Image segmentation applied to volumetric measurements on centrifugal microfluidic platforms in motion

Microfluidic platforms allow the implementation of classical analytical operations at a mere fraction of the time, cost and resources required conventionally while granting the potential for measurements to be taken directly in the field by untrained personnel. Centrifugal microfluidic (CM) platforms, a subset of microfluidic platforms, use centrifugal force to direct liquid flow and perform a variety of analytical operations.Although the use of centrifugal force grants CM platforms many advantages such as a high degree of parallelism, the potential for portability, and the capability to pump liquids irrespective of their physicochemical properties, it creates a design paradigm that requires all platform operations to occur while the platform is in motion. Stopping a CM platform may result in unintended capillary induced flow in channels that can disrupt the intended operation and even cause a loss of sample. In accordance with this paradigm, it is important to develop measurement techniques that can be utilized while CM platforms are in motion. One measurement of importance is the volume of liquid aliquots inside a CM platform. The capability to measure volume directly on CM platforms in motion could allow experiments to quantify liquid flow in real time and avoid the use of volume metering chambers, which occupy valuable platform space. In this thesis, a new technique based on image segmentation was created to perform volume measurements on CM platforms in motion. Evaluation platforms containing a black contrast layer were fabricated and injected with liquid aliquots. High-resolution images of the evaluation platforms in motion were obtained with a high speed camera synchronized to a strobe light and the images were processed digitally. Platform images were then converted to an intensity space before image segmentation was applied to trace the inner contour of each liquid aliquot. The contour of each measured aliquot was filled and an area was computed. This area was ratioed against that obtained for a calibration volume located on the same image to obtain the volume of the aliquot.The volume measurement technique was characterized through experiments designed to test its precision and accuracy over a range of volumes. The results were found to be 1 and 2% respectively. Further characterization of the technique revealed its flexibility in regards to optical magnification, chamber shape, size and aspect ratio and platform rotational frequency. An investigation into the effects of surface tension on the method precision was also conducted. The applicability of the technique to liquids of various colours was successfully demonstrated. The versatility of the method should allow it to be used for a variety of applications including real time metering of volumes in platforms, quantitative monitoring of a design's performance in real time and the elimination of metering chambers in designs.Les systèmes microfluidiques permettent la miniaturisation de techniques classiques d'analyse chimique en n'utilisant qu'une fraction du temps et des ressources requises conventionnellement. Ces systèmes offrent la possibilité d'effectuer des mesures directement sur le terrain sans avoir recours à un personnel qualifié. Des systèmes microfluidiques ont été développés qui utilisent la force centrifuge pour diriger le débit de liquides injectés et accomplir une variété de processus analytiques. Bien que l'utilisation de la force centrifuge accorde à ces systèmes plusieurs avantages tels qu'un haut niveau de parallélisme, un potentiel de portabilité et la capacité de pomper des liquides indépendamment de leurs propriétés physicochimiques, elle crée aussi un modèle de conception qui requière l'accomplissement de toutes les opérations analytiques pendant que le système est en rotation.En accord avec ce modèle, il est important de développer des techniques de mesure qui peuvent être appliquées pendant qu'un système microfluidique centrifuge est en mouvement. Une mesure importante est celle du volume de liquides injectés dans un système microfluidique centrifuge. La capacité d'effectuer la mesure des volumes directement sur des systèmes microfluidiques en mouvement pourrait permettre la quantification du débit de liquide en temps réel et éliminer le besoin d'utiliser des chambres de comptage qui occupent un espace déjà restreint sur le système.Dans cette thèse, une technique basée sur la segmentation d'images a été développée pour mesurer le volume d'aliquotes de liquide dans des systèmes microfluidiques en rotation. Des systèmes d'évaluation contenant une couche de peinture contrastante ont été conçus, fabriqués et injectés avec des aliquotes de liquides. Des images de haute résolution de ces systèmes en mouvement ont été acquises avec une caméra numérique à haute vitesse synchronisée avec une lumière stroboscopique et traitées numériquement. Ces images ont été converties à un espace colorimétrique de niveau de gris et segmentées pour tracer un contour autour de chaque aliquote de liquide. Ces contours ont ensuite été utilisés pour calculer l'aire de chaque aliquote qui a ensuite été divisée par l'aire d'une aliquote de calibration située sur la même image pour obtenir le volume de chaque aliquote. La technique de mesure de volume a été caractérisée par des études conçus pour tester sa précision et son exactitude pour différents volumes. La précision et l'exactitude obtenues ont été de 1 et 2 % respectivement. Une caractérisation supplémentaire de la technique a révélé sa flexibilité quant au grandissement du système optique, la taille, la forme et le rapport hauteur/largeur des chambres du système et la fréquence de rotation du système. Une enquête sur les effets de la tension de surface du liquide mesuré sur la précision de la méthode a aussi été effectuée. L'applicabilité de la technique à des liquides de diverses couleurs a aussi été démontrée avec succès. La versatilité de cette méthode devrait permettre son utilisation dans une variété d'applications incluant la mesure de volumes en temps réel, le contrôle quantitatif de la performance de designs de systèmes microfluidiques centrifuges en temps réel et l'élimination de chambres de comptage dans leur conception.

