ruças, foram realizados diversos ensaios físicoquímicos,bem como ensaios com aplicação das tecnologias de electro-coagulação e electro-oxidação avançada. Dos produtos químicos testados, no que respeita aos ensaios físico-químicos, o que demonstrou um melhor desempenho foi o cloreto férrico (em conjunto com o floculante Albafloc 2152 e peróxido de hidrogénio), tendo-se conseguido obter percentagens de redução de CQO, CBO5 e SST, por exemplo,de 60, 88 e 87%, respectivamente. Os melhores resultados dos ensaios realizados foram obtidos com os ensaios de electro-coagulação e electro-oxidação avançada,com percentagens de redução dos parâmetros CQO, CBO5 e SST, de 89,95 e 94%, respectivamente. Nestes ensaios, os valores de concentração dos vários parâmetros analisados foram inferiores aos normalmente exigidos pelos Regulamentos de Descarga de Águas Residuais em Colector Municipal

Regulação por microRNAs das isoformas de mRNA do MCL1 produzidas por poliadenilação alternativa em linfócitos T humanos

Mestrado em Biologia Molecular e CelularPolyadenylation is a fundamental processing step of mRNA maturation, essential for its export, stability and translation. Bioinformatic analyses have shown that 70% of human genes have several polyadenylation signals (pA signals) in the 3’untranslated region (3’UTR) that are used to produce multiple mRNA isoforms by alternative polyadenylation (APA). This process has a fundamental role in gene expression in a variety of cellular programs as well as in non-pathological conditions and diseases. When it occurs in the 3’UTR, APA gives rise to transcripts with different 3’UTR lengths. MicroRNAs (miRNAs) and RNA-binding proteins (RBPs) often bind to sequences present in that region and thus mRNA isoforms with longer 3’UTRs have more sites where these regulators can bind, being more prone to regulation. miRNAs are 23 nucleotides in length post-transcriptional regulators of gene expression that have been implicated in a variety of cell conditions. In the immune system, it has been shown that upon T cell activation there is a global switch in pA signal selection from a distal to a proximal pA signal, originating mRNAs with shorter 3’UTRs and, consequently, with less miRNAs and RBPs target sites. The MCL1 (Myeloid Cell Leukemia Sequence 1) gene encodes an anti-apoptotic protein (Mcl-1), which is a member of the Bcl-2 (B cell lymphoma-2) family of apoptosis regulators. MCL1 is essential for development and maintenance of both B and T lymphocytes in animals. It has been demonstrated that MCL1 is highly regulated at both transcriptional and post-transcriptional levels. The aims of our study were to characterize the pattern of MCL1 APA and to unravel the role of miRNAs in the regulation of MCL1 APA-derived isoforms. We discovered that MCL1 produces four mRNA isoforms by the usage of four canonical pA signals located in the 3’UTR and that these pA signals are highly conserved in mammals. We verified that the longest mRNA isoform is regulated at a post-transcriptional level in activated PBMCs. We also demonstrated that the shortest 3’UTRs give rise to higher amounts of luciferase activity than the longest mRNA. Additionally, we showed that Mcl-1 protein levels increase upon PBMCs activation. This suggests that during PBMCs activation the increase in Mcl-1 protein is due to the translation of the shortest isoforms. In the second part of this study we identified miRNA-17 as a putative regulator of the longest isoform upon T cell activation. The expression of this miRNA increased upon activation of T cells and when we mutated its putative-binding site on MCL1 3’UTR we observed an increase in luciferase activity in HeLa cells. We also overexpressed miRNA-17, miRNA-29b and miRNA-92a and showed that this causes a decrease in endogenous Mcl-1 expression. From this study we conclude that the MCL1 longest APA-derived isoform is down-regulated at a post-transcriptional level upon T cell activation in order to increase Mcl-1 expression and that miRNA-17 may be the key regulator in this mechanism.A poliadenilação é um passo de processamento fundamental da maturação do mRNA, essencial para o seu transporte, estabilidade