The key enzyme for mannosylglyceramide synthesis in Rhodothermus marinus

Mestrado em Biologia AplicadaNa presença de elevadas concentrações de sal no meio de cultura a bactéria halotermofílica Rhodothermus marinus acumula no interior das células compostos orgânicos de baixo peso molecular designados solutos compatíveis. Nestas condições e à temperatura de 65 ºC, este organismo acumula elevados níveis de manosilgliceramida (MGA) e manosilglicerato (MG) e níveis mais baixos de trealose, glutamato e glucose. O soluto manosilgliceramida é um derivado de manosilglicerato no qual o OH do grupo carboxílico é substituído por um grupo amino. Este soluto com carga neutra foi detectado pela primeira vez por RMN na bactéria R. marinus e, até ao momento, não há registo da sua presença ou acumulação em nenhum outro microorganismo. A forma como a bactéria R. marinus gere o seu metabolismo por forma a sintetizar este soluto permanece uma incógnita. Em R. marinus, os dois genes localizados imediatamente a seguir aos dois genes envolvidos na biossíntese de MG codificam duas enzimas, uma identificada como uma “hypothetical protein” com um domínio pertencente à família Acetil transferases e a outra identificada como uma aminoácido desidrogenase. No presente trabalho estudou-se a possibilidade de a enzima aminoácido desidrogenase ser responsável pela libertação de um grupo amino a partir de um aminoácido e a possibilidade da “hypothetical protein” ser responsável pela transferência desse grupo amino para a molécula de manosilglicerato (molécula carregada negativamente) ou para o intermediário fosforilado, o manosil-3-fosfoglicerato (MPG), percursor de manosilglicerato. Realizaram-se ensaios enzimáticos usando extractos celulares de R. marinus e testaram-se diferentes substratos com o objectivo de detectar a síntese de MGA. O produto das reacções foi separado e analisado por cromatografia de camada fina (TLC). O gene que codifica a “hypothetical protein” foi clonado e expresso na estirpe E. coli BL21. Simultaneamente, estudou-se a viabilidade de a estirpe CC-16 de T. thermophilus, uma estirpe naturalmente competente, ser um hospedeiro termofílico adequado para expressão dos genes responsáveis pela síntese de MG e, desta forma perspectivar também a sua utilização como hospedeiro para a sobreprodução do soluto raro, manosilgliceramida. ABSTRACT: The halothermophilic bacterium Rhodothermus marinus has been described to accumulate intracellular solutes at high salt concentrations in the growth medium. In this condition at a temperature of 65ºC this organism accumulates high levels of mannosylglyceramide (MGA) and mannosylglycerate (MG) and low levels of trehalose, glutamate and glucose. Mannosylglyceramide, an ammonia derivative of mannosylglycerate (MG), is an uncharged compatible solute first detected by NMR and, thus far, was only found to accumulate in R. marinus. However, the orchestration of the metabolism of R. marinus for the biosynthesis of this solute remains unknown. In R. marinus, the two genes immediately downstream the genes involved in MG biosynthesis encode two enzymes, one identified as a hypothetical protein with a motif belonging to acetyl transferases family and the other identified as an amino acid dehydrogenase. We investigated the possibility of the later enzyme be the responsible for the release of an amino group from an amino acid donor and the former for the transfer of amino group for MG (negative charge molecule)r for the mannosyl-3-phosphoglycerate (MPG) the phosphorylated precursor of MG. The enzyme assays to detect the production of MGA were carried out using cell extracts of R. marinus. Products were separated and analysed by thin layer chromatography (TLC). Moreover the gene encoding the hypothetical protein was cloned and expressed in E. coli BL21. In parallel, we studied the viability of the genetic amenable T. thermophilus strain CC-16 be a suitable thermophilic host to express genes for the synthesis of MG, prospecting its utilization as a host for the overproduction of the rare solute mannosylglyceramide

