Regulation of HPGD and SLCO2A1 in Colorectal Cancer Development

A wide range of lipid mediators are synthesised from Polyunsaturated Fatty Acids. These mediators regulate inflammation and many other processes in the human body, and perturbation of their signalling can contribute to the survival and proliferation of cancer cells. Prostaglandin E2 has the most diverse range of functions amongst the prostaglandins and other lipid mediators, and increased PGE2 signalling has been associated with promoting tumour growth and survival by a number of mechanisms. NSAIDs target the synthesis side of the prostaglandin pathway through PTGS2, but only recently has the importance of the degradation component, involving the enzyme HPGD and prostaglandin transporter SLCO2A1 been discovered. Although a number of publications have shown that HPGD is downregulated in colorectal cancer, in addition to other malignancies, the mechanisms by which this takes place remain unclear. Only a few studies have indicated a comparable role for SLCO2A1, and the potential for these two genes to be co-regulated. Therefore, understanding how these two genes are regulated could reveal the mechanisms by which their expression is lost, and potentially how they could be upregulated to complement the action of NSAIDs when used prophylactically, or as an adjunct to chemotherapy. HPGD and SLCO2A1 expression was characterised, and the genes’ transcriptional start sites identified using two colorectal cancer cell lines. This information was used to design and carry out a promoter deletion series, which revealed the importance of the proximal 364 bp SLCO2A1 promoter region in driving transcription. Further analysis of this region revealed a possible role for the intestinal and colonic epithelium-specific transcription factor CDX2 for driving SLCO2A1 expression. Further experiments provided evidence to suggest that the TGF-β pathway, which is known to drive HPGD expression, may also co-regulate SLCO2A1

SIREN – A network infrastructure for emergencies.

The SIREN project (Secure, Interoperable, UAV-assisted, Rapid Emergency Deployment Communication and sensing Infrastructure) implements a secure, distributed, open, self-configured and emergency-aware network and service platform for automated, secure and dependable support of multiple mission critical applications in highly demanding and dynamic emergency environments

Υπολογισμός της εντροπίας διεμπλοκής σε συστήματα ταλαντωτών και στη θεωρία πεδίου

Στην παρούσα διπλωματική εργασία διαπραγματευόμαστε το θέμα της εντροπίας διεμπλοκής σε συστήματα συζευγμένων ταλαντωτών και σε βαθμωτή θεωρία πεδίου. Ξεκινάμε αναλύοντας την έννοια της κβαντικής διεμπλοκής και ένα μέτρο της, την εντροπία διεμπλοκής. Έπειτα, βρίσκουμε την εντροπία διεμπλοκής σε συστήματα 2 και N συζευγμένων ταλαντωτών με σκοπό να γενικευθούν αυτά τα αποτελέσματα στη θεωρία πεδίου. Στη συνέχεια βρίσκουμε την εντροπία διεμπλοκής στη θεωρία πεδίου και δείχνουμε ότι η κύρια συνεισφορά σε αυτήν είναι ανάλογη του εμβαδού της διαχωριστικής επιφάνειας που ορίζει τα δύο υπό μελέτη διεμπλεγμένα υποσυστήματα. Έπειτα μελετάμε ένα τριχοτομημένο σύστημα και βρίσκουμε ότι και σε αυτό η κύρια συνεισφορά στην εντροπία διεμπλοκής είναι ένας όρος εμβαδού, του οποίου ο συντελεστής είναι ο ίδιος με αυτόν του διχοτομημένου συστήματος που μελετήσαμε προηγουμένως. Μετά βρίσκουμε αριθμητικά τους όρους υποδεέστερης τάξης στο τριχοτομημένο σύστημα στις 2+1 διαστάσεις, προκειμένου να επιβεβαιώσουμε μία βασική ιδιότητα της εντροπίας διεμπλοκής, την ισχυρή υποαθροιστικότητα. Τέλος, αναφέρουμε κάποιες μελλοντικές προεκτάσεις που μπορούν να έχουν αυτά τα θέματα.In this thesis, we study entanglement entropy in systems of coupled harmonic oscillators and in scalar field theory. First we introduce the notion of quantum entanglement and a measure of it, namely the entanglement entropy. Then, we calculate entanglement entropy in systems of 2 and N coupled harmonic oscillators in order to generalize these results in field theory. Later, we calculate the entanglement entropy in field theory and show that the main contribution to it is proportional to the area of the separating surface that defines the two entangled subsystems under study. After that we investigate a tripartite system in 2+1 dimensions and find that the main contribution to entanglement entropy is again an area law term whose coefficient is identical to that of the bipartite system which we studied earlier. Finally, we numerically calculate the subleading terms in the tripartite system in order to verify a fundamental property of entanglement entropy, namely the strong subadditivity. We also discuss some possible extensions of this work

