La strategia del “knock-down” genico per l’identificazione dei fattori chiave di processi fisiopatologici: progettazione, sintesi e caratterizzazione di un ribozima “hammerhead”.

La cura della salute dei cittadini rappresenta un impegno sociale ed economico molto pesante a carico delle diverse comunità. I progressi della conoscenza sulle origini, lo sviluppo ed i meccanismi delle numerose patologie stanno fornendo sostanziali contributi al miglioramento delle diagnosi, all’introduzione di terapie più efficaci ed alla prevenzione. In particolare, le più recenti tecnologie d’indagine basate su analisi ad ampio spettro di geni, proteine, e funzioni metaboliche (genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica) sono in grado di fornire nuovi quadri interpretativi delle diverse manifestazioni patologiche. Da questi quadri è possibile postulare meccanismi e fattori chiave coinvolti nella patogenesi, nella progressione e negli esiti di una data malattia. Tuttavia, trattandosi di deduzioni, le diverse ipotesi devono essere convalidate mediante prove sperimentali opportunamente progettate. In questa prospettiva si colloca la tecnologia del “knock-down” genico secondo la quale è possibile inibire considerevolmente e in maniera selettiva un determinato gene. Il vantaggio di tale tecnica risiede nel fatto che consente di verificare in maniera diretta il ruolo che quel gene riveste in un preciso quadro metabolico evidenziabile con quel modello cellulare. Nel panorama degli armamentari messi in campo, per il conseguimento del “knock-down” genico, abbiamo scelto l’uso dei ribozimi “hammerhead”. Si tratta di corte sequenza di RNA, dotate di attività endoribonucleasica, capaci di riconoscere, legare e scindere un mRNA di cui si voglia ottenere l’inibizione. In questa Tesi di Laurea, svolta presso il laboratorio di “Proteomica e Tecnologie Genomiche” dell’istituto di Fisiologia Clinica del CNR di Pisa, è stato affrontato il tema della progettazione, sintesi e caratterizzazione di un ribozima “hammerhead” diretto contro il gene che codifica il recettore PDGFR-β per il fattore di crescita PDGF (Platelet Derived Growth Factor) nel maiale. La scelta riguarda la sua futura applicazione a cellule muscolari lisce di coronaria di maiale (VSMC), che rappresentano un modello di studio di patologie cardiovascolari. Poiché il PDGF sembra essere il più potente induttore dell’attivazione patologica delle VSMC, l’inibizione del suo recettore rappresenta un buon sistema di indagine utile per confermare il suo effettivo ruolo. a) progettazione del ribozima sulla base della sequenza porcina Durante la fase di progettazione di un ribozima hammerhead si devono prendere in considerazione alcuni aspetti: è necessario che I) la sequenza bersaglio sia accessibile, II) il ribozima sia stericamente “aperto”e III) le sequenze fiancheggianti non siano ripetute in altri mRNA, per evitare qualunque effetto collaterale “off-target”. Per rispondere ai primi due punti è cruciale la determinazione delle ipotetiche strutture ripiegate sia della molecola di RNA bersaglio che della molecola di ribozima, escludendo dalla selezione le regioni dell’RNA bersaglio coinvolte in strutture stabili ed in appaiamenti difficilmente accessibili per il ribozima e i ribozimi con ripiegamenti anomali che impediscono la strutturazione corretta del “core” catalitico. A questo scopo abbiamo applicato un metodo computazionale di progettazione. Poiché le banche genetiche internazionali contengono una mappa parziale del genoma di Sus scrofa, e l’mRNA relativo al PDGFR-β presenta due porzioni limitate della sequenza, non abbiamo potuto ricavare una valutazione rigorosa delle ipotetiche strutture secondarie assunte dalla molecola bersaglio, né verificare l’unicità del sito di legame/scissione, essendo il trascrittoma di maiale molto limitato. Nonostante la condizione poco favorevole, con l’aiuto di un programma di calcolo, basato sulla termodinamica del ripiegamento delle sequenze di RNA, abbiamo selezionato un sito di scissione, GUU, localizzato al nucleotide 288 della porzione nota dell’mRNA del PDGFR-β che sembrava favorevole. Su tale sequenza è stato disegnato il ribozima e ne è stata decisa la sintesi. b) sintesi e purificazione del ribozima e del suo bersaglio minimo La sequenza catalitica del ribozima, precedentemente disegnata, è stata sintetizzata con due diversi metodi: Per via chimica mediante l’uso di un sintetizzatore di oligonucleotidi, che esegue cicli di sintesi in maniera automatica. La sintesi avviene in fase solida, in condizioni anidre ed in atmosfera inerte di Argon, sfruttando la chimica delle fosforoammiditi. La strategia di sintesi prevede l’inserimento di un monomero alla volta ad una catena crescente e procede in