The osmoadaptative strategy of two slightly halophilic planctomycetes species

Tese de doutoramento em Biociências, na especialidade de Microbiologia, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de CoimbraPlanctomycetes belong to a deep-branching group of Bacteria widely distributed in terrestrial and aquatic environments. The most intriguing features of the Planctomycetes are the multiplication by budding, the intracellular complex compartmentalization and the apparent lack of peptidoglycan in their cell walls. Such unusual characteristics increased their relevance in areas of research such as, evolution, cell biology, ecology and genomics. The two mesophilic and heterotrophic representatives of the phylum Planctomycetes used in this study were cultured from aquatic environments with highly contrasting characteristics; Gimesia maris (formerly named Planctomyces maris) was isolated from the estuarine system Puget Sound (Washington) in the Pacific Ocean and Rubinisphaera brasiliensis (formerly named Planctomyces brasiliensis) was obtained from Lagoa Vermelha, a salt pit near Rio de Janeiro, Brazil. Considering that G. maris and R. brasiliensis are distinct aquatic microorganisms, both species possess biochemical strategies that enable them to thrive under such conditions. The accumulation of organic molecules named compatible solutes is a common strategy among Bacteria to compensate lower extracellular water potential imposed by salt. The compatible solutes act as cell protectors without detrimental effects on normal cell metabolism. When present in the surrounding medium, compatible solutes can be taken up from the environment whereas their unavailability leads to de novo synthesis. Besides the Planctomycetes peculiar phylogenetic position, complete genomes available and distribution in several environments, the physiological mechanisms present in these organisms for the adaptation to diverse ecosystems are still poorly understood. Thus, the intracellular compatible solutes content from the slightly halophilic G. maris and R. brasiliensis species was analysed in detail in response to stressful conditions. For osmoadaptation both species accumulated α-glutamate, sucrose, ectoine and hydroxyectoine. In G. maris, α-glutamate remained the major solute at both sub-optimum and supra-optimum salinities, whereas in R. brasiliensis the levels of this amino acid were almost unchanged during growth at different salinities. Thus, the higher salt tolerance showed by R. brasiliensis could be related to the high ectoine concentration, which led to a much higher total compatible solutes content in the cells under supra-optimum salinities. In addition, sucrose up-regulation under nitrogen privation and during hyper-osmotic shock confirmed the osmoadaptation role of this disaccharide in R. brasiliensis. Surprisingly, sucrose became the major solute under nitrogen-limiting conditions suggesting that this disaccharide could be advantageous for cell revival after nitrogen reposition. In contrast, G. maris began to accumulate glucosylglycerate (GG) under nitrogen-limiting conditions. Thus, the accumulation of compatible solutes was intensively studied in G. maris under different stress conditions but the accumulation of GG was not detected in the presence of a nitrogen source. The identification of GG accumulation in G. maris specifically under nitrogen limiting conditions prompted us to analyse the transcript abundance of key genes known for the biosynthetic pathways of GG. Among them are a gpgS and a gpgP genes coding for a glucosyl-3-phosphoglycerate synthase and phosphatase, respectively, which are involved in the synthesis of GG by the common two-step pathway. Those genes are located in the G. maris genome as an operon-like structure along with a spasE gene coding for a putative sucrose phosphorylase (Spase), which we hypothesized to be involved in G. maris survival under nitrogen-limiting conditions. Via reverse transcription of total RNA from G. maris and subsequent qPCR analysis using suitable reference genes selected in this study, the transcript abundance of the biosynthetic genes was quantified in cells under hyper-osmotic shock or under nitrogen-limiting conditions. A clear dependence of the transcripts of gpgS and spasE genes to the shock treatment was shown with up-regulation under nitrogen-limiting conditions, suggesting a role for the putative Spase under those environmental conditions. The biosynthesis of GG under nitrogen-limiting conditions confirms the increase in gpgS transcript abundance and suggest that the synthesis of this glycerate-derivative is limited at first, by the transcriptional level of the gpgS gene. The production of GG and sucrose is therefore, mainly dependent on lower availability of a nitrogen source and subordinated to the osmolarity.Os Planctomycetes constituem um grupo do domínio Bacteria de origem ancestral, amplamente distribuídos por ecossistemas terrestres e aquáticos. A multiplicação por gemulação, a estrutura celular compartimentalizada e a aparente ausência de peptidoglucano na parede celular são características determinantes dos Planctomycetes. Estas características apresentam relevância crescente em vários domínios científicos, como a evolução, biologia celular, ecologia