Molecular epidemiology and population biology of Clostridium difficile

Clostridium difficile ist der häufigste Erreger postantibiotischer Diarrhöen. Um die Verbreitung epidemischer Erregervarianten erfassen zu können, ist eine molekulare Typisierung erforderlich. Über die DNA-Sequenzanalyse repetitiver Regionen wurde ein neues Typisierverfahren (Tandem-Repeat-Sequenz-Typisierung) für C. difficile entwickelt. Die TRST verfügt über eine hohe Konkordanz zu etablierten Verfahren und kann die klonale Populationsstruktur und Phylogenie von C. difficile korrekt abbilden. Durch die Sequenzanalyse werden dabei reproduzierbar eindeutige Typen festgelegt und die Nachteile subjektiv auszuwertender Typisierverfahren überwunden, wodurch die Vergleichbarkeit internationaler Studien gewährleistet wird. In den letzten Jahren ist die Inzidenz von C. difficile Infektionen weltweit gestiegen, zum Teil assoziiert mit der Ausbreitung des Epidemiestammes Ribotyp 027. Da keine deutschlandweiten Daten über die Ribotypverteilung und deren Antibiotikaresistenz existierten, wurden von Januar bis Dezember 2008 670 Isolate aus 84 Krankenhäusern molekular typisiert. Ribotyp 001 war der prävalenteste Ribotyp, gefolgt von Isolaten des Ribotyps 078 und 027. Resistenzen gegenüber den Therapieantibiotika Metronidazol und Vancomycin waren nicht nachweisbar, wohingegen eine weit verbreitete Fluorchinolonresistenz und konvergent entwickelte Gyrasemutationen für ein hohes Infektionsrisiko nach Fluorchinolon-Therapie sprechen. Um die Hintergründe der weltweiten Ausbreitung des Ribotyps 027 verstehen zu können, sind fundierte Kenntnisse der genetischen Populationsstruktur erforderlich. Über die Typisierung von 60 internationalen Isolaten mit Hilfe von Mirkosatelliten (MLVA) konnte die globale Ausbreitung einer neuen Erregervariante gezeigt werden. Die Genomsequenzierung eines Isolats aus Deutschland und anschließende Genomvergleiche bestätigten die Evolution neuer Linien, wodurch zur Aufklärung der Entwicklungsgeschichte des Ribotyps beigetragen werden konnte.Clostridium difficile is the most frequent cause of postantibiotic diarrhea. Genotyping is necessary to track the emergence and spread of epidemic strains. By analysing repetitive DNA in the genome of C. difficile, we established a new sequence-based typing method designated tandem repeat sequence typing (TRST). TRST demonstrated excellent concordance with widely used PCR ribotyping and equal discriminatory power. Moreover, sequence clades corresponded to phylogenetically coherent groupings. In future the inherent portability of sequence data will enable decentralized genotyping efforts, which may boost large scale investigations on the molecular diversity of C. difficile. During the past decade, incidence rates of C. difficile infections have increased worldwide, partly due to the emergence of more virulent ribotype 027 strains. As no nationwide surveillance data on C. difficile genotype prevalence and associated antibiotic susceptibility existed, we characterized 670 isolates collected from patients in 84 hospitals in Germany during 2008. PCR ribotyping showed high prevalence of ribotype 001 and restricted dissemination of ribotype 027 strains. No resistance to metronidazole or vancomycin was noted; however frequent fluoroquinolone resistance and associated gyrase mutations suggested a high infection risk after fluoroquinolone prescription. Resolving the evolutionary history of global ribotype 027 spread requires detailed knowledge of the genetic population structure of C. difficile. Multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA) of 60 international ribotype 027 strains revealed the dissemination of a new variant 027 strain. Genome sequencing of an isolate from Germany and subsequent comparative genomics confirmed the evolution of new 027 lineages, which contributes to the understanding of the evolutionary history of international ribotype 027 emergence

Typing Clostridium difficile strains based on tandem repeat sequences

Background: Genotyping of epidemic Clostridium difficile strains is necessary to track their emergence and spread. Portability of genotyping data is desirable to facilitate inter-laboratory comparisons and epidemiological studies. Results: This report presents results from a systematic screen for variation in repetitive DNA in the genome of C. difficile. We describe two tandem repeat loci, designated \u27TR6\u27 and \u27TR10\u27, which display extensive sequence variation that may be useful for sequence-based strain typing. Based on an investigation of 154 C. difficile isolates comprising 75 ribotypes, tandem repeat sequencing demonstrated excellent concordance with widely used PCR ribotyping and equal discriminatory power. Moreover, tandem repeat sequences enabled the reconstruction of the isolates\u27 largely clonal population structure and evolutionary history. Conclusion: We conclude that sequence analysis of the two repetitive loci introduced here may be highly useful for routine typing of C. difficile. Tandem repeat sequence typing resolves phylogenetic diversity to a level equivalent to PCR ribotypes. DNA sequences may be stored in databases accessible over the internet, obviating the need for the exchange of reference strains