Διερεύνηση των επιπέδων έκφρασης microRNAs στον ορό ασθενών με επιληψία

ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ MicroRNAs ΣΤΟΝ ΟΡΟ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΕΠΙΛΗΨΙΑ Παπαγρηγορίου Μαρία Ελένη, Βιολόγος, Πανεπιστημίου Πατρών ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η επιληψία ορίζεται ως η διαταραχή του εγκεφάλου που χαρακτηρίζεται από τη διαρκή προδιάθεση για την εμφάνιση επιληπτικών κρίσεων και από τις νευροβιολογικές, γνωστικές, ψυχολογικές και κοινωνικές συνέπειες αυτής της κατάστασης, σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση κατά της Επιληψίας (International League Against Epilepsy - ΙLAE) το 2005. Πρόσφατα ωστόσο (ΙLAE 2014), διατυπώθηκε και ένας δεύτερος ορισμός με βάση τον οποίο επιληψία είναι η ασθένεια του εγκεφάλου, η οποία ορίζεται από οποιαδήποτε από τις ακόλουθες συνθήκες: i) ιστορικό δύο τουλάχιστον επεισοδίων σπασμών με περισσότερες από 24 ώρες διαφορά μεταξύ τους, ii) ένα απρόκλητο επεισόδιο σπασμών και η πιθανότητα περαιτέρω επεισοδίων με τον κίνδυνο επανεμφάνισης να αγγίζει τουλάχιστον το 60% μετά από δύο απρόκλητα επεισόδια σπασμών, που μπορεί να συμβούν μέσα στα επόμενα 10 χρόνια και iii) διάγνωση ενός επιληπτικού συνδρόμου. Η επιληψία αποτελεί μία από τις παλαιότερες καταστάσεις που έχει γνωρίσει η ανθρωπότητα, η οποία επηρεάζει άτομα όλων των ηλικιών. Υπολογίζεται ότι περίπου 50.000.000 άτομα παγκοσμίως έχουν διαγνωσθεί με επιληψία με συχνότητα εμφάνισης 24-53/100.000 σε άτομα στις αναπτυγμένες χώρες, αποτελώντας έτσι μία από τις πιο κοινές νευρολογικές διαταραχές σε παγκόσμιο επίπεδο. Τα miRNAs είναι μία κατηγορία μικρών μη κωδικών μορίων, τα οποία ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση εμποδίζοντας τη διαδικασία της πρωτεϊνικής έκφρασης και κατ’ επέκταση της μετάφρασης κυρίως με την πρόσδεσή τους στην 3’ αμετάφραστη περιοχή του mRNA στόχου. Η απορρύθμισή τους έχει συνδεθεί με ένα μεγάλο αριθμό σημαντικών ασθενειών στον ανθρώπινο οργανισμό, ανάμεσα στις οποίες συγκαταλέγεται και η επιληψία. Τα miRNAs εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στον ανθρώπινο εγκέφαλο σε σχέση με άλλα όργανα. Έχουν 103 παρατηρηθεί αλλαγές στα επίπεδα των miRNAs του εγκεφάλου μετά από παρατεταμένη επιληπτική κρίση (SE) σε πειραματικά μοντέλα. Παθολογικές διαδικασίες που διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην επιληψία, όπως ο νευρωνικός θάνατος, η φλεγμονή και η γλοίωση βρίσκονται υπό τον έλεγχο των miRNAs. Εντοπίζονται σε ένα ευρύ φάσμα ιστών και εξωκυττάριων υγρών, όπως ο ορός και το πλάσμα του αίματος και έτσι μπορούν να αξιοποιηθούν κλινικά ως νέοι βιοδείκτες για την επιληπτογένεση ή ακόμα και για την πρόγνωση της επιληψίας. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση νέων μοριακών μεθοδολογιών προσδιορισμού των επιπέδων των hsa-miR-34a και hsa-miR-146a σε δείγματα ορού ασθενών με επιληψία. Χρησιμοποιήθηκαν για το λόγο αυτό οι καρκινικές κυτταρικές σειρές DU145, BT-20, AGS και DLD-1, καθώς και 24 δείγματα ορού ασθενών με φαρμακοανθεκτική επιληψία και 24 δείγματα ορού ασθενών που δεν εμφανίζουν φαρμακοανθεκτική επιληψία. Το πειραματικό πρωτόκολλο περιλαμβάνει την απομόνωση ολικού RNA, την αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription/RT) του RNA σε cDNA με χρήση ειδικών για τα miRNA-στόχους stem-loop εκκινητές (miRNA-specific primers) και ποσοτικοποίηση των cDNA μορίων με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qReal – time PCR) με χρήση miRNA-ειδικών TaqMan-MGB ανιχνευτών (TaqMan-MGB probes). Ως ενδογενής μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε cel-miR-39. Ο έλεγχος της απόδοσης της μεθοδολογίας μας πραγματοποιήθηκε αρχικά με εφαρμογή single miR-specific reverse transcription (μονή miR-ειδικής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής) και έπειτα με multiple miR-specific reverse transcription (πολλαπλή miR-ειδικής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής) για τα cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsa-miR-34a στις τέσσερις κυτταρικές σειρές της μελέτης μας. Παρατηρήθηκε ικανοποιητική ενίσχυση των μορίων-στόχων μας, τόσο από τη χρήση της single- ,όσο και από της multiple- miR-specific reverse transcription, όπως και η απουσία φαινομένων αναστολής στις qPCR αντιδράσεις. Ωστόσο, ο έλεγχος των NCrev.transc. ανέδειξε την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων, ειδικά στην περίπτωση του hsa-miR-34a απαιτώντας την περαιτέρω βελτιστοποίηση των μεθόδων. Για τη μείωση της παραγωγής του μη ειδικού προϊόντος στη μεθοδολογία προσδιορισμού του hsa-miR-34a ακολούθησε βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης 104 των miR-ειδικών RT εκκινητών στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφή και οι εικόνες των καμπυλών ενίσχυσης σε όλες τις συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν (200nM-10nM) ήταν ικανοποιητικές. Εντούτοις ο έλεγχος των NCrev.transc. ανέδειξε και εδώ την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων κατά την μεθοδολογία προσδιορισμού του hsa-miR-34a οδηγώντας μας στο συμπέρασμα ότι απαιτείται περαιτέρω βελτιστοποίηση των μεθόδων. Ακολούθησαν λοιπόν βελτιστοποιήσεις πρώτα της συγκέντρωσης του universal ανάστροφου R εκκινητή και έπειτα του πρόσθιου F εκκινητή στη realtime qPCR αντίδραση, με στόχο τη μείωση παραγωγής μη ειδικού προϊόντος στη μεθοδολογία προσδιορισμού του hsa-miR-34a. Και στις δύο περιπτώσεις επιβεβαιώθηκε η ικανότητα προσδιορισμού του hsa-miR-34a σε όλο το εύρος των χρησιμοποιούμενων συγκεντρώσεων, ενώ ως προς την παραγωγή μη ειδικού προϊόντος παρατηρήθηκε σημαντική μείωσή του. Ο έλεγχος της απόδοσης της μεθοδολογίας μας συνεχίστηκε για τα δείγματα ορού ασθενών με επιληψία και την κυτταρική σειρα DU145, με εφαρμογή multiple miR-specific reverse transcription (πολλαπλή miR-ειδικής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής και χρήση συγκέντρωσης RT εκκινητών 20 nM ανά αντίδραση όσο και 10 nM ανά αντίδραση για τα cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsamiR- 34a. Η απόδοση της μεθόδου μας ήταν ικανοποιητική και για τις δύο συγκεντρώσεις. Για το hsa-miR-146a, παρατηρήσαμε την ικανοποιητική ενίσχυση του hsa-miR-146a στο σύνολο των δειγμάτων ορού και την κυτταρική σειρα DU145, ενώ για το hsa-miR-34a παρατηρήθηκαν καμπύλες ενίσχυσης στο σύνολο των ελεγχθέντων δειγμάτων σε σχετικά μεγάλες τιμές CT αναδεικνύοντας, είτε τη μικρή συγκέντρωσή του στον ορό των ασθενών, είτε τη μη ικανοποιητική απόδοση της μεθοδολογίας προσδιορισμού μας. Ο έλεγχος των NCrev.transc. δειγμάτων μας, ανέδειξε την ενίσχυση και μη ειδικού προϊόντος και επομένως την ανάγκη για περαιτέρω βελτιστοποίηση. Μετά από τον έλεγχο της μεθοδολογίας μας σε σύνολο 20 δειγμάτων ορού ασθενών με επιληψία επιβεβαιώθηκε η ικανοποιητική απόδοσή του σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων ακολουθώντας την ίδια μεθοδολογία προσδιορισμού με