Optimization of bioselective membrane of amperometric enzyme sensor on basis of glucose oxidase using NH2-modified multi-wall carbone nanotubes

Aim. To investigate a possibility of application of multi-wall carbone nanotubes modified with NH2-groups (MWCNT-NH2) for creation of sensitive elements of the amperometric biosensor based on immobilized oxidoreductases, in particular, glucose oxidase (GOD). To study electrochemical properties of the membranes obtained. Methods. Experiments were carried out with amperometric methods using the μStat 200 device («DropSens», Spain). The enzymes were immobilised in glutaraldehyde vapour. Results. The method of formation of bioselective matrix based on immobilised GOD with MNP-NH2 on the surface of gold amperometric electrodes was optimised. Optimal working conditions of the biosensor developed were determined. Conclusion. MWCNT integration into a bioselective matrix improves the biosensor analytical characteristics which means: higher signal value, wider linear range of glucose analysis, and possibility of substrate determination in wide range of working potential.Мета. Дослідити можливість застосування багатошарових карбонових нанотрубок, модифікованих аміногрупами (БНТ-NH2), для створення чутливих елементів амперометричного біосенсора на основі іммобілізованих оксидоредуктаз, зокрема глюкозооксидази (ГОД), та вивчити електрохімічні властивості отриманих мембран. Методи. Експерименти проведено з використанням амперометричних методів за допомогою приладу μStat 200 («DropSens», Іспанія). Ферменти іммобілізували у випарах глутарового альдегіду. Результати. Оптимізовано метод формування біоселективної матриці біосенсора на основі іммобілізованої ГОД з БНТ-NH2 на поверхні золотих амперометричних електродів. Визначено оптимальні умови роботи біосенсора на ії основі. Висновки. Показано, що включення БНТ до біоселективної матриці біосенсора покращує його аналітичні характеристики: сприяє підвищенню величини сигналу та розширенню лінійного діапазону для встановлення рівня глюкози, дає можливість визначати субстрат у широких межах значень робочого потенціалу).Цель. Исследовать возможность использования мультистеночных карбоновых нанотрубок, модифицированных аминогруппами (МНТ-NH2), для создания чувствительного элемента амперометрического биосенсора на основе иммобилизованных оксидоредуктаз, в частности глюкозооксидазы (ГОД), и изучить электрохимические свойства полученных мембран. Методы. Эксперименты проводили с использованием амперометрических методов с помощью прибора μStat 200 («DropSens», Испания). Ферменты иммобилизовали в парах глутарового альдегида. Результаты. Оптимизирован метод формирования биоселективной матрицы биосенсора на основе иммобилизованной ГОД с МНТ-NH2 на поверхности золотых амперометрических электродов. Определены оптимальные условия функционирования биосенсора на ее основе. Выводы. Показано, что вкючение МНТ в состав биоселективной матрицы биосенсора улучшает его аналитические характеристики: способствует увеличению величины сигнала и расширению линейного диапазона для нахождения уровня глюкозы, дает возможность определять субстрат в широких границах значений рабочего потенциала)