Fluoroquinolone Resistance and Clostridium difficile, Germany

We characterized 670 Clostridium diffi cile isolates collected from patients in 84 hospitals in Germany in 2008. PCR ribotyping showed high prevalence of ribotype 001 and restricted dissemination of ribotype 027 strains. Fluoroquinolone resistance and associated gyrase mutations were frequent in various ribotypes, but no resistance to metronidazole or vancomycin was noted

Clostridium difficile ribotypes 001, 017, and 027 are associated with lethal C. difficile infection in Hesse, Germany

From January 2008 to April 2009, 72 cases of severe Clostridium difficile infection were reported from 18 different districts in the state of Hesse, Germany. A total of 41 C. difficile isolates from 41 patients were subjected to PCR ribotyping. PCR ribotype (RT) 027 was the most prevalent strain accounting for 24 of 41 (59%) of typed isolates, followed by RT 001 (eight isolates, 20%), RT 017 and 042 (two isolates each), and RT 003, 066, 078, 081, and RKI-034 (one isolate each). Eighteen patients had died within 30 days after admission. C. difficile was reported as underlying cause of or contributing to death in 14 patients, indicating a case fatality rate of 19%. The patients with lethal outcome attributable to C. difficile were 59-89 years-old (median 78 years). Ribotyping results were available for seven isolates associated with lethal outcome, which were identified as RT 027 in three and as RT 001 and 017 in two cases each. Our data suggest that C. difficile RT 027 is prevalent in some hospitals in Hesse and that, in addition to the possibly more virulent RT 027, other toxigenic C. difficile strains like RT 001 and 017 are associated with lethal C. difficile infections in this region

Clostridium-difficile-Ribotyp 027: Epidemiologie und Klinik des erstmaligen endemischen Auftretens in Deutschland

Hintergrund: Im September 2007 trat eine Häufung von ungewöhnlich schwer verlaufenden Clostridium-difficile-assoziierten Infektionen (CDI) in einem Trierer Krankenhaus auf. Es wurde vermutet, dass ein neuer Stamm (PCR-Ribotyp 027) mit diesen Ereignissen im Zusammenhang stehen könnte. Zur Untersuchung der Erkrankungsfälle wurde das Gesundheitsamt Trier auf Einladung des Landes Rheinland-Pfalz von einem Feldteam des Robert Koch-Instituts unterstützt. Ziel der Untersuchung war die Aufklärung und Unterbrechung der vermuteten Infektkette. Methoden: Neben einer retrospektiven Fallsuche von schwer verlaufenden CDI durch Analyse von Patientenakten und Totenscheinen erfolgte eine intensivierte Surveillance von schweren CDI in den Krankenhäusern der betroffenen Region. Dazu wurden bei allen neu auftretenden Verdachtsfällen parallel ein Toxin-A/B-Nachweis und eine selektive Anzucht auf C. difficile durchgeführt. Die Isolate wurden mittels PCR ribotypisiert. Daten zum Krankheitsverlauf und zur Letalität wurden mit einem standardisierten Erhebungsbogen erfasst und statistisch in einer multivariaten Analyse ausgewertet. In dem Index-Krankenhaus wurden Personaluntersuchungen durchgeführt. Ergebnisse: Bis zum 31.1.2008 wurden insgesamt 27 schwere CDI ohne Ribotypisierung und 21 bestätigte Fälle von C.-difficile-Ribotyp-027-Infektionen der Region Trier identifiziert. Im Rahmen der intensivierten Surveillance wurden 399 Patienten untersucht, von denen 76 (19 %) C.-difficile-Isolate angezüchtet werden konnten. Bei 20 Patienten wurde der PCR-Ribotyp 027 nachgewiesen. Insgesamt kam es zu 9 Todesfällen (19 %). Eine bestehende immunsupressive Therapie (Odds Ratio 35,8; 95 %-Konfidenzintervall 2,8 - 464,5) war unabhängiger Risikofaktor für einen letalen Krankheitsverlauf. Schwer verlaufende Infektionen wurden auch bei anderen, Nicht-027-Ribotypen beobachtet. Im Screening vom Krankenhauspersonal des Indexkrankenhauses (n = 161) waren 6 % der Mitarbeiter C.-difficile-Toxin positiv. Diskussion: In dieser Untersuchung konnte erstmalig die endemische Verbreitung von C.-difficile-PCR-Ribotyps 027 in einer Region Deutschlands nachgewiesen werden. Als direkte Konsequenz des Ausbruchs wurde Ende 2007 die Ärztliche Meldepflicht für schwer verlaufende CDI eingeführt. Neben krankenhaushygienischen Maßnahmen ist die kritische Verwendung von Antibiotika eine wichtige Maßnahme zur Verhinderung einer weiteren Zunahme von CDI