πριν. ‘Όμως η σημαντική ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων σε παρόμοια επίπεδα με την ενίσχυση του hsa-miR-34a στα δείγματα, ανέδειξε την απουσία ειδικότητας στη μεθοδολογία μας και γι’ αυτό αποφασίστηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων 105 miR-34a-ειδικών stem-loop RT εκκινητών και πρόσθιου (F) εκκινητή της real - time qPCR αντίδρασης. Ο νέος miR-34a-ειδικός stem-loop RT εκκινητής δε βελτίωσε την εικόνα σχηματισμού μη ειδικών προϊόντων της μεθόδου, όπως φάνηκε από τον έλεγχο των NCrev.transc. δειγμάτων του. Με το νέο πρόσθιο (F) εκκινητή για το hsa-miR-34a δεν παρατηρήθηκε καμπύλη ενίσχυσης στα δείγματα ορού της μελέτης μας και έτσι συμπεραίνουμε ότι δεν αποδίδει στη συγκεκριμένη περίπτωση. Συνοπτικά, αναπτύξαμε κι επικυρώσαμε τη μεθοδολογία για την ποσοτικοποίηση του hsa-miR-146a σε δείγματα ορού ασθενών με επιληψία, χρησιμοποιώντας το cel-miR-39 ως γονίδιο αναφοράς για σκοπούς κανονικοποίησης. Η ανάπτυξη ειδικής μεθόδου προσδιορισμού για το hsa-miR- 34a δεν ήταν ικανοποιητική. Απαιτούνται μελλοντικές μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών, ώστε να βελτιωθεί η εγκυρότητα για την έκφρασή του σε δείγματα ορού ασθενών με επιληψία.RESEARCH OF MicroRNAs EXPRESSION LEVELS SERUM OF PATIENTS WITH EPILEPSY Papagrigoriou Maria Eleni, Biologist, University of Patras ABSTRACT Epilepsy is a disorder of the brain characterized by an enduring predisposition to generate epileptic seizures and by the neurobiologic, cognitive, psychological and social consequences of this condition as it was defined by the International League Against Epilepsy (ILAE) in 2005. Recently though (ILAE 2014) epilepsy is also considered as a disease of the brain defined by any of the following conditions: i) at least two unprovoked (or reflex) seizures occurring >24 h apart, ii) one unprovoked (or reflex) seizure and a probability of further seizures similar to the general recurrence risk (at least 60%) after two unprovoked seizures, occurring over the next 10 years and iii) diagnosis of an epilepsy syndrome. Epilepsy is one of the oldest conditions in humanity which affects individuals of all ages. It has been reported that approximately 50,000,000 people worldwide have epilepsy, with an incidence of 24-53/100,000 in developed regions, making it one of the most common neurological diseases globally. MicroRNAs (miRNAs) is a class of small non-coding RNA which regulates gene expression by preventing the process of protein expression as they bind to the 3’-UTR of the mRNA target. Α dysregulation in their expression has been linked to a number of clinically important diseases including epilepsy. MiRNAs are highly expressed in human brain relatively to other organs. Changes to brain miRNA levels following prolonged seizures (status epilepticus) in animal models is a fact. Pathogenic situations which have main role in epilepsy such as neuronal death, inflammation and gliosis are under miRNAs’ control. They exist in a wide range of tissues and extracellular body fluids including serum and blood plasma and so they can be used for clinical purpsose as new biomarkers for epileptogenesis or even for the prognosis of epilepsy. In the present study the development and optimization of new molecular assay methods for hsa-miR-34a and hsa-miR-146a levels in serum of patients with 107 epilepsy has been performed. For this purpose we used tumor cell lines