Biosensors. A quarter of a century of R&D experience

The paper is a review of the researches of Biomolecular Electronics Laboratory concerning the development of biosensors based on electrochemical transducers (amperometric and conductometric electrodes, potentiometric pH-sensitive field effect transistors) and different biorecognition molecules (enzymes, cells, antibodies), biomimics (molecularly imprinted polymers), as sensitive elements for direct analysis of substrates or inhibitory analysis of toxicants. Highly specific, sensitive, simple, fast and cheap detection of different substances renders them as promising tools for needs of health care, environmental control, biotechnology, agriculture and food industries. Diverse biosensor formats for direct determination of different analytes and inhibitory enzyme analysis of a number of toxins have been designed and developed. Improvement of their analytical characteristics may be achieved by using differential mode of measurement, negatively or positively charged additional semipermeable membranes, nanomaterials of different origin, genetically modified enzymes. These approaches have been aimed at increasing the sensitivity, selectivity and stability of the biosensors and extending their dynamic ranges. During the last 25 years more than 50 laboratory prototypes of biosensor systems based on mono- and multibiosensors for direct determination of a variety of metabolites and inhibitory analysis of different toxic substances were created. Some of them were tested in real samples analysis. The advantages and disadvantages of the biosensors developed are discussed. The possibility of their practical application is considered.Представлено огляд виконаних у лабораторії біомолекулярної электроніки досліджень в області розробки біосенсорів на основі електрохімічних перетворювачів (амперо- і кондуктометричні електроди, потеціометричні рН-чутливі польові транзистори) і різних біорозпізнавальних молекул (ферменти, клітини, антитіла), біоміміків або синтетичних мембран, включаючи матричні полімери, як чутливих елементів для прямого аналізу субстратів або інгібіторного аналізу токсинів. Завдяки високій специфічності і чутливості, простоті та низькій вартості визначення різних речовин біосенсори є перспективними приладами для потреб охорони здоров’я, контролю довкілля, біотехнології, сільського господарства і харчової промисловості. Розроблено й досліджено біосенсори для прямого визначення низки аналітів та інгібіторного аналізу різних токсичних речовин. Поліпшення їхніх аналітичних характеристик можна досягти за рахунок застосування диференційного режиму вимірювань, негативно або позитивно заряджених допоміжних напівпроникних мембран, наноматеріалів різного походження, генетично модифікованих ферментів тощо. Використання цих підходів зробить можливим підвищити чутливість, селективність і стабільність біосенсорів, а також розширити динамічний діапазон вимірювань. Упродовж останніх 25 років виготовлено більш як 50 лабораторних прототипів біосенсорних систем на основі моно- і мультибіосенсорів для прямого визначення різноманітних метаболітів та інгібіторного аналізу токсикантів. Деякі з них випробувано за умов аналізу реальних зразків. В огляді обговорено переваги і недоліки розроблених біосенсорів та розглянуто можливості їхнього практичного застосування.Представлен обзор выполненных в лаборатории биомолекулярной электроники исследований в области разработки биосенсоров на основе электрохимических преобразователей (амперо- и кондуктометрические электроды, потециометрические рН-чувствительные полевые транзисторы) и различных биораспознающих молекул (ферменты, клетки, антитела), биомимиков или синтетических мембран, в том числе матричных полимеров, в качестве чувствительных элементов для прямого анализа субстратов или ингибиторного анализа токсинов. Благодаря высокой специфичности и чувствительности, простоте и дешевизне оп- ределения различных веществ биосенсоры представляют собой перспективный инструментарий для потребностей здравоохранения, контроля окружающей среды, биотехнологии, сельского хозяйства и пищевой промышленности. Разработаны и исследованы биосенсоры для прямого определения ряда аналитов и ингибиторного ферментного анализа различных токсичных веществ. Улучшения их аналитических характеристик можно достичь за счет применения дифференциального режима измерений, негативно или позитивно заряженных дополнительных полупроницаемых мембран, наноматериалов разного происхождения, генетически модифицированных ферментов и др. Эти подходы дают возможность повысить чувствительность, селективность и стабильность биосенсоров, расширить их динамический диапазон измерений. В течение последних 25 лет изготовлено более 50 лабораторных прототипов биосенсорных систем на основе моно- и мультибиосенсоров для прямого определения разнообразных ме- таболитов и ингибиторного анализа различных токсикантов. Некоторые из них исследованы в условиях анализа реальных об- разцов. В обзоре обсуждаются достоинства и недостатки разра- ботанных биосенсоров. Рассматривается возможность их прак- тического использования

Ion-Sensitive Field-Effect Transistor for Biological Sensing

In recent years there has been great progress in applying FET-type biosensors for highly sensitive biological detection. Among them, the ISFET (ion-sensitive field-effect transistor) is one of the most intriguing approaches in electrical biosensing technology. Here, we review some of the main advances in this field over the past few years, explore its application prospects, and discuss the main issues, approaches, and challenges, with the aim of stimulating a broader interest in developing ISFET-based biosensors and extending their applications for reliable and sensitive analysis of various biomolecules such as DNA, proteins, enzymes, and cells

3D-nanostructured scaffold electrodes based on single-walled carbon nanotubes and nanodiamonds for high performance biosensors

International audienc

НАПРУЖЕНО-ДЕФОРМОВАНИЙ СТАН ҐРУНТУ ПРИ ДИНАМІЧНІЙ ДІЇ НА НЬОГО ПАДАЮЧОГО З ВИСОТИ ВАНТАЖУ

The dynamic problem of forming stress fields and residual deformations by the action of falling load on the soil mass with consideration for real properties and influence of free-field surface is resulted.Приведена динамическая задача формирования полей напряжений и остаточных деформаций при влиянии на массив грунта падающего груза с учетом реальных свойств и влияния свободной поверхности.Наведена динамічна задача формування полів напружень і залишкових деформацій при впливі на масив грунту падаючого вантажу з урахуванням реальних властивостей і впливу вільної поверхні

Development of trypsin biosensor based on ion sensitive field-effect transistors for proteins determination

International audienceThis new biosensor for protein determination is based on a possibility of translation of either a proton or hydroxyl ion arising during protein hydrolysis in the presence of trypsin by means of ion selective field effect transistor (ISFET). The conditions of trypsin immobilization and main biosensor characteristics were optimized using hydrolysis reaction of nalpha-benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride (BAEE). The trypsin was immobilized on the ISFET surface using a co-reticulation process between the enzyme and BSA (4% trypsin. 6% BSA) in saturated glutaraldehyde vapour. The limit of detection of BAEE with this biosensor is 0.5 mM with a linear dynamics range from 0.5 to 5 mM, and sensitivity is about 6 mV/mM. The time of biosensor response was 5-7 min. The possibility of the application of developed biosensor for detection of small penta-peptide, which is used in some cosmetic products, has been demonstrated

Phylogenetic analysis of Ukrainian Bacillus anthracis strains from various sources

ObjectiveDue to the lack of information about the phylogenetic origins of Ukrainian Bacillus anthracis strains,the goal of this work was to make phylogenetic analysis of Ukrainian isolates obtained from various sources (soil, clinical material from infected humans and animal products) for better understanding of phylogenetic origins of this pathogen in Ukraine and Eastern Europe.IntroductionAnthrax is a widely spread zoonotic disease with natural transmissive cycle involving wildlife, livestock and humans [1]. It is caused by Bacillus anthracis, a highly pathogenic gram-positive, spore-producing bacterium, which poses a serious threat to public and animal health due to its mortality both for animals and for humans [2, 3, 4]. The ability of B. anthracis spores to remain viable in soils for decades enables their isolation from freely accessible environment [5]. This unique feature to form highly resistant spores in the environment plays a major role in the ecology and evolution of this pathogen [6]. During the spore phase, evolution is greatly reduced in rate, which limits the amount of genetic diversity found among isolates of this species [1]. All these factors demonstrate the need for reliable anthrax diagnosis and trace-back methods. This comprises bio forensic capabilities including state-of-the-art methods for accurate genotyping of B. anthracis strains.Methods23 thermolysates of B. anthracis broth cultures isolated from various sources (vesicles from eleven different people infected with cutaneous anthrax when disease’s sporadic outbreaks were detected in Ukraine in 1963-2002, as well as two samples from sheep wool, and eight soil samples) were obtained from the Central Epidemiological Station (Kyiv, Ukraine), as well as from I.I. Mechnikov Ukrainian Scientific and Research Anti-plaque Institute (Odessa, Ukraine). These anthrax cultures were confirmed with classical microbiological methods (microscopy, cultivation on solid and liquid media), “string of pearls” reaction, and using bioassay on living white mice (the mortality was observed two days after subcutaneous injection of 0,2-0,5 ml of cells’ suspension). All these tests were carried out at the institutions where samples were obtained. Besides, one B. anthracis isolate was cultivated from soil sample of an animal grave site nearby Koviagy village, Valky district, Kharkiv region. All samples were analyzed at the Bundeswehr Institute of Microbiology (Munich, Germany). To confirm the presence of the anthrax genome and plasmids, we isolated genomic DNA (gDNA) from thermolysates and studied the presence of the genomic marker dhp61 as well as the plasmid specific marker pagA (pXO1) and capC (pXO2) using qPCR. Quality of the isolated gDNA was tested using the Agilent bioanalyzer. To characterize regional and global phylogeographic patterns of these strains, canonical Single Nucleotide Polymorphisms analysis (canSNP) was conducted using high resolution melt (HRM). Three thermolysates of broth cultures isolated and soil sample isolated from animal grave site in Kharkiv region were analyzed using NewSeq Full genome sequencing.ResultsB. anthracis chromosomal DNA-marker dhp61 as well as pXO1 marker pagA and pXO2 plasmid marker capC could be detected in all thermolysates. However, the soil isolate from the Koviagy grave site was positive for dhp61 but contained only the pXO1 plasmid. The Bioanalyzer assay revealed that only 6 out of the 23 thermolysates had good enough DNA quality to be sequenced. So far only genomes of thermolysates of soil samples from Mykolaiv and Sumy regions, the thermolysate of sick patient's vesicle from Kherson region as well as the soil sample from the animal grave site in Kharkiv region have been sequenced. For the residual 3 thermolysates the full genome analysis is still in progress. The sequencing results showed that the B. anthracis strain isolated from Mykolaiv soil sample belongs to the Vollum linage group and other thermolysates from Sumy and Kherson regions are closely clustering with isolates from Japan. Thus, human isolate from Kherson region is clustering with the Japanese isolate BA104 which was obtained from pig during sporadic anthrax incident in 1982 and soil isolate from Sumy region is clustering with the BA 103 isolate which was obtained from beef cattle in Japan in 1991. In contrast, we analyzed the genomic sequence of the pXO2-negative isolate from grave site in Kharkiv region using BioNumerics software and found that it has high similarity to STI strain.ConclusionsThe infrequent sporadic occurrence of anthrax in the country of Ukraine is likely caused by a heterogeneous population of B. anthracis. The found STI strain in the grave site of Kharkiv region is probably an environmental recovery of the Russian anthrax live vaccine which was commonly used for vaccination of animals in the former Soviet Union The sequencing result of the soil isolate from Mykolaiv region indicates the occurrence of another canSNP group, the Vollum group, which is quite untypical for Ukraine. The latter is mainly prevalent in the Asian regions (namely Pakistan) and therefore might have been introduced to Ukraine over the silk road. Other two thermolysates from Sumy and Kherson regions also showed unexpected results clustering with Japanese isolates. The further research of Ukrainian B. anthracis isolates will allow us to expand our knowledge about the population structure and evolution of anthrax in Ukraine.References1. Van Ert MN, Easterday WR, Huynh LY, Okinaka RT, Hugh-Jones ME, Ravel J, et al. (2007) Global Genetic Population Structure of Bacillus anthracis. PLoS ONE 2(5);2. Freidlander, A. M. 1997. Anthrax, p. 467–478. In F. R. Sidell, E. T. Takafuji, and D. R. Franz (ed.), Medical aspects of chemical and biological warfare. Office of the Surgeon General, Washington, D.C.3. Hoffmaster AR, Fitzgerald CC, Ribot E, Mayer LW, Popovic T (2002) Molecular subtyping of Bacillus anthracis and the 2001 bioterrorism-associated anthrax outbreak, United States. Emerg Infect Dis 8: 1111–1116.4. Keim P, Van Ert MN, Pearson T, Vogler AJ, Huynh LY, et al. (2004) Anthrax molecular epidemiology and forensics: using the appropriate marker for different evolutionary scales. Infect Genet Evol 4: 205–213.5. Eitzen, E. M. 1997. Use of biological weapons, p. 437–450. In F. R. Sidell, E. T. Takafuji, and D. R. Franz (ed.), Medical aspects of chemical and biological warfare. Office of the Surgeon General, Washington, D.C.6. Biloivan O, Duerr A, Schwarz J, Grass G, Arefiev V, Solodiankin O, Stegniy B, Gerilovych A (2018) Phylogenetic analysis of Ukrainian Bacillus anthracis strains. Third Annual BTRP Ukraine Regional One Health Research Symposium, abstract directory: 122

Protein detection based on microelectrodes with the PPy[3,3-Co(1,2-C2B9H11)](2) solid contact and immobilized proteinases: Preliminary investigations

International audienceProtein selective potentiometric microelectrodes with the PPy[3,3-Co(1,2-C2B9H11)(2) solid internal contact were fabricated by the immobilization of different proteinases such as trypsin, pronase E and carboxypeptidase B on the surface of platinum microelectrodes modified by a conducting polymer. The performance of these biosensors was investigated by using potentionnetric measurements. The feasibility of this biosensor for protein determination was demonstrated, with a detection limit of about 1-2 mu g/ml for prolamine in buffer solution