direzione 3’-5’, a differenza di quanto accade in ambito biologico. I monomeri utilizzati sono β-cianoetil fosforoammiditi, caratterizzati dalla presenza di gruppi protettori sulle basi azotate, sull’atomo di fosforo in posizione 3’ e sui gruppi idrossilici in posizione 2’e 5’. Per via enzimatica. In questo caso, il primo passo è stato la preparazione del DNA stampo, a singolo filamento, mediante sintesi chimica automatica. Successivamente, con una reazione enzimatica di elongazione (DNA polimerasi) di un corto innesco di DNA appaiato al singolo filamento di sintesi abbiamo potuto ottenere la specie a doppio filamento, necessaria alla trascrizione “in vitro”. Il DNA a doppio filamento è stato successivamente usato come stampo per la reazione enzimatica di trascrizione “in vitro” mediante l’enzima T7 RNA polimerasi, in presenza di ribonucleotidi trifosfato. Anche il bersaglio ribonucleotidico (sequenza minima) è stato preparato mediante sintesi chimica. La scelta di una sequenza bersaglio minima è stata fatta nell’ottica di una sua rapida utilizzazione nelle successive valutazioni sperimentali delle proprietà catalitiche del ribozima. In questo caso, la sintesi per via enzimatica ha fornito prodotti con un basso grado di purezza; probabilmente a causa di una minore efficienza dell’enzima usato per la trascrizione, la cui “corsa” lungo lo stampo di DNA risulta più stabile (e quindi più efficiente) quando il “binario” (il filamento di DNA) è più lungo. Sulla base dell’esperienza fatta, il metodo di sintesi per via chimica è risultato preferibile al metodo di sintesi per via enzimatica perché garantisce una maggiore purezza del prodotto con rendimenti notevolmente più alti. Il procedimento di recupero dei prodotti di sintesi prevede il distacco dalla fase solida sulla quale è stata svolta la sintesi (vetro a porosità controllata) e la rimozione dei diversi sostituenti presenti a protezione dei gruppi funzionali. Dopo la deprotezione i prodotti ottenuti sono stati analizzati e purificati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC). c) caratterizzazione del ribozima: quantificazione, efficienza catalitica I prodotti purificati sono stati quantificati mediante misure di assorbimento UV a 260 nm. In seguito il ribozima è stato caratterizzato dal punto di vista catalitico mediante misure di tipo cinetico della reazione di scissione effettuata sul bersaglio minimo. Questo tipo di studio ci ha consentito di dimostrare innanzitutto che il ribozima è effettivamente capace di scindere l’RNA bersaglio. L’analisi delle proprietà cinetiche è stata realizzata utilizzando un metodo cromatografico di misura che permette di separare il substrato dai prodotti di cleavage mediante HPLC a scambio anionico. Con questo metodo abbiamo potuto quantificare ad ogni tempo di misura del progresso della reazione, simultaneamente ed in maniera accurata il substrato, i prodotti di scissione e il ribozima. I dati ottenuti sono stati poi elaborati allo scopo di calcolare: le frazioni del bersaglio residuo e dei prodotti formati, le velocità iniziali (v0), le relative Kobs, la costante di Michaelis-Menten Km e la costante catalitica Kcat. Le proprietà cinetiche sono state studiate in condizioni di multiple turnover, ovvero in eccesso di substrato rispetto al ribozima, a concentrazioni diverse di ioni magnesio. Quest’ultimo, infatti, presenta un ruolo importante per l’attività del ribozima e il suo contributo alla velocità della reazione di scissione è stato valutato. d) conclusioni I risultati ottenuti hanno mostrato l’effettiva capacità del ribozima, da noi realizzato, di catalizzare la scissione dell’RNA bersaglio. Anche la dipendenza della sua attività rispetto alla concentrazione di ioni magnesio, conferma la bontà del ribozima che presenta una discreta funzionalità anche in condizioni sfavorevoli, di bassa concentrazione dello ione metallico. Questo lavoro sperimentale dimostra la validità della metodica utilizzata in termini di progettazione e sintesi del ribozima e al tempo stesso introduce metodiche molto accurate per misurarne l’efficienza catalitica. Questo primo livello metodologico di sintesi e caratterizzazione rappresenta il punto di partenza di una tecnologia di “knock-down” genico, la cui tappa immediatamente successiva riguarderà la somministrazione a sistemi biologici modello. In tal caso, l’azione catalitica dovrà trasformarsi in un effetto biologico misurabile e indicativo dell’inibizione della funzione “bersaglio” prescelta. Questo naturale completamento del progetto aprirà le porte all’utilizzo dei ribozimi a fini investigativi, nella convalida del ruolo di marcatori di patologia, e nell’identificazione di nuovi bersagli terapeutici, per l’inibizione di anomalie fisiopatologiche