DU145, BT-20, AGS and DLD-1, as well as 24 serum samples from patients with drugresistant epilepsy and 24 serum samples from patients with no drug-resistant epilepsy. The experiment protocol involved the isolation of total RNA, the reverse transcription of RNA to cDNA using miRNA-specific stem-loop RT primers and quantitation of cDNA with quantitative real time PCR (qPCR), using TaqMan-MGB probes. The cel-miR-39 was used as endogenous control. The efficacy control of our method was conducted initially by perfoming single miR-specific reverse transcription and then by multiple miR-specific reverse transcription for cel-miR-39, hsa-miR-146a and hsa-miR-34a in all four cell lines of our study. It was observed satisfactory amplification of our target-molecules either the use of single- or multiple-miR-specific reverse transcription. However, negative control samples revealed the enhancement of non-specific products, specially in hsa-miR-34a requiring further optimization of the method. Aiming the reduction of non-specific product in hsa-miR-34a assay method we conducted optimization of the miR-specific primers concentration in reverse transcription reactions. The amplification curves for the total of the concentration that have been used were satisfactory. Yet negative control samples showed once more the enhancement of non specific products for hsa-miR-34a, requiring further optimization of the method. Therefore more optimizations were performed initially for the concentration of the universal R primer and then for the forward primer of the qPCR reaction, aiming to the reduction of non specific product in hsa-miR-34a assay method. In both cases the ability of the assay for hsa-miR-34a was confirmed in the total range of the used concentrations, while a significant reduction for the non specific product was observed. The efficacy control of our method was evaluated also in serum samples from patients with epilepsy and for the cell line DU145, using multiple miR-specific RT for cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsa-miR-34a. The efficacy of our method was satisfactory all the concentrations tested. More precisely, hsa-miR-146a it was observed satisfactory amplification in the vast majority of the serum samples tested as well as for the cell line DU145. 108 After testing our method in 20 serum samples from patients with epilepsy, a satisfactory efficicacy in samples tested following the same assay method was confirmed. However, the significant amplification of non-specific products in similar amplification levels with hsa-miR-34a in samples, indicated the lack of specificity in our assay method and therefore we decided the design of novel miR-34a-specific stem-loop RT primer and forward qPCR prime. The use of the new miR-34a specific stem-loop RT primer did not resulted to the reduction of non-specific product accumulation, while the use of the new forward qPCR hsa-miR-34a primer did not produce suitable amplification curves. In summary, we have developed and validated the methodology for the quantification of hsa-miR-146a in serum samples from patients with epilepsy, using cel-miR-39 as endogenous reference gene for normalization purposes. The development of miR-34a specific assay was not satisfactory. Further studies using larger number of patients are required, in order to improve validity for its expression in serum samples from patients with epilepsy