e tradução. Análises bioinformáticas têm demonstrado que cerca de 70% dos genes humanos têm vários sinais de poliadenilação na região 3’ não traduzida (3’UTR). Estes sinais são usados para produzir várias isoformas de mRNA por poliadenilação alternativa (APA), um processo com um papel fundamental na expressão génica em programas celulares bem como em condições patológicas e não patológicas. Quando ocorre na região 3’ não traduzida, a APA dá origem a transcritos com diferentes tamanhos da 3’UTR. Os microRNAs (miRNAs) e as proteínas que se ligam ao RNA (RBPs) ligam-se frequentemente a sequências presentes nesta região e portanto isoformas de mRNA com 3’UTRs mais longas contêm mais locais onde estes reguladores se podem ligar e, por isso, estão mais sujeitos a regulação. Os miRNAs são reguladores pós-transcricionais da expressão génica com cerca de 23 nucleótidos, que têm sido envolvidos numa variedade de condições celulares. No sistema imune, tem sido demonstrado que após activação dos linfócitos T passa a haver uma maior seleção dos sinais de poliadenilação proximais em vez dos distais, originando mRNAs com 3’UTRs mais curtas e consequentemente com menos locais onde se possam ligar miRNAs e RBPs. O gene MCL1 (Myeloid Cell Leukemia Sequence 1) codifica uma proteína (Mcl-1) com função anti-apoptótica essencial para o desenvolvimento e manutenção dos linfócitos T em animais, que faz parte da família proteica da Bcl-2, uma família de reguladores da apoptose. Tem sido demonstrado que o MCL1 é altamente regulado tanto ao nível transcricional como pós-transcricional. Os objetivos do nosso estudo são determinar o padrão de APA que ocorre no MCL1 em linfócitos T humanos e caracterizar o papel dos miRNAs na regulação das isoformas de mRNA do MCL1 produzidas por APA. Verificamos que o MCL1 produz quatro isoformas de mRNA pelo uso de quatro sinais de poliadenilação canónicos localizados na 3’UTR e que esses sinais são altamente conservados nos mamíferos. Observamos que a isoforma de mRNA mais longa é regulada ao nível pós-transcricional nos PBMCs ativados. Nos nossos resultados demonstramos também que as 3’UTR mais curtas dão origem a uma maior actividade de luciferase do que o mRNA mais longo. Isto sugere que durante a ativação dos PBMCs o aumento na proteína Mcl-1 é devida à tradução das isoformas mais curtas. Na segunda parte do estudo identificamos o miRNA-17 como um possível regulador da isoforma longa após ativação dos linfócitos T. A expressão deste miRNA está aumentada após ativação dos linfócitos T e quando é mutado o seu local de ligação ao mRNA putativo na 3’UTR do MCL1 observou-se um aumento na atividade da Luciferase na linha celular HeLa. Também realizamos a sobreexpressão do miRNA-17, do miRNA-29b e do miRNA-92a o que levou a uma diminuição na expressão endógena do Mcl-1. A partir deste estudo concluímos que a isoforma do MCL1 gerada por APA mais longa é regulada negativamente ao nível pós-transcricional após ativação celular de modo a aumentar a expressão do Mcl-1 e que o miRNA-17 poderá ser o regulador chave deste mecanismo

RNA binding protein Caprin-2 is a pivotal regulator of the central osmotic defense response

In response to an osmotic challenge, the synthesis of the antidiuretic hormone arginine vasopressin (AVP) increases in the hypothalamus, and this is accompanied by extension of the 3′ poly(A) tail of the AVP mRNA, and the up-regulation of the expression of RNA binding protein Caprin-2. Here we show that Caprin-2 binds to AVP mRNAs, and that lentiviral mediated shRNA knockdown of Caprin-2 in the osmotically stimulated hypothalamus shortens the AVP mRNA poly(A) tail at the same time as reducing transcript abundance. In a recapitulated in vitro system, we confirm that Caprin-2 over-expression enhances AVP mRNA abundance and poly(A) tail length. Importantly, we show that Caprin-2 knockdown in the hypothalamus decreases urine output and fluid intake, and increases urine osmolality, urine sodium concentration, and plasma AVP levels. Thus Caprin-2 controls physiological mechanisms that are essential for the body's response to osmotic stress. DOI: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.09656.00

