Lox-dependent gene expression in transgenic plants obtained via Agrobacterium-mediated transformation

Lox sites of the Cre/lox recombination system from bacteriophage P1 were analyzed for their ability to affect on transgene expression when inserted upstream from a gene coding sequence adjacent to the right border (RB) of T-DNA. Wild and mutated types of lox sites were tested for their effect upon bar gene expression in plants obtained via Agrobacterium-mediated and biolistic transformation methods. Lox-mediated expression of bar gene, recognized by resistance of transgenic plants to PPT, occurred only in plants obtained via Agrobacterium-mediated transformation. RT-PCR analysis confirms that PPT-resistant phenotype of transgenic plants obtained via Agrobacterium-mediated transformation was caused by activation of bar gene. The plasmid with promoterless gus gene together with the lox site adjacent to the RB was constructed and transferred to Nicotiana tabacum as well. Transgenic plants exhibited GUS activity and expression of gus gene was detected in plant leaves. Expression of bar gene from the vectors containing lox site near RB allowed recovery of numerous PPT-resistant transformants of such important crops as Beta vulgaris, Brassica napus, Lactuca sativa and Solanum tuberosum. Our results demonstrate that the lox site sequence adjacent to the RB can be used to control bar gene expression in transgenic plants.Проанализирована способность lox-сайтов Cre/lox системы рекомбинации бактериофага Р1 влиять на экспрессию трансгенов при расположении этой последовательности непосредственно возле правого бордера (RB) перед кодирующей последовательностью гена. Нативная и мутированная последовательность lox-сайта были размещены в векторах для трансформации возле гена bar и проведена генетическая трансформация растений с помощью агробактерии и биолистическим методом. Lox-опосредованная экспрессия гена bar, обусловливающая устойчивость растений к фосфинотрицину, наблюдалась только у растений, которые получены с помощью агробактериальной трансформации. Методом РТ-ПЦР анализа подтверждено, что в трансгенных растениях, устойчивых к фосфинотрицину, происходит транскрипция гена bar. Сконструирован вектор, в котором ген gus и предшествующий ему lox-сайт размещены вблизи правого бордера, и проведена трансформация табака этим вектором. Экспрессия гена gus задетектирована в листьях трансгенных растений. Векторы, у которых последовательность lox-сайта предшествует гену bar возле правого бордера (RB-lox-bar), успешно использованы для получения устойчивых к фосфинотрицину трансгенных растений таких видов, как Beta vulgaris, Brassica napus, Lactuca sativa и Solanum tuberosum. Наши результаты подтверждают возможность использования последовательности lox-сайта возле правого бордера для контроля экспрессии гена bar в трансгенных растениях

Создание трансгенных растений салата, содержащих ген сшитого белка антигенов ESAT6:Ag85B из Mycobacterium tuberculosis

Трансгенні рослини є багатообіцяючим і безпечним інструментом для створення їстівних вакцин. Імунізація, що відбувається внаслідок вживання в їжу рослин, у яких проходить експресія туберкульозних антигенів, є перспективним підходом у боротьбі з туберкульозом. У цій роботі ми повідомляємо про створення трансгенних рослин салату (Lactuca sativa), що містять ген зшитого білка антигенів Mycobacterium tuberculosis ESAT6:Ag85B. Трансгенні рослини були отримані методом трансформації за допомогою Agrobacterium tumefaciens. У роботі були використані вектори, що містять ген esxA, зшитий з геном fbpB. Також вектори містили селективні гени: ген неоміцинфосфотрансферази (nptII) або фосфінотрицин ацетилтрансферази (bar). На селективному середовищі були відібрані трансгенні рослини салату. Наявність селективного та цільового генів у геномі цих рослин була підтверджена за допомогою ПЛР. Трансгенні рослини салату були висаджені в ґрунт в умовах теплиці для проведення наступних досліджень.Transgenic plants are promising and potentially safe tools to produce edible vaccines. Passive immunization by oral delivery of Mycobacterium tuberculosis antigens expressed in transgenic plants seems to be the perspective strategy to combat tuberculosis. In this paper, we discuss the generation of lettuce (Lactuca sativa) transgenic plants carrying the fused gene of Mycobacterium tuberculosis antigens ESAT6:Ag85B. By employing Agrobacterium mediated transformation method, transgenic plants are obtained. Vectors containing gene esxA fused with fbpB gene are used. Plasmid vectors also contain selective genes of neomycin phosphotransferase II (nptII) or phosphinothricin acetyl transferase (bar). Stable transgenic plants are selected. By using PCR analysis, we confirm the presence of target and selective genes in plants genome. Rooted plats are transferred to soil in the greenhouse for further experiments.Трансгенные растения являются многообещающим и безопасным инструментом для создания съедобных вакцин. Иммунизация, что происходит в результате употребления в пищу растений, в которых проходит экспрессия туберкулезных антигенов, является перспективным подходом в борьбе с туберкулезом. В этой работе мы сообщаем о создании трансгенных растений салата (Lactuca sativa), содержащих ген сшитого белка антигенов Mycobacterium tuberculosis ESAT6:Ag85B. Трансгенные растения были получены методом трансформации с помощью Agrobacterium tumefaciens. В работе были использованы векторы, содержащие ген esxA, сшитый с геном fbpB. Также векторы содержали селективные гены: ген неомицинфосфотрансферазы (nptII) или фосфинотрицин ацетилтрансферазы (bar). На селективной среде были отобраны трансгенные растения салата. Наличие селективного и целевого генов в геноме этих растений было подтверждено с помощью ПЦР. Трансгенные растения салата были высажены в грунт в условиях теплицы для проведения последующих исследований

Распределение генов HLA II у больных раком носоглотки, ассоциированным с вирусом Эпштейна–Барр, и другими опухолями ротовой полости в России

Background. It has been proved that for the nasopharyngeal carcinoma (NPC) the etiological agent is the Epstein–Barr virus (EBV). Being an ubiquitous infection, EBV, under certain conditions, is able to display its oncogenic potential. Among a wide range of tumors associated with EBV, the NPC occupies a special place because it is characterized by a geographically and ethnically heterogeneous distribution, suggesting that in the pathogenesis of NPC, in addition to EBV, an important role is played by other factors, such as genetic predisposition to this neoplasm. Among known genetic factors influencing the frequency of NPC development, the human leukocyte antigen (HLA) complex occupies an important place, as it plays a central role in the presentation of viral antigens to the immune system. In Russia, the association of HLA alleles with the risk of EBV associated forms of NPC development and with development of other oral cavity tumors (OOCT), not associated with the virus, has not been studied. In the literature there are contradictory information about HLA genes, which determine the predisposition to the emergence of these tumors, and their role in the initiation and formation an immune response to EBV proteins.Objective: to study the distribution of the of DQA1-, DQB1-, DRB1-HLA class II gene variants associated with respectively the risk or resistance to the development of NPC and OOCT and with a high and low level of antibody response to EBV main proteins. A group of healthy persons served as a control.Materials and methods. Blood samples from 62 patients with NPC, 44 patients with OOCT, and as control, 300 healthy individuals, were used in the study. The blood serum samples of NPC and OOCT patients were tested for the presence of immunoglobulin classes G and A antibodies to capsid and early EBV antigens by indirect immunofluorescence. All serum samples of patients and healthy individuals were genotyped on HLA-DQA1, -DQB1 and -DRB1 by the method of multi-primer amplification by sequence-specific primers by real-time polymerase chain reaction.Results. In NPC patients, an increase in the frequency of HLA-DRB1*08 was found when compared with the frequency of a similar allele in healthy individuals (5.6 % vs 1.8 %; odds ratio (OR) 3.2; 95 % confidence interval (CI) 1.1–9.1; p = 0.02), and, on the contrary, a lower HLA-DQB1*0301 frequency was detected (16.1 % vs 25.3 %; p <0.05) than in healthy individuals. The data obtained suggest that the HLA-DRB1*08 gene is associated with an increased sensitivity to NPC.In OOCT patients, HLA-DQB1*0502–4 and HLA-DRB1*16 variants were less common than in healthy individuals (1.1 % vs 6.8 %; p <0.05 and 1.1 % vs 6.7 %; OR 0.16; 95 % CI 0.01–1.08; p <0.05, respectively), suggesting that the HLA-DQB1*0301 gene is associated with resistance to NPC, and HLA-DQB1*0502–4 and HLA-DRB1*16 variants – with resistance to OOCT. It is interesting to note the difference in the frequency of HLA-DRB1*13 between NPC and OOCT patients (17.7 % vs 6.8 %; OR 2.9; 95 %CI 1.1–8.6; p <0.05). One can suggest that this difference is related to the proven involvement of EBV in the NPC development. There were no other differences in the frequencies of class II HLA genes between the groups of NPC and OOCT patients. For the first time in Russia the importance of alleles DQA1, DQB1 and DRB1 of the HLA gene for the NPC and OOCT development, malignant tumors, respectively associated and non-associated with EBV, was studied. The results of the investigation completed together with known literature data allow us to conclude that the above alleles of the HLA class II gene can serve as a factor predisposing to the development of NPC in Russia.Conclusion. However, in order to establish a strict association between a specific HLA haplotype and the NPC and OOCT incidence, the information obtained is insufficient due to the complexity and variability of the genetic control of immune responses controlling the tumor process. A comprehensive study of this issue using different immune response genes and populations of different ethnic origins will probably help to elucidate the effect of genetic polymorphism on the risk of NPC and OOCT development in Russia.