Analysis and comparison of software-tools for cognitive assessment

Due to the rising number of impaired and elder persons, it has become crucial that we find methods where we can easily and quickly integrate them into the workforce and by extension, society. This paper focuses on the analysis and comparison of three software-tools that assess the cognitive ability of people with impairments. The three software-tools are GATRAS by the University of Stuttgart, CogState by CogState Research and the computer-based tests from the hamet e by the Berufsbildungswerk Waiblingen. This paper will give a detailed description and comparison of each software and their features. In addition, the software-tools will be tested in a study with 20 participants in conjunction with the Gemeinnützige Werkstätten und Wohnstätten GmbH (GWW) in Sindelfingen. However, due to time constraints, not all games will be tested but the recommended battery of tests from each software will be used for the study.Aufgrund einer stetig steigenden Anzahl von eingeschränkten (und älteren) Menschen ist es notwendig geworden, eine Methode zu finden, diese effizient in die Arbeitswelt (bzw. Gesellschaft) zu integrieren. Diese Arbeit legt seinen Fokus auf die Analyse und den Vergleich von drei Software-tools, welche die kognitive Fähigkeit von leistungseingeschränkten Personen messen soll. Die drei Werkzeuge nennen sich GATRAS, entwickelt von der Universität Stuttgart, CogState von CogState Research und die computerbasierten Tests von hamet e entwickelt vom Berufsbildungswerk Waiblingen. Die Arbeit soll eine detaillierte Beschreibung der drei genannten Tools geben, sowie diese einem genauen Vergleich unterziehen. Zusätzlich wurden die Tools alle in einer Studie mit 20 Teilnehmern getestet, in Zusammenarbeit mit der Gemeinnützige Werkstätten und Wohnstätten GmbH (kurz:GWW) in Sindelfingen. Durch zeitliche Beschränkungen konnten jedoch nicht alle "Spiele" der unterschiedlichen Software-tools getestet werden, deswegen wurden nur die von den jeweiligen Firmen empfohlenen Spiele überprüft

A Novel Missense Mutation Asp506Gly in Exon 13 of the F11 Gene in an Asymptomatic Korean Woman with Mild Factor XI Deficiency

Factor XI (FXI) deficiency is a rare autosomal recessive coagulation disorder most commonly found in Ashkenazi and Iraqi Jews, but it is also found in other ethnic groups. It is a trauma or surgery-related bleeding disorder, but spontaneous bleeding is rarely seen. The clinical manifestation of bleeding in FXI deficiency cases is variable and seems to poorly correlate with plasma FXI levels. The molecular pathology of FXI deficiency is mutation in the F11 gene on the chromosome band 4q35. We report a novel mutation of the F11 gene in an 18-year-old asymptomatic Korean woman with mild FXI deficiency. Pre-operative laboratory screen tests for lipoma on her back revealed slightly prolonged activated partial thromboplastin time (45.2 sec; reference range, 23.2-39.4 sec). Her FXI activity (35%) was slightly lower than the normal FXI activity (reference range, 50-150%). Direct sequence analysis of the F11 gene revealed a heterozygous A to G substitution in nucleotide 1517 (c.1517A>G) of exon 13, resulting in the substitution of aspartic acid with glycine in codon 506 (p.Asp506Gly). To the best of our knowledge, the Asp506Gly is a novel missense mutation, and this is the first genetically confirmed case of mild FXI deficiency in Korea

A novel DFP tripeptide motif interacts with the coagulation factor XI apple 2 domain

Factor XI (FXI) is the zymogen of FXIa, which cleaves FIX in the intrinsic pathway of coagulation. FXI is known to exist as a dimer and interacts with multiple proteins via its 4 apple domains in the “saucer section” of the enzyme; however, to date, no complex crystal structure has been described. To investigate protein interactions of FXI, a large random peptide library consisting of 106 to 107 peptides was screened for FXI binding, which identified a series of FXI binding motifs containing the signature Asp-Phe-Pro (DFP) tripeptide. Motifs containing this core tripeptide were found in diverse proteins, including the known ligand high-molecular-weight kininogen (HK), as well as the extracellular matrix proteins laminin and collagen V. To define the binding site on FXI, we determined the crystal structure of FXI in complex with the HK-derived peptide NPISDFPDT. This revealed the location of the DFP peptide bound to the FXI apple 2 domain, and central to the interaction, the DFP phenylalanine side-chain inserts into a major hydrophobic pocket in the apple 2 domain and the isoleucine occupies a flanking minor pocket. Two further structures of FXI in complex with the laminin-derived peptide EFPDFP and a DFP peptide from the random screen demonstrated binding in the same pocket, although in a slightly different conformation, thus revealing some flexibility in the molecular interactions of the FXI apple 2 domain. (Blood. 2016;00(00):1-9

