ΔΙΕΡΕΥΝΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΕΚΦΡΑΣΗΣ MicroRNAs ΣΤΟΝ ΟΡΟ
ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΕΠΙΛΗΨΙΑ
Παπαγρηγορίου Μαρία Ελένη, Βιολόγος, Πανεπιστημίου Πατρών
ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Η επιληψία ορίζεται ως η διαταραχή του εγκεφάλου που χαρακτηρίζεται
από τη διαρκή προδιάθεση για την εμφάνιση επιληπτικών κρίσεων και από τις
νευροβιολογικές, γνωστικές, ψυχολογικές και κοινωνικές συνέπειες αυτής της
κατάστασης, σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση κατά της Επιληψίας (International
League Against Epilepsy - ΙLAE) το 2005. Πρόσφατα ωστόσο (ΙLAE 2014),
διατυπώθηκε και ένας δεύτερος ορισμός με βάση τον οποίο επιληψία είναι η
ασθένεια του εγκεφάλου, η οποία ορίζεται από οποιαδήποτε από τις ακόλουθες
συνθήκες: i) ιστορικό δύο τουλάχιστον επεισοδίων σπασμών με περισσότερες από
24 ώρες διαφορά μεταξύ τους, ii) ένα απρόκλητο επεισόδιο σπασμών και η
πιθανότητα περαιτέρω επεισοδίων με τον κίνδυνο επανεμφάνισης να αγγίζει
τουλάχιστον το 60% μετά από δύο απρόκλητα επεισόδια σπασμών, που μπορεί
να συμβούν μέσα στα επόμενα 10 χρόνια και iii) διάγνωση ενός επιληπτικού
συνδρόμου. Η επιληψία αποτελεί μία από τις παλαιότερες καταστάσεις που έχει
γνωρίσει η ανθρωπότητα, η οποία επηρεάζει άτομα όλων των ηλικιών.
Υπολογίζεται ότι περίπου 50.000.000 άτομα παγκοσμίως έχουν διαγνωσθεί με
επιληψία με συχνότητα εμφάνισης 24-53/100.000 σε άτομα στις αναπτυγμένες
χώρες, αποτελώντας έτσι μία από τις πιο κοινές νευρολογικές διαταραχές σε
παγκόσμιο επίπεδο.
Τα miRNAs είναι μία κατηγορία μικρών μη κωδικών μορίων, τα οποία
ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση εμποδίζοντας τη διαδικασία της πρωτεϊνικής
έκφρασης και κατ’ επέκταση της μετάφρασης κυρίως με την πρόσδεσή τους στην
3’ αμετάφραστη περιοχή του mRNA στόχου. Η απορρύθμισή τους έχει συνδεθεί
με ένα μεγάλο αριθμό σημαντικών ασθενειών στον ανθρώπινο οργανισμό,
ανάμεσα στις οποίες συγκαταλέγεται και η επιληψία. Τα miRNAs εκφράζονται σε
μεγάλο βαθμό στον ανθρώπινο εγκέφαλο σε σχέση με άλλα όργανα. Έχουν
103
παρατηρηθεί αλλαγές στα επίπεδα των miRNAs του εγκεφάλου μετά από
παρατεταμένη επιληπτική κρίση (SE) σε πειραματικά μοντέλα. Παθολογικές
διαδικασίες που διαδραματίζουν κεντρικό ρόλο στην επιληψία, όπως ο νευρωνικός
θάνατος, η φλεγμονή και η γλοίωση βρίσκονται υπό τον έλεγχο των miRNAs.
Εντοπίζονται σε ένα ευρύ φάσμα ιστών και εξωκυττάριων υγρών, όπως ο ορός και
το πλάσμα του αίματος και έτσι μπορούν να αξιοποιηθούν κλινικά ως νέοι
βιοδείκτες για την επιληπτογένεση ή ακόμα και για την πρόγνωση της επιληψίας.
Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη και βελτιστοποίηση
νέων μοριακών μεθοδολογιών προσδιορισμού των επιπέδων των hsa-miR-34a και
hsa-miR-146a σε δείγματα ορού ασθενών με επιληψία. Χρησιμοποιήθηκαν για το
λόγο αυτό οι καρκινικές κυτταρικές σειρές DU145, BT-20, AGS και DLD-1, καθώς
και 24 δείγματα ορού ασθενών με φαρμακοανθεκτική επιληψία και 24 δείγματα
ορού ασθενών που δεν εμφανίζουν φαρμακοανθεκτική επιληψία. Το πειραματικό
πρωτόκολλο περιλαμβάνει την απομόνωση ολικού RNA, την αντίδραση
αντίστροφης μεταγραφής (Reverse Transcription/RT) του RNA σε cDNA με χρήση
ειδικών για τα miRNA-στόχους stem-loop εκκινητές (miRNA-specific primers) και
ποσοτικοποίηση των cDNA μορίων με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης
πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (qReal – time PCR) με χρήση miRNA-ειδικών
TaqMan-MGB ανιχνευτών (TaqMan-MGB probes). Ως ενδογενής μάρτυρας
χρησιμοποιήθηκε cel-miR-39.