Введение. Назофарингеальная карцинома (рак носоглотки, РНГ), как известно, строго ассоциирована с вирусом Эпштейна–Барр (ВЭБ). Однако ВЭБ является убиквитарной инфекцией, тогда как РНГ развивается довольно редко и характеризуется географически и этнически неоднородным распространением, что позволяет предположить важную роль других кофакторов в патогенезе РНГ, таких как окружающая среда и генетическая предрасположенность. Среди известных генетических факторов, ассоциированных с РНГ, главный комплекс гистосовместимости (лейкоцитарный антиген человека, human leukocyte antigen (HLA)) занимает важное положение, так как играет ключевую роль в презентации вирусных антигенов иммунной системы. В России изучение ассоциации аллелей HLA с риском развития РНГ, связанного с ВЭБ, не проводилось, а в литературе существуют противоречивые сведения о роли разных HLA-генов как в возникновении и развитии РНГ, так и в инициации и особенностях иммунного ответа к белкам ВЭБ.Цель исследования – изучение распределения вариантов DQA1-, DQB1-, DRB1-генов HLA класса II у больных РНГ и пациентов с другими опухолями полости рта (ДОПР), ассоциированными и не ассоциированными с ВЭБ, в группах с высоким и низким уровнем гуморального иммунного ответа к основным белкам ВЭБ по сравнению с контрольной группой здоровых лиц.Материалы и методы. Всего в исследование вошли 62 больных недифференцированным РНГ и 44 пациента с ДОПР, а также 300 здоровых лиц. Сыворотка крови всех больных была протестирована на наличие антител иммуноглобулинов классов G и А к капсидному и раннему антигенам ВЭБ методом непрямой иммунофлюоресценции. Все образцы генотипированы на HLA-DQA1, -DQB1 и -DRB1 с помощью мультипраймерной амплификации сиквенс-специфическими праймерами методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.Результаты. Показано увеличение частоты HLA-DRB1*08 у пациентов с РНГ по сравнению с контролем (5,6 % против 1,8 %; отношение шансов (ОШ) 3,2; 95 % доверительный интервал (ДИ) 1,1–9,1; р = 0,02). Возможно, ген HLA-DRB1*08 ассоциирован с повышенной чувствительностью к РНГ. В то же время у пациентов с РНГ была выявлена более низкая, чем в контроле, частота HLA-DQB1*0301 (16,1 % против 25,3 %; р <0,05). Вариант HLA-DQB1*0502–4, наоборот, реже встречался у пациентов с ДОПР, чем в контроле (1,1 % против 6,8 %; р <0,05). Аналогичные наблюдения касаются HLA-DRB1*16, частота которого у пациентов с ДОПР была ниже, чем в контроле (1,1 % против 6,7 %; ОШ 0,16; 95 % ДИ 0,01–1,08; р <0,05), т. е. ген HLA-DQB1*0301 ассоциирован с резистентностью к РНГ, а варианты HLA-DQB1*0502–4 и HLA-DRB1*16 – с резистентностью к ДОПР.Интересен факт обнаружения различий в частоте HLA-DRB1*13 у пациентов с РНГ и ДОПР (17,7 % против 6,8 %; ОШ 2,9; 95 % ДИ 1,1–8,6; р <0,05). Эти различия могут быть связаны с доказанным участием ВЭБ в развитии РНГ. Других различий по частотам генов HLA класса II между группами пациентов с РНГ и ДОПР не выявлено. Впервые в России проведено изучение связи аллелей DQA1, DQB1 и DRB1 гена HLA с развитием назофарингеальной карциномы (РНГ) и ДОПР, ассоциированных и не ассоциированных с ВЭБ.Заключение. Наши исследования в совокупности с уже известными данными позволяют заключить, что имеется определенная связь генов HLA класса II c развитием РНГ, однако для установления строгой ассоциации аллелей HLA класса II с РНГ и другими опухолями области головы и шеи полученных сведений недостаточно из-за сложности и вариабельности генетического контроля иммунных реакций, контролирующих опухолевый процесс

Social-ecological outcomes of agricultural intensification

Land-use intensification in agrarian landscapes is seen as a key strategy to simultaneously feed humanity and use ecosystems sustainably, but the conditions that support positive social-ecological outcomes remain poorly documented. We address this knowledge gap by synthesizing research that analyses how agricultural intensification affects both ecosystem services and human well-being in low- and middle-income countries. Overall, we find that agricultural intensification is rarely found to lead to simultaneous positive ecosystem service and well-being outcomes. This is particularly the case when ecosystem services other than food provisioning are taken into consideration

Uncertainty of wheat water use: Simulated patterns and sensitivity to temperature and CO₂

Projected global warming and population growth will reduce future water availability for agriculture. Thus, it is essential to increase the efficiency in using water to ensure crop productivity. Quantifying crop water use (WU; i.e. actual evapotranspiration) is a critical step towards this goal. Here, sixteen wheat simulation models were used to quantify sources of model uncertainty and to estimate the relative changes and variability between models for simulated WU, water use efficiency (WUE, WU per unit of grain dry mass produced), transpiration efficiency (Teff, transpiration per kg of unit of grain yield dry mass produced), grain yield, crop transpiration and soil evaporation at increased temperatures and elevated atmospheric carbon dioxide concentrations ([CO2]). The greatest uncertainty in simulating water use, potential evapotranspiration, crop transpiration and soil evaporation was due to differences in how crop transpiration was modelled and accounted for 50% of the total variability among models. The simulation results for the sensitivity to temperature indicated that crop WU will decline with increasing temperature due to reduced growing seasons. The uncertainties in simulated crop WU, and in particularly due to uncertainties in simulating crop transpiration, were greater under conditions of increased temperatures and with high temperatures in combination with elevated atmospheric [CO2] concentrations. Hence the simulation of crop WU, and in particularly crop transpiration under higher temperature, needs to be improved and evaluated with field measurements before models can be used to simulate climate change impacts on future crop water demand

Pathogenic variants in the DEAH-box RNA helicase DHX37 are a frequent cause of 46,XY gonadal dysgenesis and 46,XY testicular regression syndrome

PURPOSE: XY individuals with disorders/differences of sex development (DSD) are characterized by reduced androgenization caused, in some children, by gonadal dysgenesis or testis regression during fetal development. The genetic etiology for most patients with 46,XY gonadal dysgenesis and for all patients with testicular regression syndrome (TRS) is unknown. METHODS: We performed exome and/or Sanger sequencing in 145 individuals with 46,XY DSD of unknown etiology including gonadal dysgenesis and TRS. RESULTS: Thirteen children carried heterozygous missense pathogenic variants involving the RNA helicase DHX37, which is essential for ribosome biogenesis. Enrichment of rare/novel DHX37 missense variants in 46,XY DSD is highly significant compared with controls (P value = 5.8 × 10-10). Five variants are de novo (P value = 1.5 × 10-5). Twelve variants are clustered in two highly conserved functional domains and were specifically associated with gonadal dysgenesis and TRS. Consistent with a role in early testis development, DHX37 is expressed specifically in somatic cells of the developing human and mouse testis. CONCLUSION: DHX37 pathogenic variants are a new cause of an autosomal dominant form of 46,XY DSD, including gonadal dysgenesis and TRS, showing that these conditions are part of a clinical spectrum. This raises the possibility that some forms of DSD may be a ribosomopathy

Multimodel ensembles of wheat growth: many models are better than one.

Crop models of crop growth are increasingly used to quantify the impact of global changes due to climate or crop management. Therefore, accuracy of simulation results is a major concern. Studies with ensembles of crop models can give valuable information about model accuracy and uncertainty, but such studies are difficult to organize and have only recently begun. We report on the largest ensemble study to date, of 27 wheat models tested in four contrasting locations for their accuracy in simulating multiple crop growth and yield variables. The relative error averaged over models was 24-38% for the different end-of-season variables including grain yield (GY) and grain protein concentration (GPC). There was little relation between error of a model for GY or GPC and error for in-season variables. Thus, most models did not arrive at accurate simulations of GY and GPC by accurately simulating preceding growth dynamics. Ensemble simulations, taking either the mean (e-mean) or median (e-median) of simulated values, gave better estimates than any individual model when all variables were considered. Compared to individual models, e-median ranked first in simulating measured GY and third in GPC. The error of e-mean and e-median declined with an increasing number of ensemble members, with little decrease beyond 10 models. We conclude that multimodel ensembles can be used to create new estimators with improved accuracy and consistency in simulating growth dynamics. We argue that these results are applicable to other crop species, and hypothesize that they apply more generally to ecological system models