Purification et caracterisation de la proteine 90 KD de choc thermique, associee au recepteur des hormones glucocorticoiedes du rat

SIGLECNRS T Bordereau / INIST-CNRS - Institut de l'Information Scientifique et TechniqueFRFranc

La protéine de choc thermique (HSP 90 kD) : purification, caractérisation, modalités d'interaction avec le récepteur des glucocorticoïdes

Steroid receptor proteins are direct transducers, binding specifically to cognate hormonal gene regulatory DNA sequences. The glucocorticoids receptor (GR) is a cytoplasmic protein in its hormone-free, untransformed, state; after hormone binding GR undergoes transformations (activation) which induces GR nuclear translocation, and the binding to specific DNA sequences termed glucocorticoids response elements. Analysis if cell extracts indicates that the untransformed GR is oligomecir, and that complexes contain non-receptor proteins. One of these is the 90 KDa a heat shochk protein, HSP 90. Whether ither factors are apart of untransformer receptor complexes is not well established, but HSP 90 kDA appears to associate with untransformed receptor even within intact cells, implying that this interaction may be physiologically relevant. HSP 90 kDa seems to be necessary to maintain the unliganded GR in a high affinity steroid binding conformation, and to repress its transcriptional activity. Upon hormone binding, HSP 90 kDa dissociates from GR and GR acquires an increases affinity for DNA. Whereas several regions involved in the formation of a stable complexes with HSP 90 kDa have been localized in the sequence of GR and other steroid hormone receptors, the corresponding regions of HSP 90 kDa still remain unidentified. To characterize these regions interacting with GR, we have, a first step, developed a fast and efficient method for the isolation of HSP 90 kDa, comprising a two-step high-performance anion-exchange and gel permeation column chromatography. The purification of this protein allowed us to determine its biochemical and physicochemical properties. As a second step, we have studied the highly negatively charged sequence region present in all eukaryotic HSP 90 kDa. Others have suggested that this region could interact with steroid receptor. Therefore, a peptide corresponding to the highly negatively charged sequence (232-266) from the mouse HSP 90 kDa β was synthesized. A polyclonal antibody (Ac232-266) was raised against this peptide. The antibody reacted with both the native and denatured forms of HSP 90 kDa, and cross-reacted with HSP 90 kDa from a broad range of species. Contrary to the monoclonal antibody Ac88 (which recognizes all eukaryotic HSP 90 kDa), our polyclonal antipeptide antibody did not interact with the untransformed rat glucocorticoid receptor. We demonstrated that epitopes recognized by these two antibodies are different and the one recognized by Ac88 is found in the part C-terminal of HSPs 90 kDa. More interestingly the addition of either Ac232-266 or peptide 232-266 to untransformed glucocorticoid receptor complexes affected steroid binding and/or physicochemical properties of the complexes. In the presence of Ac232-266 a time and antibody concentration dependent loss of steroid binding activity occurred. The same effect was observed in the presence of peptide 232-266 which was also able to induce a dissociation of the transformed from of the receptor to the DNA binding from. This effect was observed at 0-4°C and in the presence of the 10 mM molybdate. All these data strongly offred that the region extending from aminoacids 232 to 266 is directly involved in the interaction between HSP 90 kDa and the glucocorticoid receptorDans le mécanisme d’action des hormones glucocorticoïdes, il est admis que la transformation (ou activation) du complexe hormone glucocorticoïde-récepteur est concomitante à une conversion de ce dernier d’une forme non transformée, de haut poids moléculaire et incapable de se lier à l’DN, à la forme transformée de petit poids moléculaire liant l’ADN. Le récepteur non transformée possède une structure hétérooligométrique. Il comprend en plus de la sous-unité protéique liant l’hormone d’autres facteurs protéiques non liants, identifiés comme étant des protéines de choc thermique (HSP). Parmi celles-ci la plus constamment retrouvée est la protéine HSP 90 kDa dont l’association avec le récepteur non transformé a également été mise en évidence dans les cellules intactes. L’HSP 90 kDa semble jouer un rôle chaperon en stabilisant le récepteur sous une forme capable de lier l’hormone, mais inactive sur le plan transcriptionnel. La fixation de l’hormone provoque la dissociation du complexe et l’activation du récepteur. Les régions de l’HSP 90 kDa interagissant avec le récepteur sont très mal connues. Pour aborder l’étude de ce problème, il nous fallait disposer de la protéine HSP 90 kDa à l’état pur. Nous avons mis au point un protocole de purification, rapide et simple, de cette protéine qui nous a permis sa caractérisation physicochimique et biochimique. Ensuite, nous avons produit un anticorps polyclonal (Ac232-266) dirigé contre un peptide de synthèse de 35 acides aminés, choisi dans la partie N-terminal HSP 90 kDa entière de souris, à la fois dénaturée ou isolée sous ses différentes isoformes et possède une réactivité interespèces. Contrairement à l’anticorps monoclonal (Ac88), dirigé contre un épitope non identifié mais commun à toutes les HSP 90 kDa eucaryotes, l’Ac232-266 reconnaît la protéine HSP 90 kDa libre, mais pas celle liée au récepteur. Nous montrons que ces anticorps reconnaissent deux épitopes différents et que celui reconnu par l’Ac88 serait situé dans la partie C-terminal des HSPs 90 kDa. De plus, le récepteur non transformé incubé en présence de l’Ac232-266 perd sa capacité de liaisons à l’hormone. Cette perte de liaison au stéroïde du récepteur est aussi observé en présence du peptide 232-266 qui se révèle en outre capable de convertir le récepteur non transformé en une forme de petit poids moléculaire capable de se lier à l’ADN. Ces résultats suggèrent que la région peptidique 232-266 est directement impliquée dans l’interaction de l’HSP 90 kDa avec le récepteur des glucocorticoïdesThèse de doctorat en sciences biomédicales (biochimie) -- UCL, 199

Characterization of the 90 kDa heat shock protein (HSP90)-associated ATP/GTPase

The 90 kDa heat shock protein (HSP90) is an ATP-binding molecular chaperone with an associated ATPase activity having nucleoplasmin and HSP70-binding homology domains and containing Ca-binding EF-hands and a nuclear localization signal. Here we characterize the HSP90-associated ATPase and show that it is (i) a P-type ATPase inhibited by molybdate and vanadate, (ii) able to hydrolyze methylfluorescein phosphate with a 5–6-fold higher affinity, (iii) a 3-times better GTPase than ATPase in the presence of calcium and (iv) HSP27 and F-actin, but not HSP10 can “convert” the HSP90-associated ATPase activity to HSP90 autokinase activity. The HSP90-associated ATP/GTPase may participate in the regulation of complex formation of HSP90 with other proteins, such as F-actin, tubulin and heat shock proteins