LC–MS-based absolute metabolite quantification:Application to metabolic flux measurement in trypanosomes

Human African trypanosomiasis is a neglected tropical disease caused by the protozoan parasite, Trypanosoma brucei. In the mammalian bloodstream, the trypanosome’s metabolism differs significantly from that of its host. For example, the parasite relies exclusively on glycolysis for energy source. Recently, computational and mathematical models of trypanosome metabolism have been generated to assist in understanding the parasite metabolism with the aim of facilitating drug development. Optimisation of these models requires quantitative information, including metabolite concentrations and/or metabolic fluxes that have been hitherto unavailable on a large scale. Here, we have implemented an LC–MS-based method that allows large scale quantification of metabolite levels by using U-13C-labelled E. coli extracts as internal standards. Known amounts of labelled E. coli extract were added into the parasite samples, as well as calibration standards, and used to obtain calibration curves enabling us to convert intensities into concentrations. This method allowed us to reliably quantify the changes of 43 intracellular metabolites and 32 extracellular metabolites in the medium over time. Based on the absolute quantification, we were able to compute consumption and production fluxes. These quantitative data can now be used to optimise computational models of parasite metabolism

Etude de l'ATPase cuivre eucaryote Ccc2 de Saccharomyces cerevisiae <br />De la localisation à la fonction

This thesis investigated two aspects of Ccc2, S. Cerevisiae copper ATPase. One is cellular and concerns the localization and the cellular function of Ccc2; the second one is biochemical and deals with the mechanism of copper transport by Ccc2. We found out that Ccc2 localizes at all the secretory pathway compartments and at the membrane of the vacuole. The latter result is the first evidence for a new function of Ccc2, that is to store copper into the vacuole lumen. Ccc2 is the first copper active transporter found in a vacuole. Our biochemical study shows that 2 coppers atoms bind to the isolated nucleotide domain of Ccc2. Two cysteines, C708 and C718, were identify as being part of the copper binding sites. Further studies will determine the function of these copper binding sites in the mechanism of copper transport by Ccc2.Dans cette thèse, nous avons abordé l'étude du fonctionnement de Ccc2, l'ATPase à cuivre de S. Cerevisiae sous deux aspects. Le premier, cellulaire, concerne une étude de sa localisation et de sa fonction; le second, biochimique, est une étude du mécanisme du transport du cuivre par l'ATPase. L'étude de la distribution intra-cellulaire de Ccc2 montre que l'ATPase n'est pas confinée dans l'appareil de Golgi, mais qu'elle est distribuée dans tous les compartiments de la voie sécrétoire, ainsi qu'à la membrane de la vacuole. Cette dernière localisation, qui n'avait jamais été décrite, nous a permis de montrer la participation de Ccc2 à l'accumulation de cuivre dans la vacuole. Il s'agit du premier transporteur actif découvert pour cette fonction. D'autre part, l'étude biochimique nous a permis de mettre en évidence la fixation de deux cuivres dans le domaine nucléotidique isolé. Deux acides aminés importants pour cette liaison du cuivre ont été identifiés, les cystéines 708 et 718. Reste à découvrir le rôle de ces sites dans le transport du cuivre par Ccc2

Etude de l'ATPase cuivre eucaryote Ccc2 de Saccharomyces cerevisiae <br />De la localisation à la fonction

This thesis investigated two aspects of Ccc2, S. Cerevisiae copper ATPase. One is cellular and concerns the localization and the cellular function of Ccc2; the second one is biochemical and deals with the mechanism of copper transport by Ccc2. We found out that Ccc2 localizes at all the secretory pathway compartments and at the membrane of the vacuole. The latter result is the first evidence for a new function of Ccc2, that is to store copper into the vacuole lumen. Ccc2 is the first copper active transporter found in a vacuole. Our biochemical study shows that 2 coppers atoms bind to the isolated nucleotide domain of Ccc2. Two cysteines, C708 and C718, were identify as being part of the copper binding sites. Further studies will determine the function of these copper binding sites in the mechanism of copper transport by Ccc2.Dans cette thèse, nous avons abordé l'étude du fonctionnement de Ccc2, l'ATPase à cuivre de S. Cerevisiae sous deux aspects. Le premier, cellulaire, concerne une étude de sa localisation et de sa fonction; le second, biochimique, est une étude du mécanisme du transport du cuivre par l'ATPase. L'étude de la distribution intra-cellulaire de Ccc2 montre que l'ATPase n'est pas confinée dans l'appareil de Golgi, mais qu'elle est distribuée dans tous les compartiments de la voie sécrétoire, ainsi qu'à la membrane de la vacuole. Cette dernière localisation, qui n'avait jamais été décrite, nous a permis de montrer la participation de Ccc2 à l'accumulation de cuivre dans la vacuole. Il s'agit du premier transporteur actif découvert pour cette fonction. D'autre part, l'étude biochimique nous a permis de mettre en évidence la fixation de deux cuivres dans le domaine nucléotidique isolé. Deux acides aminés importants pour cette liaison du cuivre ont été identifiés, les cystéines 708 et 718. Reste à découvrir le rôle de ces sites dans le transport du cuivre par Ccc2

Etude de l ATPase cuivre eucaryote Ccc2 de Saccharomyces cerevisiae (de la localisation à la fonction )

Dans cette thèse, nous avons abordé l'étude du fonctionnement de Ccc2, l'ATPase à cuivre de S. Cerevisiae sous deux aspects. Le premier, cellulaire, concerne une étude de sa localisation et de sa fonction; le second, biochimique, est une étude du mécanisme du transport du cuivre par l'ATPase. L'étude de la distribution intra-cellulaire de Ccc2 montre que l'ATPase n'est pas confinée dans l'appareil de Golgi, mais qu'elle est distribuée dans tous les compartiments de la voie sécrétoire, ainsi qu'à la membrane de la vacuole. Cette dernière localisation, qui n'avait jamais été décrite, nous a permis de montrer la participation de Ccc2 à l'accumulation de cuivre dans la vacuole. Il s'agit du premier transporteur actif découvert pour cette fonction. D'autre part, l'étude biochimique nous a permis de mettre en évidence la fixation de deux cuivres dans le domaine nucléotidique isolé. Deux acides aminés importants pour cette liaison du cuivre ont été identifiés, les cystéines 708 et 718. Reste à découvrir le rôle de ces sites dans le transport du cuivre par Ccc2.This thesis investigated two aspects of Ccc2, S. Cerevisiae copper ATPase. One is cellular and concerns the localization and the cellular function of Ccc2; the second one is biochemical and deals with the mechanism of copper transport by Ccc2. We found out that Ccc2 localizes at all the secretory pathway compartments and at the membrane of the vacuole. The latter result is the first evidence for a new function of Ccc2, that is to store copper into the vacuole lumen. Ccc2 is the first copper active transporter found in a vacuole. Our biochemical study shows that 2 coppers atoms bind to the isolated nucleotide domain of Ccc2. Two cysteines, C708 and C718, were identify as being part of the copper binding sites. Further studies will determine the function of these copper binding sites in the mechanism of copper transport by Ccc2.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Dissecting the role of the N-terminal metal-binding domains in activating the yeast copper ATPase in vivo

International audienceIn yeast, copper delivery to the trans-Golgi network involves interactions between the metallo-chaperone Atx1 and the N-terminus of Ccc2, the P-type ATPase responsible for copper transport across trans-Golgi network membranes. Disruption of the Atx1–Ccc2 route leads to cell growth arrest in a copper-and-iron-limited medium, a phenotype allowing complementation studies. Coexpression of Atx1 and Ccc2 mutants in an atx1Δccc2Δ strain allowed us to study in vivo Atx1–Ccc2 and intra-Ccc2 domain–domain interactions, leading to active copper transfer into the trans-Golgi network. The Ccc2 N-terminus encloses two copper-binding domains, M1 and M2. We show that in vivo Atx1–M1 or Atx1–M2 interactions activate Ccc2. M1 or M2, expressed in place of the metallo-chaperone Atx1, were not as efficient as Atx1 in delivering copper to the Ccc2 N-terminus. However, when the Ccc2 N-terminus was truncated, these independent metal-binding domains behaved like functional metallo-chaperones in delivering copper to another copper-binding site in Ccc2 whose identity is still unknown. Therefore, we provide evidence of a dual role for the Ccc2 N-terminus, namely to receive copper from Atx1 and to convey copper to another domain of Ccc2, thereby activating the ATPase. At variance with their prokaryotic homologues, Atx1 did not activate the Ccc2-derived ATPase lacking its N-terminus