Of bits and bugs

Pur-α is a nucleic acid-binding protein involved in cell cycle control, transcription, and neuronal function. Initially no prediction of the three-dimensional structure of Pur-α was possible. However, recently we solved the X-ray structure of Pur-α from the fruitfly Drosophila melanogaster and showed that it contains a so-called PUR domain. Here we explain how we exploited bioinformatics tools in combination with X-ray structure determination of a bacterial homolog to obtain diffracting crystals and the high-resolution structure of Drosophila Pur-α. First, we used sensitive methods for remote-homology detection to find three repetitive regions in Pur-α. We realized that our lack of understanding how these repeats interact to form a globular domain was a major problem for crystallization and structure determination. With our information on the repeat motifs we then identified a distant bacterial homolog that contains only one repeat. We determined the bacterial crystal structure and found that two of the repeats interact to form a globular domain. Based on this bacterial structure, we calculated a computational model of the eukaryotic protein. The model allowed us to design a crystallizable fragment and to determine the structure of Drosophila Pur-α. Key for success was the fact that single repeats of the bacterial protein self-assembled into a globular domain, instructing us on the number and boundaries of repeats to be included for crystallization trials with the eukaryotic protein. This study demonstrates that the simpler structural domain arrangement of a distant prokaryotic protein can guide the design of eukaryotic crystallization constructs. Since many eukaryotic proteins contain multiple repeats or repeating domains, this approach might be instructive for structural studies of a range of proteins

Solvent content of protein crystals from diffraction intensities by Independent Component Analysis

An analysis of the protein content of several crystal forms of proteins has been performed. We apply a new numerical technique, the Independent Component Analysis (ICA), to determine the volume fraction of the asymmetric unit occupied by the protein. This technique requires only the crystallographic data of structure factors as input.Comment: 9 pages, 2 figures, 1 tabl

siRNA basierter Screen zur Identifikation neuer Imatinib-Resistenzmechanismen bei chronischer myeloischer Leukämie

Resistenz gegenüber IM stellt ein klinisches relevantes und in den zugrunde liegenden Mechanismen bislang nur teilweise verstandenes Problem dar. Um mögliche Ursachen für eine Resistenzentwicklung zu finden, bedienten wir uns eines shRNA basierten Screen mit der von Brummelkamp et al. 2002 etablierten NKI-Library. K562-wt wurden mit der Library und Kontroll-Vektoren transfiziert und mit 750 nM IM drei Wochen inkubiert. Es konnten insgesamt vier Gene isoliert werden: Tanscriptional regulating factor 1 (TRERF1), ein Transkriptionsfaktor, der primär im Zusammenhang mit Steroidhormonsynthese und Tamoxifenresistenz bei Mamm- akarzinom beschrieben ist. BCL2-like Protein 11 (Bim, Bcl-2 interacting mediator of cell death), ein Protein der Bcl-2 Familie, welches Apoptose regelt und als Resistenzmechanismus gegenüber IM beschrieben ist. Seizure-Related 6 Homolog (Mouse)-Like 2 (SEZ6L2) ist ein Oberflächenprotein, dessen Gen auf dem Chromosom 16p11.2 lokalisiert ist und von welchem angenommen wird, dass es Kandidatengene für Erkrankungen des autistischen Formenkreises (autism spectrum disorders [ASD]) beinhaltet. Homo sapiens Enhancer of Zeste Homolog 1 (Drosophila) (EZH1) ist ein Gen der Polycomp Gruppe (PcG). Proteine dieser Gruppe sind an der epigenetischen Regulation in der Embryonalentwicklung durch Methylierung des Histon H3 am Lysin-Rest 27 (H3K27) beteiligt

Untersuchungen zur oberflächenverstärkten Raman-Streuung an chemisch modifizierten Metallsubstraten