e genómica. Os dois organismos em estudo são espécies mesófilas, heterotróficas, representativas do filo Planctomycetes, isoladas de ambientes aquáticos com características distintas, uma vez que Gimesia maris (anteriormente denominada Planctomyces maris) foi isolada do estuário Puget Sound em Washington e banhado pelo Oceano Pacifico e Rubinisphaera brasiliensis (anteriormente denominada Planctomyces brasiliensis) foi obtida da Lagoa Vermelha, uma lagoa hipersalina próxima do Rio de Janeiro no Brasil. Considerando que G. maris e R. brasiliensis são espécies de ambientes aquáticos distintos, ambas possuem estratégias bioquímicas que lhes permitam prosperar nesses ambientes. A acumulação de moléculas orgânicas designadas, solutos compatíveis é uma estratégia utilizada por diferentes organismos permitindo o equilíbrio osmótico das células. Os solutos compatíveis conferem proteção osmótica às células sem interferir com o metabolismo celular. Os solutos podem ser obtidos do exterior, quando presentes ou sintetizados pelas células em resposta a condições ambientais desfavoráveis. Apesar da posição filogenética do filo Planctomycetes, da disponibilidade de genomas completos de alguns representantes deste filo e da distribuição por diferentes ecossistemas, pouco se sabe sobre os mecanismos fisiológicos presentes nestes organismos para a adaptação a diferentes condições ambientais. Desta maneira, a acumulação de solutos foi analisada em G. maris e R. brasiliensis durante a resposta a condições de agressão osmótica. Em ambas as espécies, os solutos envolvidos na osmoadaptação são: α-glutamato, sacarose, ectoína e hidroxiectoína. Em G. maris, o α-glutamato permaneceu como soluto maioritário em condições de agressão sub-osmótica e supra-osmótica por outro lado, em R. brasiliensis os níveis deste aminoácido mantiveram-se quase inalterados em todas as salinidades testadas. A tolerância a salinidades mais elevadas demonstrada por R. brasiliensis estará relacionada com o aumento dos níveis de ectoína, que consequentemente aumentaram a concentração total de solutos nas células em condições de agressão supra-osmótica. Determinou-se ainda que a acumulação de sacarose é induzida pela ausência de azoto e em combinação com condições de agressão híper-osmótica, confirmando a importância deste dissacárido na osmoadaptação de R. brasiliensis. Para além disso, a sacarose foi o soluto maioritário durante a ausência de azoto, podendo conferir proteção às células, quando a fonte de azoto for reposta, de modo a retomarem rapidamente o normal metabolismo celular. Por outro lado, G. maris acumula glucosilglicerato (GG) durante a ausência de azoto. Deste modo, a acumulação deste soluto foi estudada em G. maris submetido a diferentes salinidades e combinado com diferentes condições de azoto mas este organismo não acumula GG na presença de fonte de azoto. A acumulação de GG por G. maris apenas na ausência de azoto levou-nos a analisar os níveis de transcrição de genes que codificam para a síntese de GG. Entre eles encontram-se os genes gpgS e gpgP que codificam para uma glucosil-3-fosfoglicerato sintetase e glucosil-3-fosfoglicerato fosfatase, respetivamente, que estão envolvidas na síntese de dois passos de GG em diferentes microrganismos. No genoma de G. maris, estes dois genes estão organizados numa estrutura semelhante a um operão juntamente com o gene spasE que codifica para uma provável sacarose fosforilase (Spase) e que possivelmente estará envolvida na sobrevivência de G. maris durante a ausência de azoto. Através da transcrição reversa do ARN total de G. maris e subsequente análise por qPCR usando genes de referência selecionados neste estudo, a abundância de transcritos da sequência codificante dos diferentes genes foi quantificada em células durante choque híper-osmótico ou durante a ausência de azoto. Demonstrou-se que a transcrição dos genes gpgS e spasE são dependentes do choque a que G. maris for exposto e que esta é induzida durante a ausência de azoto, sugerindo um papel importante da Spase em ambientes com baixa disponibilidade de azoto. A síntese de GG na ausência de azoto confirma a indução da transcrição do gene gpgS e sugere que a síntese de GG é limitada numa primeira fase pela abundância do transcrito do gene gpgS. A produção de GG e sacarose é por isso essencialmente dependente da baixa disponibilidade de uma fonte de azoto e subordinada pela osmolaridade

Characterisation of microbial attack on archaeological bone

As part of an EU funded project to investigate the factors influencing bone preservation in the archaeological record, more than 250 bones from 41 archaeological sites in five countries spanning four climatic regions were studied for diagenetic alteration. Sites were selected to cover a range of environmental conditions and archaeological contexts. Microscopic and physical (mercury intrusion porosimetry) analyses of these bones revealed that the majority (68%) had suffered microbial attack. Furthermore, significant differences were found between animal and human bone in both the state of preservation and the type of microbial attack present. These differences in preservation might result from differences in early taphonomy of the bones. © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved