Effect of antineoplastic agents on the expression of human telomerase reverse transcriptase b plus transcript in MCF-7 cells

Abstract Objectives: To evaluate the effect of antineoplastic agents on the expression of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) splice variants in MCF-7 cells. Design and methods: We have developed a luminometric hybridization assay for hTERT beta plus transcript. MCF-7 cells were isolated before and after treatment with antineoplastic agents. A combination of nested RT-PCR and the developed luminometric hybridization assay was used for the specific detection of hTERT beta plus transcript in treated and untreated MCF-7 cells. Amplification of all hTERT splicing variants by nested PCR in the same samples was also performed. Results: MCF-7 cells treated with taxol and etoposide were found positive for all hTERT splicing variants, while the expression of hTERT beta plus transcript did not differ significantly before and after exposure. MCF-7 cells treated with doxorubicin and 5-fluorouracil did not express any of hTERT splicing variants. In the presence of cisplatin, three splicing variants of hTERT were detected. Conclusions: The developed hybridization assay is highly sensitive and specific for the detection of hTERT beta plus transcript in clinical samples

Формирование эмоциональной культуры как компонента инновационной культуры студентов

Homozygosity has long been associated with rare, often devastating, Mendelian disorders1 and Darwin was one of the first to recognise that inbreeding reduces evolutionary fitness2. However, the effect of the more distant parental relatedness common in modern human populations is less well understood. Genomic data now allow us to investigate the effects of homozygosity on traits of public health importance by observing contiguous homozygous segments (runs of homozygosity, ROH), which are inferred to be homozygous along their complete length. Given the low levels of genome-wide homozygosity prevalent in most human populations, information is required on very large numbers of people to provide sufficient power3,4. Here we use ROH to study 16 health-related quantitative traits in 354,224 individuals from 102 cohorts and find statistically significant associations between summed runs of homozygosity (SROH) and four complex traits: height, forced expiratory lung volume in 1 second (FEV1), general cognitive ability (g) and educational attainment (nominal p<1 × 10−300, 2.1 × 10−6, 2.5 × 10−10, 1.8 × 10−10). In each case increased homozygosity was associated with decreased trait value, equivalent to the offspring of first cousins being 1.2 cm shorter and having 10 months less education. Similar effect sizes were found across four continental groups and populations with different degrees of genome-wide homozygosity, providing convincing evidence for the first time that homozygosity, rather than confounding, directly contributes to phenotypic variance. Contrary to earlier reports in substantially smaller samples5,6, no evidence was seen of an influence of genome-wide homozygosity on blood pressure and low density lipoprotein (LDL) cholesterol, or ten other cardio-metabolic traits. Since directional dominance is predicted for traits under directional evolutionary selection7, this study provides evidence that increased stature and cognitive function have been positively selected in human evolution, whereas many important risk factors for late-onset complex diseases may not have been

Molecular detection of cancer cells in the peripheral blood of patients with breast cancer: comparison of CK-19, CEA and MASPIN as detection markers

The purpose of this study was to investigate and compare the diagnostic value of the detection of cytokeratin 19 (CK-19), carcinoembryonic antigen (CEA) and maspin mRNA by nested RT-PCR in the peripheral blood of women with breast cancer and to develop a highly sensitive quantitative RT-PCR hybridization assay for the determination of CK-19 mRNA in peripheral blood. The tumor cell lines MCF-7 and LOVO were used in an experimental tumor cell dilution model to determine the sensitivity of the nested RT-PCR for the 3 detection markers. RT-PCR for mRNA of CK-19, CEA and maspin was performed in the peripheral blood of 54 female healthy blood donors, 28 patients with hematologic malignancies, 31 with metastatic colorectal cancer, 75 with operable and 50 with metastatic breast cancer before receiving any cytotoxic chemotherapy. Nested RT- PCR for CK-19 mRNA presented the highest sensitivity by detecting 1 tumor cell amongst IO6 PBMC in 4 out of 5 experiments. CK-19 mRNA was detected in the peripheral blood of 3.7% of healthy blood donors, 14.3% of hematologic malignancies, 33.3% of operable and 42% of metastatic breast cancer patients. CEA mRNA was undetectable in female blood donors and was detected in blood samples of 3.5% of hematologic malignancies, 19.3% of colorectal cancer and 10% of breast cancer patients. Maspin mRNA was detected in 10.6% of operable and 14% of metastatic breast cancer patients. Maspin mRNA positivity correlated with tumor size in patients with early breast cancer (p= 0.027). Subsequently, peripheral blood from 148 patients with operable (stage I and II) breast cancer, obtained before the initiation of any adjuvant therapy, was tested for the presence of CK-19 mRNA-positive cells. For patients with stage I and II breast cancer, the detection of CK-19-positive cells in the peripheral blood before adjuvant therapy was associated with a 6-fold increased risk of relapse (p=0.001). In multivariate analysis, only the presence of CK-19 mRNA-positive cells in the peripheral blood and the number of involved axillary lymph nodes (≥ 4 lymph nodes) were independent prognostic factors associated with an increased risk of disease relapse. Conversely, the Cox proportional hazard analysis indicated that the detection of CK-19 mRNA-positive cells in the peripheral blood, the number of involved axillary lymph nodes and the status of ER expression by the tumor were the only important factors affecting the duration of DFT. Our results demonstrate that RT-PCR positivity for CK-19 mRNA is the most sensitive detection marker for tumor cells in operable and metastatic breast cancer and appropriate for use in clinical practice, although nested RT-PCR for maspin mRNA appears to be more specific. The molecular detection of CK-19 mRNA-positive cells by RT-PCR in the peripheral blood of patients with stage I and II breast cancer before the initiation of adjuvant therapy has an independent prognostic value as a marker of poor clinical outcome. We have also developed a highly sensitive quantitative RT-PCR hybridization assay for the determination of CK-19 mRNA in peripheral blood. Quantitation is based on the coamplification of CK-19 mRNA with a recombinant CK-19 RNA internal standard (CK-19 RNA-IS) through RT-PCR. The biotinylated amplification products are immobilized on streptavidin coated wells, hybridized with digoxigenin labeled probes and determined through an anti-digoxigenin antibody conjugated to alkaline phosphatase by luminometric detection. The hybridization assay was validated with samples containing total RNA from known amounts of CK-19 expressing cells (MCF-7) in the presence of total RNA isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMN) of healthy controls and a constant amount of CK-19 RNA-IS. Luminescence ratios for CK-19 mRNA and CK-19 RNA-IS were linearly related to the primary number of MCF-7 we had used. The overall reproducibility of the assay (between-run) varied between 7.4 and 24%. The method can clearly distinguish 10 MCF-7 cells (protocol A) and 1 MCF-7 cell (protocol B) in the presence of 106 normal PBMN and is highly specific as none of the healthy controls tested (n = 26) had detectable CK-19 mRNA levels, while 6 out of 14 breast cancer patients, with verified metastasis and under chemotherapy, were found positive.Στα πλαίσια αυτής της εργασίας ανήκει η ανάπτυξη και κλινική αξιολόγηση υπερευαίσθητων μεθόδων μοριακής διαγνωστικής για την πρώιμη ανίχνευση νεοπλασματικών κυττάρων στο αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού, όπως επίσης και η ανάπτυξη μεθοδολογίας για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA ενός μοριακού δείκτη καρκίνου μαστού, της κυτταροκερατίνης 19 (CK-19), στο αίμα ασθενών με καρκίνο μαστού. Αρχικά πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη ανίχνευσης του mRNA των καρκινικών δεικτών CK-19, CEA και Maspin στο περιφερικό αίμα (ΡΒΜΝ) ασθενών με νεοπλασίες με τη μέθοδο RT-PCR, και η συσχέτισή της με άλλους κλινικοπαθολογικούς παράγοντες σε ασθενείς με πρώιμο καρκίνο μαστού, πριν και μετά τη συμπληρωματική θεραπεία, όπως επίσης και με το ελεύθερο νόσου διάστημα. Βάσει των αποτελεσμάτων, η CK-19 και η Maspin ήταν οι πιό ευαίσθητες (ανιχνεύοντας μέχρι και 1 MCF-7 κύτταρο στα ΙΟ6 ΡΒΜΝ κύτταρα) συγκριτικά με το CEA (ανιχνεύοντας μέχρι και 10 COLO-205 κύτταρα στα ΙΟ6 ΡΒΜΝ κύτταρα). Όσον αφορά την ειδικότητα των μεθόδων, η CK-19 έδωσε ένα πολύ χαμηλό ποσοστό θετικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα των υγιών αιμοδοτών (3.7%), ενώ στα δείγματα του καρκίνου του μαστού έδωσε θετικό αποτέλεσμα για το 42% των δειγμάτων. To CEA, ενώ δεν ανιχνεύεται στα ΡΒΜΝ κύτταρα των υγιών αιμοδοτών, δε φαίνεται να παρουσιάζει υψηλή ειδικότητα για τον καρκίνο του μαστού (10%), σε αντίθεση με τον καρκίνο του παχέος εντέρου (19.3%). Η ανίχνευση του mRNA της Maspin παρουσιάζει, επίσης υψηλή ειδικότητα αφού δίνει αρνητικό αποτέλεσμα για ΡΒΜΝ δείγματα υγιών αιμοδοτών, ασθενών με αιματολογικές κακοήθειες και ασθενών με μεταστατικό καρκίνο παχέος εντέρου, ενώ για τους ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο μαστού δίνει ένα ποσοστό 14%. Τέλος πραγματοποιήθηκε ανίχνευση θετικών κυττάρων για το mRNA της CK-19 στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο του μαστού (n=148) σε πρώιμο στάδιο, πριν την έναρξη της συμπληρωματικής θεραπείας και η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η ανίχνευση του CK-19 mRNA δε συσχετίζεται με κανέναν από τους κλασσικούς προγνωστικούς παράγοντες. Συσχετίζοντας τον κίνδυνο υποτροπής των ασθενών με την παρουσία ή μη θετικών κυκλοφορούντων κυττάρων στο περιφερικό αίμα για το mRNA της CK-19, τα ποσοστά των ασθενών που υποτροπίασαν είναι αντίστοιχα 27.3% και 6.7%, με στατιστικά σημαντική διαφορά (p=0.001). Αυτή η ανάλυση υποδεικνύει ότι οι CK-19 mRNA+ ασθενείς έχουν κατά περίπου 6 φορές υψηλότερο κίνδυνο να υποτροπιάσει η νόσος από αυτόν των CK-19 mRNA- ασθενών. Επιπλέον, η ανίχνευση CK-19 mRNA+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα σχετίζεται και με μειωμένο ελεύθερου νόσου διάστημα (p=0.001). Η πολυπαραγοντική μελέτη έδειξε πως μόνο η παρουσία CK-19 mRNA- Θετικών κυττάρων στο περιφερικό αίμα και ο αριθμός των διηθημένων μασχαλιαίων λεμφαδένων (≥ 4) αποτελούν ανεξάρτητους προγνωστικούς παράγοντες, σχετιζόμενοι και με αυξημένο κίνδυνο υποτροπής (p=0.042). Επιπλέον επεξεργασία των στοιχείων εφαρμόζοντας την ανάλυση παλινδρόμησης του Cox έδειξε πως εκτός από την ανίχνευση θετικών κυττάρων για το CK-19 mRNA στο περιφερικό αίμα των ασθενών (p=0.001) και τον αριθμό των διηθημένων λεμφαδένων (≥ 4 LN+) (p=0.038), σημαντική επίδραση στο ελεύθερο νόσου διάστημα παρουσιάζει και η κατάσταση των οιστρογονικών υποδοχέων (ER-) (p=0.042). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα η CK-19 αποτελεί ένα σημαντικό παράγοντα πρόβλεψης, ιδιαίτερα για τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού σε πρώιμο στάδιο που δεν παρουσιάζουν διήθηση λεμφαδένων. Το δεύτερο τμήμα της παρούσας μελέτης περιλαμβάνει την ανάπτυξη και αξιολόγηση μεθόδου ποσοτικού προσδιορισμού του mRNA της CK-19 στο περιφερικό αίμα ασθενών με καρκίνο μαστού. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε αποτελεί συνδυασμό της ανταγωνιστικής RT- PCR (πρωτόκολλο Α) ή και nested-PCR (πρωτόκολλο Β) και δοκιμασίας υβριδισμού σε μικροπλακίδια με χημειοφωταυγή ανίχνευση. Βασίζεται στην ταυτόχρονη ενίσχυση του mRNA της CK-19 με ένα ανασυνδυασμένο, ειδικά σχεδιασμένο εσωτερικό πρότυπο, ανάλογο του mRNA της CK-19, με τη μέθοδο της RT-PCR. Το εσωτερικό πρότυπο (RNA-IS) συνετέθει μέσω PCR αντιδράσεων, είναι του ίδιου μεγέθους και διαθέτει τις ίδιες θέσεις αναγνώρισης των εκκινητών με το mRNA της CK-19, ενώ διαφέρουν ως προς μια κεντρική αλληλουχία 21 βάσεων. Τα προϊόντα της RT-PCR επισημαίνονται με βιοτίνη μέσω κατάλληλων εκινητών και ακινητοποιούνται σε φρεάτια επικαλυμμένα με στρεπταβιδίνη. Τα ακινητοποιημένα υβρίδια ανιχνεύονται μέσω αντισωμάτων, συζευγμένων με αλκαλική φωσφατάση, έναντι της διγοξιγενίνης και ενός χημειοφωταυγούς υποστρώματος. Ο λόγος των αναλυτικών σημάτων (ένταση χημειοφωταύγειας) για την CK-19 και το εσωτερικό πρότυπο είναι ανάλογος του αριθμού των μορίων του mRNA της CK-19 στο δείγμα πριν την αντίδραση RT-PCR, το οποίο και αντιστοιχεί σε ένα σχετικό αριθμό κυττάρων. Η μέθοδος αναπτύχθηκε και βελτιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας RNA δείγματα της καρκινικής κυτταρικής σειράς MCF-7. Οι λόγοι των αναλυτικών σημάτων του CK-19 RNA και του CK-19 mRNA-IS ήταν γραμμικά ανάλογοι με τον αρχικό αριθμό των MCF-7 κυττάρων που χρησιμοποιήθηκαν. Η εντός προσδιορισμού επαναληπτικότητα της μεθόδου, περιλαμβάνοντας το σύνολο της πειραματικής διαδικασίας, ήταν μεταξύ 7.4-24%. Τα όρια ανίχνευσης των δύο πρωτοκόλλων είναι τα 10 και το 1 καρκινικό κύτταρο στο 1x106 φυσιολογικά κύτταρα, αντίστοιχα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου δοκιμάστηκε σε μελέτη 26 φυσιολογικών δειγμάτων, όπου δεν ανιχνεύθηκε CK19-mRNA, ενώ σε δείγματα 14 ασθενών σε μεταστατικό στάδιο της νόσου το αποτέλεσμα (42.8%) φανερώνει την κλινική σημασία της εφαρμογή της

Detection of Mammaglobin A-mRNA-positive circulating tumor cells in peripheral blood of patients with operable breast cancer with nested RT-PCR.

The development and validation of a nested RT-PCR methodology for the detection of Mammaglobin A-mRNA-positive circulating tumor cells in peripheral blood of patients with operable breast cancer and evaluation of its prognostic significance.info:eu-repo/semantics/publishe

Health in crises. Migration, austerity and inequalities in Greece and Europe: introduction to the supplement

This introduction summarizes and discusses the main findings of the supplement ‘Health in crises. Migration, austerity and inequalities in Greece and Europe’ to the European Journal of Public Health. The supplement applies data from the ESS (2014) health module in combination with the MIGHEAL study, which is a new source of data on the Greek population specially designed to examine health inequalities among and between migrants and natives. This has enabled the authors of the nine articles that constitute this supplement to address several pressing issues about the distribution of health and its determinants in Greece and other European countries. The main finding of the present supplement is the exceptionally high rates of reported depressive symptoms across the whole population residing in Greece and particularly among women. Levels of unmet need for healthcare were also found to be alarmingly high in Greece compared with other European countries, suggesting that the crisis and subsequent austerity policies may have impacted the provision of healthcare services and access to healthcare for broad sections of the population, whether native or migrant.publishedVersion© The Author(s) 2018. Published by Oxford University Press on behalf of the European Public Health Association. All rights reserved. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), which permits unrestricted reuse, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited

Health inequalities among migrant and native-born populations in Greece in times of crisis: the MIGHEAL study

This article presents the MIGHEAL study, which was developed in parallel with the European Social Survey (ESS) Round 7 (2014). Conducted in Greece in 2016 by the National Centre for Social Research, the study was specifically designed to further our understanding of how health varies by social status, focusing particularly on migrant status. In the current article, we report results on health status (non-communicable diseases, self-reported health and depressive symptoms) and health determinants (risky health behaviours, social determinants and access to health care) in Greece, among migrants and native-born. Estimates for the Greek overall population are compared with the European ones (using the ESS 2014 data) and discussed with reference to the ongoing economic and social crisis in Greece. The study provides evidence of social inequalities in health, complementing the pan-European documentation, and supports prior research, which has identified negative health consequences of the crisis

Different prognostic value of cytokeratin-19 mRNA positive circulating tumor cells according to estrogen receptor and HER2 status in early-stage breast cancer.

PURPOSE: To examine the prognostic value of cytokeratin-19 (CK-19) mRNA-positive circulating tumor cells (CTCs) in early-stage breast cancer patients focusing on clinically relevant subgroups based on estrogen receptor (ER) and HER2 expression. PATIENTS AND METHODS: CK-19 mRNA-positive CTCs were detected by real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction in the blood of 444 consecutive, stage I-III, breast cancer patients before initiation of adjuvant chemotherapy. The association between detection of CK-19 mRNA-positive CTCs and clinical outcome was analyzed for patients with ER-positive, ER-negative, triple-negative, HER2-positive, and ER-positive/HER2-negative tumors. RESULTS: CK-19 mRNA-positive CTCs were detected in 181 (40.8%) of 444 patients; 109 (41.9%) of 260 patients with ER-positive tumors; 71 (40.6%) of 175 patients with ER-negative tumors; 27 (35%) of 77 patients with triple-negative tumors; 35 (39.8%) of 88 patients with HER2-positive tumors; and 82 (44.1%) of 186 patients with ER-positive/HER2-negative tumors. After a median follow-up of 53.5 months, patients with CK-19 mRNA-positive CTCs experienced reduced disease-free survival (DFS; P < .001) and overall survival (OS; P < .001); this was mainly observed in patients with ER-negative (P < .001 and P < .001, respectively) but not ER-positive tumors (P = .172 and P = .425, respectively) and in patients with triple-negative (P = .008 and P = .001, respectively) and HER2-positive (P = .023 and P = .040, respectively) but not ER-positive/HER2-negative tumors (P = .210 and P = .578, respectively). In multivariate analysis, the interaction between CK-19 mRNA-positive CTCs and ER status was the strongest independent prognostic factor for reduced DFS (hazard ratio [HR], 3.808; 95% CI, 2.415 to 6.003; P < .001) and OS (HR, 4.172; 95% CI, 2.477 to 9.161; P < .001). CONCLUSION: Detection of CK-19 mRNA-positive CTCs before adjuvant chemotherapy predicts poor clinical outcome mainly in patients with ER-negative, triple-negative, and HER2-positive early-stage breast cancer.Journal ArticleSCOPUS: ar.jinfo:eu-repo/semantics/publishe