Chemo-optische Sensoren enthalten oberflächengebundene Rezeptorschichten, die Analyte aufnehmen und mit geeigneten spektroskopischen Methoden entsprechende optische Signale liefern können. Eine Immobilisierung dieser Rezeptorschichten auf nanostrukturierten Metallschichten erlaubt zur Untersuchung der Adsorptionsvorgänge den Einsatz der oberflächenverstärken Raman-Streuung (SERS). Auf diese Weise kann die Adsorption mit einer analytspezifischen und empfindlichen Detektionsmethode gekoppelt werden und so den Nachweis kleinster Analytmengen ermöglichen.Im Rahmen dieser Arbeit wurden unterschiedliche Strategien zur Herstellung von Rezeptormolekülen und -schichten auf geeigneten Substraten verfolgt und deren Adsorptionseigenschaften mit Hilfe der SERS-Spektroskopie untersucht. Als Rezeptorschichten wurden Käfigmoleküle wie Cyclodextrine oder Calixarene, molekular geprägte Polymere sowie biologisch aktive Moleküle verwendet. Die kommerziell erhältlichen Käfigmoleküle gehen keine Bindung an die Metalloberflächen der SERS-Substrate ein. Daher mußten zuerst in z.T. mehrstufigen Synthesen funktionelle Gruppen eingeführt werden, die eine dauerhafte Kopplung der Käfige an die Substrate ermöglichen. Bei den Cyclodextrinen wurden Edukte mit sechs, sieben und acht Glucose-Einheiten (a-, b- und g-Cyclodextrin) zu Thiolcyclodextrinen derivatisiert. Die erzielten Ausbeuten lagen aufgrund von Reinigungszyklen zwischen 20 und 30 %. Nach Immoblisierung dieser Verbindungen auf SERS-aktiven Oberflächen konnten Analyte aus der Gasphase an die Substrate adsorbiert werden. Zu den nachgewiesenen Verbindungen zählten halogenierte Kohlenwasserstoffe, substituierte einkernige aromatische Verbindungen sowie die kondensierten Aromaten Naphthalin und Anthracen. Hierbei bestand ein enger Zusammenhang zwischen den Größen von Analyt und Hohlraum des Cyclodextrins. Die in der Rezeptorschicht adsorbierten Moleküle lieferten im SERS-Spektrum charakteristische Schwingungsbanden. Eine Identifizierung der adsorbierten Verbindung konnte anhand der Raman-Spektren von Reinsubstanzen vorgenommen werden. In Abhängigkeit von der Gasphasenkonzentration stellte sich das Adsorptionsgleichgewichtes teilweise innerhalb weniger Minuten ein. Die gebildeten Einschlußkomplexe waren so stabil, daß sie nur durch Spülen mit Wasser wieder zersetzt werden konnten. Wegen dieser Anfälligkeit gegenüber Wasser konnten mit Cyclodextrin beschichtete SERS-Substrate nicht zu Messungen in wäßrigen Medien eingesetzt werden.Für die Messungen in wäßrigen Medien wurden Calixaren-Beschichtungen verwendet. Dimethyl((thiocarbamoyl)oxy)calixarene ließen sich in Ausbeuten um 50 % synthetisieren und zeigten nach der Immobilisierung auf SERS-Substraten sehr gute Adsorptionseigenschaften für verschiedene Analyte. Untersucht wurden die Aufnahme von BTXE-Aromaten aus der Gasphase und von diversen Nitroaromaten aus der wäßrigen Phase. Am Beispiel der Pikrinsäure wurde das Ansprechverhalten der Sensorschicht für unterschiedliche Konzentrationen und die Reversibilität der Adsorption untersucht. Der qualitative Nachweis von 250 ppb Pikrinsäure in Wasser gelang innerhalb weniger Minuten. Die resultierenden Wirts-Gast-Komplexe waren nicht so stabil wie die mit Cyclodextrinen und daher leichter und schneller, z.B. durch Verdünnung, wieder aufzubrechen.Die Selektivität der verwendeten Käfigmoleküle gegenüber Analyten beruhte überwiegend auf ihrer Größe. Eine weitaus selektivere Adsorption ließ sich durch den Einsatz von molekular geprägten Polymeren (Molecular Imprinted Polymers) als Rezeptorschicht erreichen. Mit ersten MIP-beschichteten SERS-Substraten konnte das Auswaschen und die anschließende Wiederbelegung mit Z-L-Asparaginsäure eindeutig anhand der Schwingungbanden nachgewiesen werden. Diese Art von Beschichtungen läßt sich leicht auf verschiedene analytische Problemstellungen anpassen, indem bei der Synthese des Polymers die entsprechenden Template eingebaut werden. Auf den hier verwendeten Substraten lagen die Polymere nur physisorbiert vor und lösten sich nach einer gewissen Zeit vom Metall ab. Daher werden MIPs benötigt, die eine stabile kovalente Bindung an die Metalloberflächen eingehen können. Weitere Untersuchungen sollten darauf hinzielen, bei der Synthese Monomere einzusetzen, die geeignete funktionelle Gruppen, wie etwa Disulfide, zur Kopplung an die Metalle aufweisen.Die Untersuchungen an den biologischen Systeme sollten dazu beitragen, Grundlagen für bio-optische Sensoren zu schaffen, die den selektiven Nachweis geringster Substanzmengen mit hoher Ortsauflösung erlauben.Die Komplexierung von (+)-Biotin an Streptavidin wurde an einem kommerziell erhältlichen Streptavidin-gelabelten Goldkolloid untersucht. Das im Mikromaßstab durchgeführte Experiment führte zu charakteristischen Änderungen in den SERS-Spektren. Im Laufe der Komplexierungsreaktionen traten immer wieder unterschiedlichste Störungen, wie etwa Aggregation oder Sedimentation des Hydrosols, auf. Trotzdem zeigte sich, daß Proteinreaktionen grundsätzlich und unter gewissen Voraussetzungen sogar in-situ mit SERS nachweisbar sind.Bei den Untersuchungen an Oligonukleotid-Proben konnte gezeigt werden, daß der markierungsfreie Nachweis von Hybridisierungsreaktionen komplementärer Nukleotid-Einzelstränge mit Hilfe der SERS-Spektroskopie möglich ist. Native Sequenzen verlieren aufgrund der Bindung an der Metalloberflächen ihre biologische Aktivität. Werden jedoch Nukleotid-Sequenzen verwendet, die am 5'-terminalen Ende des Zucker-Phosphat-Gerüstes mit einer Thiolgruppe derivatisiert wurden, dann bleibt auch nach der Immobilisierung die biologische Aktivität erhalten.Auf dieser Basis sind die Vorbedingungen für oberflächengebundene DNA-Sonden gegeben, die einen schnellen, eindeutigen und markierungsfreien Nachweis von Hybridisierungsreaktionen erlauben.Die hier untersuchten Rezeptorschichten zeigen durch die Adsorption unterschiedlicher Analyte die Möglichkeit des Einsatzes als chemo-optische Sensoren auf der Basis der SERS-Spektroskopie.Durch die Verwendung von optimierten Nanostrukturen sollten sich Einflüsse der Substratmorphologie auf die Spektren reduzieren lassen. Die oberflächenverstärkten Felder solcher Substrate zeigen im Vergleich zu stochastisch strukturierten Oberflächen größere Reichweiten und bessere Verstärkungen. Aufgrund des technologisch aufwendigen elektronenstrahllithographischen Herstellungprozesses sind diese Substrate derzeit jedoch nur in Kleinstserien herstellbar. Bei den Rezeptorschichten zeigten Calixarene und geprägte Polymere sehr gute Adsorptionseigenschaften. Um stabilere Beschichtungen zu erhalten, sind in diesem Bereich weitere präparative Arbeiten vonnöten.Eine räumliche Trennung von Meßort und Spektrometer kann durch die Immobilisierung der Rezeptorschichten auf die Endflächen von Lichtleitfasern erzielt werden. Bei rückseitiger Anregung der SERS-aktiven Schicht können dann Laser- und gestreute Strahlung in einer einzelnen Faser geführt werden. Hierdurch entsteht ein kompakter apparativer Aufbau mit einer Minimierung der freilaufenden Laserstrahlung. Erste Untersuchungen zu faseroptischen SERS-Sensoren zeigten die Möglichkeit, SERS-aktive Metallfilme auf Faserendflächen herzustellen und dort immobilisierte Testverbindungen zu detektieren. Die Adsorptionseigenschaften von Rezeptorschichten auf 'klassischen' SERS-Substraten liessen sich derzeit noch nicht auf diese Fasersensoren übertragen. Eine Optimierung des Aufbaus der SERS-aktiven Faserendflächen bietet jedoch auch in diesem Bereich Möglichkeiten für interessante künftige Untersuchungen

A Bacterial Homolog of a Eukaryotic Inositol Phosphate Signaling Enzyme Mediates Cross-kingdom Dialog in the Mammalian Gut

Dietary InsP6 can modulate eukaryotic cell proliferation and has complex nutritive consequences, but its metabolism in the mammalian gastrointestinal tract is poorly understood. Therefore, we performed phylogenetic analyses of the gastrointestinal microbiome in order to search for candidate InsP6 phosphatases. We determined that prominent gut bacteria express homologs of the mammalian InsP6 phosphatase (MINPP) and characterized the enzyme from Bacteroides thetaiotaomicron (BtMinpp). We show that BtMinpp has exceptionally high catalytic activity, which we rationalize on the basis of mutagenesis studies and by determining its crystal structure at 1.9 Å resolution. We demonstrate that BtMinpp is packaged inside outer membrane vesicles (OMVs) protecting the enzyme from degradation by gastrointestinal proteases. Moreover, we uncover an example of cross-kingdom cell-to-cell signaling, showing that the BtMinpp-OMVs interact with intestinal epithelial cells to promote intracellular Ca2+ signaling. Our characterization of BtMinpp offers several directions for understanding how the microbiome serves human gastrointestinal physiology

Learning effective amino acid interactions through iterative stochastic techniques

The prediction of the three-dimensional structures of the native state of proteins from the sequences of their amino acids is one of the most important challenges in molecular biology. An essential ingredient to solve this problem within coarse-grained models is the task of deducing effective interaction potentials between the amino acids. Over the years several techniques have been developed to extract potentials that are able to discriminate satisfactorily between the native and non-native folds of a pre-assigned protein sequence. In general, when these potentials are used in actual dynamical folding simulations, they lead to a drift of the native structure outside the quasi-native basin. In this study, we present and validate an approach to overcome this difficulty. By exploiting several numerical and analytical tools we set up a rigorous iterative scheme to extract potentials satisfying a pre-requisite of any viable potential: the stabilization of proteins within their native basin (less than 3-4 \AA$$ cRMS). The scheme is flexible and is demonstrated to be applicable to a variety of parametrizations of the energy function and provides, in each case, the optimal potentials.Comment: Revtex 17 pages, 10 eps figures. Proteins: Structure, Function and Genetics (in press

The linker domain of basal transcription factor TFIIB controls distinct recruitment and transcription stimulation functions

RNA polymerases (RNAPs) require basal transcription factors to assist them during transcription initiation. One of these factors, TFIIB, combines promoter recognition, recruitment of RNAP, promoter melting, start site selection and various post-initiation functions. The ability of 381 site-directed mutants in the TFIIB ‘linker domain’ to stimulate abortive transcription was systematically quantitated using promoter-independent dinucleotide extension assays. The results revealed two distinct clusters (mjTFIIB E78-R80 and mjTFIIB R90-G94, respectively) that were particularly sensitive to substitutions. In contrast, a short sequence (mjTFIIB A81-K89) between these two clusters tolerated radical single amino acid substitutions; short deletions in that region even caused a marked increase in the ability of TFIIB to stimulate abortive transcription (‘superstimulation’). The superstimulating activity did, however, not correlate with increased recruitment of the TFIIB/RNAP complex because substitutions in a particular residue (mjTFIIB K87) increased recruitment by more than 5-fold without affecting the rate of abortive transcript stimulation. Our work demonstrates that highly localized changes within the TFIIB linker have profound, yet surprisingly disconnected, effects on RNAP recruitment, TFIIB/RNAP complex stability and the rate of transcription initiation. The identification of superstimulating TFIIB variants reveals the existence of a previously unknown rate-limiting step acting on the earliest stages of gene expression

Architecture of Pol II(G) and molecular mechanism of transcription regulation by Gdown1.

Tight binding of Gdown1 represses RNA polymerase II (Pol II) function in a manner that is reversed by Mediator, but the structural basis of these processes is unclear. Although Gdown1 is intrinsically disordered, its Pol II interacting domains were localized and shown to occlude transcription factor IIF (TFIIF) and transcription factor IIB (TFIIB) binding by perfect positioning on their Pol II interaction sites. Robust binding of Gdown1 to Pol II is established by cooperative interactions of a strong Pol II binding region and two weaker binding modulatory regions, thus providing a mechanism both for tight Pol II binding and transcription inhibition and for its reversal. In support of a physiological function for Gdown1 in transcription repression, Gdown1 co-localizes with Pol II in transcriptionally silent nuclei of early Drosophila embryos but re-localizes to the cytoplasm during zygotic genome activation. Our study reveals a self-inactivation through Gdown1 binding as a unique mode of repression in Pol II function

A Nanosensor for TNT Detection Based on Molecularly Imprinted Polymers and Surface Enhanced Raman Scattering

We report on a new sensor strategy that integrates molecularly imprinted polymers (MIPs) with surface enhanced Raman scattering (SERS). The sensor was developed to detect the explosive, 2,4,6-trinitrotoluene (TNT). Micron thick films of sol gel-derived xerogels were deposited on a SERS-active surface as the sensing layer. Xerogels were molecularly imprinted for TNT using non-covalent interactions with the polymer matrix. Binding of the TNT within the polymer matrix results in unique SERS bands, which allow for detection and identification of the molecule in the MIP. This MIP-SERS sensor exhibits an apparent dissociation constant of (2.3 ± 0.3) × 10−5 M for TNT and a 3 μM detection limit. The response to TNT is reversible and the sensor is stable for at least 6 months. Key challenges, including developing a MIP formulation that is stable and integrated with the SERS substrate, and ensuring the MIP does not mask the spectral features of the target analyte through SERS polymer background, were successfully met. The results also suggest the MIP-SERS protocol can be extended to other target analytes of interest

Crosslinking-MS analysis reveals RNA polymerase I domain architecture and basis of rRNA cleavage

RNA polymerase (Pol) I contains a 10-subunit catalytic core that is related to the core of Pol II and includes subunit A12.2. In addition, Pol I contains the heterodimeric subcomplexes A14/43 and A49/34.5, which are related to the Pol II subcomplex Rpb4/7 and the Pol II initiation factor TFIIF, respectively. Here we used lysine-lysine crosslinking, mass spectrometry (MS) and modeling based on five crystal structures, to extend the previous homology model of the Pol I core, to confirm the location of A14/43 and to position A12.2 and A49/34.5 on the core. In the resulting model of Pol I, the C-terminal ribbon (C-ribbon) domain of A12.2 reaches the active site via the polymerase pore, like the C-ribbon of the Pol II cleavage factor TFIIS, explaining why the intrinsic RNA cleavage activity of Pol I is strong, in contrast to the weak cleavage activity of Pol II. The A49/34.5 dimerization module resides on the polymerase lobe, like TFIIF, whereas the A49 tWH domain resides above the cleft, resembling parts of TFIIE. This indicates that Pol I and also Pol III are distantly related to a Pol II–TFIIS–TFIIF–TFIIE complex