Nonlinear microscopy as a tool for histological examinations

Histological analysis is a fundamental technique in modern medical diagnostics. In this thesis, we present novel imaging techniques based on nonlinear microscopy to provide a most needed update to classical histological methods, some of which were initially developed a hundred years ago. Nonlinear microscopy, a form of advanced laser scanning microscopy, enables three-dimensional imaging within tissue using multiple complementary nonlinear contrast mechanisms including multiphoton fluorescence, second harmonic generation (SHG) and third harmonic generation (THG) each with inherent optical sectioning capabilities. The technique can be applied to both labelled and unlabeled samples, allowing for greater flexibility.This thesis first presents a new histological malaria detection method, third harmonic generation imaging scanning cytometry (THGISC). This technique is based on the combination of THG imaging, high speed motorized scanning and automated software processing. THG is a nonlinear optical process in which three incident photons interact with specific materials to combine into one photon that possesses the sum of their energies resulting in emission that is three times the incident light frequency. Hemozoin, a metabolic byproduct of the malaria parasite, has been shown to present a strong THG signal. We applied THGISC to lab-cultured parasites and malaria infected patient blood samples. We demonstrated that our technique is comparable in effectiveness to the gold standard of malaria detection by manual observation of Giemsa staining while significantly improving throughput thanks to rapid scanning and automated software-based parasitemia determination.A novel multimodal approach for virtual histology of rabbit vocal folds by label-free nonlinear microscopy and nano computed tomography is presented to investigate vocal fold regeneration after injury. Traditionally, vocal fold histology was conducted through mechanical sectioning of tissue into thin slices and conventional histological staining of the slices. Our method enables us to visualize the tissue microarchitecture, particularly extracellular matrix elements such as collagen and elastin, which are critical for the proper functioning of vocal folds. We visualize collagen through SHG and elastin via two photon fluorescence; we are also able to observe other features of interest in whole vocal folds such as muscle, chondrocytes and blood vessels through two photon fluorescence. The resulting images were used to create detailed three-dimensional models of vocal fold tissue that can be computationally cross-sectioned in software for easy visualization. Lastly, we investigate common histological dyes as THG harmonophores, enabling high resolution selective imaging of specific histological tissue features. We first verified the third order nonlinear susceptibility of hematoxylin within hematoxylin and eosin stained human skin and liver tissue sections, demonstrating highly selective nuclear staining by THG. We then identified two new THG harmonophores in common histological stains: Verhoeff-Van-Gieson and picrosirius red. We observe that the iron hematoxylin component of the Verhoeff stain acts as a selective THG harmonophore in tissue, binding to elastic fibers and nuclei. We also showed for the first time a significant nonlinear emission from picrosirius red, enabling highly specific, high contrast collagen detection by THG imaging.The application of nonlinear microscopy to histological investigations provides powerful alternatives to conventional methods. The inherent optical sectioning capability of nonlinear microscopy extends histology into the third dimension while the multimodal approach allows for simultaneous visualization of structures of interest in both unlabeled tissue and through labelling with highly selective harmonophores. We anticipate that these techniques will be adopted in the future of modern biomedical diagnostics.L'analyse histologique est une technique fondamentale du diagnostic médical moderne. Dans cette thèse, nous présentons de nouvelles techniques d'imagerie basées sur la microscopie non linéaire pour apporter une mise à jour indispensable des méthodes histologiques classiques, dont certaines ont été développées il y a cent ans. La microscopie non linéaire, une forme de microscopie avancée à balayage laser, permet une imagerie tridimensionnelle dans un tissu en utilisant de multiples mécanismes de contraste non linéaires complémentaires, notamment la fluorescence multiphotonique, la génération de seconde harmonique (GSH) et la génération de troisième harmonique (GTH), chacun ayant une capacité intrinsèque de sectionnement optique. Cette technique peut être appliquée aux échantillons marqués et sans marqueur, permettant une plus grande flexibilité.Cette thèse présente d'abord une nouvelle méthode de détection histologique du paludisme, la cytométrie de balayage par imagerie de la génération de troisième harmonique (CBIGTH). Cette technique repose sur la combinaison de l'imagerie par GTH, du balayage motorisé à grande vitesse et du traitement logiciel automatisé. Nous avons démontré que l'efficacité de notre technique était comparable à celle de la détection du paludisme par l'observation manuelle de la coloration au Giemsa tout en améliorant considérablement le rendement grâce au balayage rapide et à la détermination automatisée de la parasitémie basée sur logiciel.Une nouvelle approche multimodale pour l'histologie virtuelle des cordes vocales de lapin par microscopie non linéaire sans marqueur et nano-tomodensitométrie est présentée afin d'étudier la régénération des cordes vocales après une blessure. Notre méthode nous permet de visualiser la microarchitecture tissulaire, en particulier les éléments de la matrice extracellulaire tels que le collagène et l'élastine, qui sont essentiels au bon fonctionnement des cordes vocales. Nous visualisons le collagène par GSH et l'élastine par fluorescence à deux photons; nous sommes également en mesure d'observer d'autres caractéristiques intéressantes dans des cordes vocales entières telles que le muscle, les chondrocytes et les vaisseaux sanguins grâce à la fluorescence à deux photons. Enfin, nous étudions les colorants histologiques courants en tant qu'harmonophores de GTH, permettant une imagerie sélective à haute résolution de caractéristiques tissulaires histologiques spécifiques. Nous avons d'abord vérifié la sensibilité non linéaire de troisième ordre de l'hématoxyline dans les coupes de tissu humain de la peau et du foie colorées à l'hématoxyline et à l'éosine, démontrant une coloration nucléaire hautement sélective par la GTH. Nous avons ensuite identifié deux nouveaux harmonophores de GTH dans des colorants histologiques communs: Verhoeff-Van-Gieson et rouge picrosirius. Nous observons que le composant d'hématoxyline de fer de la coloration de Verhoeff agit comme un harmonophore de GTH sélectif dans le tissu qui se lie aux fibres élastiques et aux noyaux cellulaires. Nous avons également montré pour la première fois une émission non linéaire significative du rouge picrosirius, permettant une détection hautement spécifique du collagène à contraste élevé par imagerie de GTH.L'application de la microscopie non linéaire aux investigations histologiques fournit de puissantes alternatives aux méthodes conventionnelles. La capacité de sectionnement optique intrinsèque à la microscopie non linéaire étend l'histologie à la troisième dimension, tandis que l'approche multimodale permet la visualisation simultanée des structures d'intérêt dans les tissus non marqués et par marquage à l'aide d'harmonophores hautement sélectifs. Nous anticipons que ces techniques seront adoptées dans le futur du diagnostic biomédical moderne

Automated Liquid–Liquid Extraction by Pneumatic Recirculation on a Centrifugal Microfluidic Platform

In this technical note, a liquid–liquid extraction technique was performed using pneumatic liquid recirculation on a centrifugal microfluidic device. Non-contact pneumatic pumping enabled a multi-cycle liquid–liquid extraction process using aqueous iodine in a potassium iodide solution and hexadecane while requiring a minimal amount of space on the device. The extraction process was completely automated on the device following sample introduction and required only 50 s for each extraction cycle. The pumping rate achieved during liquid recirculation was 120 ± 10 μL/min. A recycling process such as the one demonstrated would be difficult to implement in a conventional centrifugal microfluidic system

Evaluation formative et régulation didactique des apprentissages en EPS

National audienceà veni

Design and implementation of fluidic micro-pulleys for flow control on centrifugal microfluidic platforms

Microfluidic discs have been employed in a variety of applications for chemical analyses and biological diagnostics. These platforms offer a sophisticated fluidic toolbox, necessary to perform processes that involve sample preparation, purification, analysis, and detection. However, one of the weaknesses of such systems is the uni-directional movement of fluid from the disc centre to its periphery due to the uni-directionality of the propelling centrifugal force. Here we demonstrate a mechanism for fluid movement from the periphery of a hydrophobic disc towards its centre that does not rely on the energy supplied by any peripheral equipment. This method utilizes a ventless fluidic network that connects a column of working fluid to a sample fluid. As the working fluid is pushed by the centrifugal force to move towards the periphery of the disc, the sample fluid is pulled up towards the centre of the disc analogous to a physical pulley where two weights are connected by a rope passed through a block. The ventless network is analogous to the rope in the pulley. As the working fluid descends, it creates a negative pressure that pulls the sample fluid up. The sample and working fluids do not come into direct contact, and it allows the freedom to select a working fluid with physical properties markedly different from those of the sample. This article provides a demonstration of the "micro-pulley" on a disc, discusses underlying physical phenomena, provides design guidelines for fabrication of micro-pulleys on discs, and outlines a vision for future micro-pulley applications.close0