The structure of the C-terminal actin-binding domain of talin

Talin is a large dimeric protein that couples integrins to cytoskeletal actin. Here, we report the structure of the C-terminal actin-binding domain of talin, the core of which is a five-helix bundle linked to a C-terminal helix responsible for dimerisation. The NMR structure of the bundle reveals a conserved surface-exposed hydrophobic patch surrounded by positively charged groups. We have mapped the actin-binding site to this surface and shown that helix 1 on the opposite side of the bundle negatively regulates actin binding. The crystal structure of the dimerisation helix reveals an antiparallel coiled-coil with conserved residues clustered on the solvent-exposed face. Mutagenesis shows that dimerisation is essential for filamentous actin (F-actin) binding and indicates that the dimerisation helix itself contributes to binding. We have used these structures together with small angle X-ray scattering to derive a model of the entire domain. Electron microscopy provides direct evidence for binding of the dimer to F-actin and indicates that it binds to three monomers along the long-pitch helix of the actin filament

Adhesions Assemble!—Autoinhibition as a Major Regulatory Mechanism of Integrin-Mediated Adhesion

The advent of cell-cell and cell-extracellular adhesion enabled cells to interact in a coherent manner, forming larger structures and giving rise to the development of tissues, organs and complex multicellular life forms. The development of such organisms required tight regulation of dynamic adhesive structures by signaling pathways that coordinate cell attachment. Integrin-mediated adhesion to the extracellular matrix provides cells with support, survival signals and context-dependent cues that enable cells to run different cellular programs. One mysterious aspect of the process is how hundreds of proteins assemble seemingly spontaneously onto the activated integrin. An emerging concept is that adhesion assembly is regulated by autoinhibition of key proteins, a highly dynamic event that is modulated by a variety of signaling events. By enabling precise control of the activation state of proteins, autoinhibition enables localization of inactive proteins and the formation of pre-complexes. In response to the correct signals, these proteins become active and interact with other proteins, ultimately leading to development of cell-matrix junctions. Autoinhibition of key components of such adhesion complexes—including core components integrin, talin, vinculin, and FAK and important peripheral regulators such as RIAM, Src, and DLC1—leads to a view that the majority of proteins involved in complex assembly might be regulated by intramolecular interactions. Autoinhibition is relieved via multiple different signals including post-translation modification and proteolysis. More recently, mechanical forces have been shown to stabilize and increase the lifetimes of active conformations, identifying autoinhibition as a means of encoding mechanosensitivity. The complexity and scope for nuanced adhesion dynamics facilitated via autoinhibition provides numerous points of regulation. In this review, we discuss what is known about this mode of regulation and how it leads to rapid and tightly controlled assembly and disassembly of cell-matrix adhesion

Vinculin controls talin engagement with the actomyosin machinery

The link between extracellular-matrix-bound integrins and intracellular F-actin is essential for cell spreading and migration. Here, we demonstrate how the actin-binding proteins talin and vinculin cooperate to provide this link. By expressing structure-based talin mutants in talin null cells, we show that while the C-terminal actin-binding site (ABS3) in talin is required for adhesion complex assembly, the central ABS2 is essential for focal adhesion (FA) maturation. Thus, although ABS2 mutants support cell spreading, the cells lack FAs, fail to polarize and exert reduced force on the surrounding matrix. ABS2 is inhibited by the preceding mechanosensitive vinculin-binding R3 domain, and deletion of R2R3 or expression of constitutively active vinculin generates stable force-independent FAs, although cell polarity is compromised. Our data suggest a model whereby force acting on integrin-talin complexes via ABS3 promotes R3 unfolding and vinculin binding, activating ABS2 and locking talin into an actin-binding configuration that stabilizes FAs