493. Aptamer-Mediated Targeted Delivery of Large RNA

Cell penetrating RNAs bind to cell surface receptors and internalize through endocytotic pathways. These delivery molecules are increasingly investigated for cell type targeted delivery of a wide variety of payloads, such as small molecule drugs, imaging agents and small interfering RNAs. Although larger oligonucleotides also have therapeutic and regulatory potential, their aptamer-mediated delivery into cells has not yet been reported. Recent advances in the selection and design of fluorescent aptamers allow for the tracking and visualization of RNA intracellularly and raise the possibility of directly monitoring delivery of large oligonucleotide payloads. Here we report on a plug-and-play platform for the targeted delivery of large functional RNA. Various cell-type specific targeting oligos, such as the anti-transferrin receptor aptamer, were annealed to variants of the fluorescent RNAs, Spinach and Broccoli, either through direct base-pairing of extension sequences or through a bridging oligo designed to release the payload in reducing environments. The size of the RNA payload (30-164 kDa) was explored through multimerization of the aptamers and was accomplished through several designs. Low signal intensity associated with the Spinach2 aptamer was partially overcome by dimerization of a minimal form of the aptamer, which yielded a nearly 2-fold increase in fluorescence per RNA transcript. The relatively small size of the dimeric Broccoli aptamer facilitated engineering of a tetrameric aptamer by inserting dimers into each end of a thermodynamically stable three-way junction RNA, and a much larger octomer by incorporating two tetramers on a single transcript. In all cases, multimerization of aptamer payloads resulted in significantly enhanced fluorescence. Formation of the self-assembling aptamer-aptamer complexes was confirmed through electrophoretic mobility shift assays and revealed that the fraction of fully annealed product varied considerably among designs and may account for some variations observed in previous studies for siRNA efficacy. Complex functionality was validated with spectrofluorometry, which reinforced the importance of designing RNA components to avoid misfolding that can abrogate functionality. Fluorescence confocal microscopy was used to detect delivery of functional RNA to a range of human and mice cells and demonstrated specificity of targeting aptamers for their intended cell-types. Delivered complexes exhibited punctate intracellular distribution, suggesting their localization in the endosomes. Our findings demonstrate that large functional RNAs can be delivered to living cells and may present the opportunity to deliver other large oligos, such as long non-coding RNAs and CRISPR/Cas9 guide RNA, to targeted cell types. Importantly, because fluorescent signal is only evident while the RNA remains intact and correctly folded, this strategy provides a powerful method to monitor the real-time integrity, delivery and localization of large and functional RNA cargoes

Wide Angle X-ray Sky Monitoring for Corroborating non-Electromagnetic Cosmic Transients

Gravitational waves (GW) can be emitted from coalescing neutron star (NS) and black hole-neutron star (BH-NS) binaries, which are thought to be the sources of short hard gamma ray bursts (SHBs). The gamma ray fireballs seem to be beamed into a small solid angle and therefore only a fraction of detectable GW events is expected to be observationally coincident with SHBs. Similarly ultrahigh energy (UHE) neutrino signals associated with gamma ray bursts (GRBs) could fail to be corroborated by prompt gamma-ray emission if the latter is beamed in a narrower cone than the neutrinos. Alternative ways to corroborate non-electromagnetic signals from coalescing neutron stars are therefore all the more desirable. It is noted here that the extended X-ray tails (XRT) of SHBs are similar to X-ray flashes (XRFs), and that both can be attributed to an off-axis line of sight and thus span a larger solid angle than the hard emission. It is proposed that a higher fraction of detectable GW events may be coincident with XRF/XRT than with hard gamma-rays, thereby enhancing the possibility to detect it as a GW or neutrino source. Scattered gamma-rays, which may subtend a much larger solid angle that the primary gamma ray jet, are also candidates for corroborating non-electromagnetic signals.Comment: 13 pages, accepted for publication in Astrophysical Journal Letter

On the Clustering of Sub-millimeter Galaxies

We measure the angular two-point correlation function of sub-millimeter galaxies (SMGs) from 1.1-millimeter imaging of the COSMOS field with the AzTEC camera and ASTE 10-meter telescope. These data yields one of the largest contiguous samples of SMGs to date, covering an area of 0.72 degrees^2 down to a 1.26 mJy/beam (1-sigma) limit, including 189 (328) sources with S/N greater than 3.5 (3). We can only set upper limits to the correlation length r_0, modeling the correlation function as a power-law with pre-assigned slope. Assuming existing redshift distributions, we derive 68.3% confidence level upper limits of r_0 < 6-8 h^-1 Mpc at 3.7 mJy, and r_0 < 11-12 h^-1 Mpc at 4.2 mJy. Although consistent with most previous estimates, these upper limits imply that the real r_0 is likely smaller. This casts doubts on the robustness of claims that SMGs are characterized by significantly stronger spatial clustering, (and thus larger mass), than differently selected galaxies at high-redshift. Using Monte Carlo simulations we show that even strongly clustered distributions of galaxies can appear unclustered when sampled with limited sensitivity and coarse angular resolution common to current sub-millimeter surveys. The simulations, however, also show that unclustered distributions can appear strongly clustered under these circumstances. From the simulations, we predict that at our survey depth, a mapped area of two degrees^2 is needed to reconstruct the correlation function, assuming smaller beam sizes of future surveys (e.g. the Large Millimeter Telescope's 6" beam size). At present, robust measures of the clustering strength of bright SMGs appear to be below the reach of most observations.Comment: 23 pages, 8 figures, accepted for publication in The Astrophysical Journa

The High Energy Budget Allocations in Shocks and GRB

The statistical distribution of energies among particles responsible for long Gamma Ray Burst (GRB) emission is analyzed in light of recent results of the Fermi Observatory. The allsky flux, $F_{\gamma}$, recorded by the Gamma Ray Burst Monitor (GBM) is shown, despite its larger energy range, to be not significantly larger than that reported by the Burst and Transient Explorer (BATSE), suggesting a relatively small flux in the 3 - 30 MeV energy range. The present-day energy input rate in $\gamma$-rays recorded by the GBM from long GRB is found, assuming star-formation rates in the literature, to be $\dot W(0)=0.5 F_{\gamma} H/c = 5 \times 10^{42}\ \rm{erg/Mpc^3 yr}$. The Large Area Telescope (LAT) fluence, when observed, is about 5-10\% per decade of the total, in good agreement with the predictions of saturated, non-linear shock acceleration. The high-energy component of long GRBs, as measured by Fermi, is found to contain only $\sim 10^{-2.5}$ of the energy needed to produce ultrahigh-energy cosmic rays (UHECR) above 4 Eev, assuming the latter to be extragalactic, when various numerical factors are carefully included, if the cosmic ray source spectrum has a spectral index of -2. The observed $\gamma$-ray fraction of the required UHECR energy is even smaller if the source spectrum is softer than $E^{-2}$. The AMANDA II limits rule out such a GRB origin for UHECR if much more than $10^{-2}$ of the cosmic ray energy goes into neutrinos that are within, and simultaneous with, the $\gamma$-ray beam. It is suggested that "orphan" neutrinos out of the $\gamma$-ray beam might be identifiable via orphan afterglow { or other wide angle signatures of GRB in lieu of coincidence with prompt $\gamma$-rays}, and it is recommended that feasible single neutrino trigger criteria be established to search for such coincidences.Comment: to appear in The Astrophysical Journa

Le abitudini al tempo del Coronavirus

Introduction: The COVID-19 pandemic that hit the humankind in December 2019, is steering quick and drastic changes to our habits. The goal of our research is the analysis of the emotional, healthy and physiological effects of this radical routine disruption, in a sample of 3000 Italian people. Methods: We made use of a 5-days flash survey in an anonymous way, available from April the 5th until April the 10th. Results: As expected, results show a healthy decrease, after just one month of lockdown, at several stages: emotional, relational, nutritional and physical. Conclusions: This quarantine period can be considered as an extreme example of immediate sedentary and isolation effects on people. Home habits such as basic physical activity, circadian rhythm routine, proper diet, and correct information consumption can be useful to increase our resilience in difficult times like the current one, but also in our next future

Predicting the Clustering of X-Ray Selected Galaxy Clusters in Flux-Limited Surveys

(abridged) We present a model to predict the clustering properties of X-ray clusters in flux-limited surveys. Our technique correctly accounts for past light-cone effects on the observed clustering and follows the non-linear evolution in redshift of the underlying DM correlation function and cluster bias factor. The conversion of the limiting flux of a survey into the corresponding minimum mass of the hosting DM haloes is obtained by using theoretical and empirical relations between mass, temperature and X-ray luminosity of clusters. Finally, our model is calibrated to reproduce the observed cluster counts adopting a temperature-luminosity relation moderately evolving with redshift. We apply our technique to three existing catalogues: BCS, XBACs and REFLEX samples. Moreover, we consider an example of possible future space missions with fainter limiting flux. In general, we find that the amplitude of the spatial correlation function is a decreasing function of the limiting flux and that the EdS models always give smaller correlation amplitudes than open or flat models with low matter density parameter. In the case of XBACs, the comparison with previous estimates of the observational spatial correlation shows that only the predictions of models with Omega_0m=0.3 are in good agreement with the data, while the EdS models have too low a correlation strength. Finally, we use our technique to discuss the best strategy for future surveys. Our results show that the choice of a wide area catalogue, even with a brighter limiting flux, is preferable to a deeper, but with smaller area, survey.Comment: 20 pages, Latex using MN style, 11 figures enclosed. Version accepted for publication in MNRA

The luminosity function and the rate of Swift's Gamma Ray Bursts

We invert directly the redshift - luminosity distribution of observed long Swift GRBs to obtain their rate and luminosity function. Our best fit rate is described by a broken power law that rises like (1+z)^2.1{+0.5-0.6} for 0<z<3 and decrease like (1+z)^-1.4{+2.4-1.0} for z>3. The local rate is 1.3^{+0.6-0.7} [Gpc^-3 yr^-1]. The luminosity function is well described by a broken power law with a break at L* = 10^52.5{+-0.2}[erg/sec] and with indices alpha = 0.2^{+0.2-0.1} and beta = 1.4^{+0.3-0.6}. The recently detected GRB 090423, with redshift ~8, fits nicely into the model's prediction, verifying that we are allowed to extend our results to high redshifts. While there is a possible agreement with the star formation rate (SFR) for z<3, the high redshift slope is shallower than the steep decline in the SFR for 4<z. However we cannot rule out a GRB rate that follows one of the recent SFR models.Comment: Significantly revised version, including a comparison of the GRB rate to new results on the SFR, revisions in response to the referee comments and comparison with other works on the GRB rate. 28 pages, 14 figures, 5 tables. MNRAS