PIDDosome-induced p53-dependent ploidy restriction facilitates hepatocarcinogenesis

Polyploidization frequently precedes tumorigenesis but also occurs during normal development in several tissues. Hepatocyte ploidy is controlled by the PIDDosome during development and regeneration. This multi-protein complex is activated by supernumerary centrosomes to induce p53 and restrict proliferation of polyploid cells, otherwise prone for chromosomal instability. PIDDosome deficiency in the liver results in drastically increased polyploidy. To investigate PIDDosome-induced p53-activation in the pathogenesis of liver cancer, we chemically induced hepatocellular carcinoma (HCC) in mice. Strikingly, PIDDosome deficiency reduced tumor number and burden, despite the inability to activate p53 in polyploid cells. Liver tumors arise primarily from cells with low ploidy, indicating an intrinsic pro-tumorigenic effect of PIDDosome-mediated ploidy restriction. These data suggest that hyperpolyploidization caused by PIDDosome deficiency protects from HCC. Moreover, high tumor cell density, as a surrogate marker of low ploidy, predicts poor survival of HCC patients receiving liver transplantation. Together, we show that the PIDDosome is a potential therapeutic target to manipulate hepatocyte polyploidization for HCC prevention and that tumor cell density may serve as a novel prognostic marker for recurrence-free survival in HCC patients

Untranslated parts of genes interpreted: making heads or tails of high-throughput transcriptomic data via computational methods

The fate of eukaryotic transcripts is closely linked to their untranslated regions, which are determined by where transcription starts and ends on a genomic locus. The extent of alternative transcription start and alternative poly-adenylation has been revealed by sequencing methods focused on the ends of transcripts, but the application of these methods is not yet widely adopted by the community. In this review we highlight the importance of defining the untranslated parts of transcripts and suggest that computational methods applied to standard high-throughput technologies are a useful alternative to the expertise-demanding 5’ and 3’ sequencing. We present a number of computational approaches for the discovery and quantification of alternative transcription start and poly-adenylation events, focusing on technical challenges and arguing for the need to include better normalization of the data and more appropriate statistical models of the expected variation in the signal

PIDDosome-induced p53-dependent ploidy restriction facilitates hepatocarcinogenesis

Polyploidization frequently precedes tumorigenesis but also occurs during normal development in several tissues. Hepatocyte ploidy is controlled by the PIDDosome during development and regeneration. This multi-protein complex is activated by supernumerary centrosomes to induce p53 and restrict proliferation of polyploid cells, otherwise prone for chromosomal instability. PIDDosome deficiency in the liver results in drastically increased polyploidy. To investigate PIDDosome-induced p53-activation in the pathogenesis of liver cancer, we chemically induced hepatocellular carcinoma (HCC) in mice. Strikingly, PIDDosome deficiency reduced tumor number and burden, despite the inability to activate p53 in polyploid cells. Liver tumors arise primarily from cells with low ploidy, indicating an intrinsic pro-tumorigenic effect of PIDDosome-mediated ploidy restriction. These data suggest that hyperpolyploidization caused by PIDDosome deficiency protects from HCC. Moreover, high tumor cell density, as a surrogate marker of low ploidy, predicts poor survival of HCC patients receiving liver transplantation. Together, we show that the PIDDosome is a potential therapeutic target to manipulate hepatocyte polyploidization for HCC prevention and that tumor cell density may serve as a novel prognostic marker for recurrence-free survival in HCC patients