Ο έλεγχος της απόδοσης της μεθοδολογίας μας πραγματοποιήθηκε αρχικά
με εφαρμογή single miR-specific reverse transcription (μονή miR-ειδικής
αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής) και έπειτα με multiple miR-specific reverse
transcription (πολλαπλή miR-ειδικής αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής) για τα
cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsa-miR-34a στις τέσσερις κυτταρικές σειρές της
μελέτης μας. Παρατηρήθηκε ικανοποιητική ενίσχυση των μορίων-στόχων μας,
τόσο από τη χρήση της single- ,όσο και από της multiple- miR-specific reverse
transcription, όπως και η απουσία φαινομένων αναστολής στις qPCR αντιδράσεις.
Ωστόσο, ο έλεγχος των NCrev.transc. ανέδειξε την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων,
ειδικά στην περίπτωση του hsa-miR-34a απαιτώντας την περαιτέρω
βελτιστοποίηση των μεθόδων.
Για τη μείωση της παραγωγής του μη ειδικού προϊόντος στη μεθοδολογία
προσδιορισμού του hsa-miR-34a ακολούθησε βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης
104
των miR-ειδικών RT εκκινητών στην αντίδραση αντίστροφης μεταγραφή και οι
εικόνες των καμπυλών ενίσχυσης σε όλες τις συγκεντρώσεις που
χρησιμοποιήθηκαν (200nM-10nM) ήταν ικανοποιητικές. Εντούτοις ο έλεγχος των
NCrev.transc. ανέδειξε και εδώ την ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων κατά την
μεθοδολογία προσδιορισμού του hsa-miR-34a οδηγώντας μας στο συμπέρασμα
ότι απαιτείται περαιτέρω βελτιστοποίηση των μεθόδων.
Ακολούθησαν λοιπόν βελτιστοποιήσεις πρώτα της συγκέντρωσης του
universal ανάστροφου R εκκινητή και έπειτα του πρόσθιου F εκκινητή στη realtime
qPCR αντίδραση, με στόχο τη μείωση παραγωγής μη ειδικού προϊόντος στη
μεθοδολογία προσδιορισμού του hsa-miR-34a. Και στις δύο περιπτώσεις
επιβεβαιώθηκε η ικανότητα προσδιορισμού του hsa-miR-34a σε όλο το εύρος των
χρησιμοποιούμενων συγκεντρώσεων, ενώ ως προς την παραγωγή μη ειδικού
προϊόντος παρατηρήθηκε σημαντική μείωσή του.
Ο έλεγχος της απόδοσης της μεθοδολογίας μας συνεχίστηκε για τα
δείγματα ορού ασθενών με επιληψία και την κυτταρική σειρα DU145, με εφαρμογή
multiple miR-specific reverse transcription (πολλαπλή miR-ειδικής αντίδρασης
αντίστροφης μεταγραφής και χρήση συγκέντρωσης RT εκκινητών 20 nM ανά
αντίδραση όσο και 10 nM ανά αντίδραση για τα cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsamiR-
34a. Η απόδοση της μεθόδου μας ήταν ικανοποιητική και για τις δύο
συγκεντρώσεις. Για το hsa-miR-146a, παρατηρήσαμε την ικανοποιητική ενίσχυση
του hsa-miR-146a στο σύνολο των δειγμάτων ορού και την κυτταρική σειρα
DU145, ενώ για το hsa-miR-34a παρατηρήθηκαν καμπύλες ενίσχυσης στο σύνολο
των ελεγχθέντων δειγμάτων σε σχετικά μεγάλες τιμές CT αναδεικνύοντας, είτε τη
μικρή συγκέντρωσή του στον ορό των ασθενών, είτε τη μη ικανοποιητική απόδοση
της μεθοδολογίας προσδιορισμού μας. Ο έλεγχος των NCrev.transc. δειγμάτων μας,
ανέδειξε την ενίσχυση και μη ειδικού προϊόντος και επομένως την ανάγκη για
περαιτέρω βελτιστοποίηση.
Μετά από τον έλεγχο της μεθοδολογίας μας σε σύνολο 20 δειγμάτων ορού
ασθενών με επιληψία επιβεβαιώθηκε η ικανοποιητική απόδοσή του σε μεγαλύτερο
αριθμό δειγμάτων ακολουθώντας την ίδια μεθοδολογία προσδιορισμού με πριν.
‘Όμως η σημαντική ενίσχυση μη ειδικών προϊόντων σε παρόμοια επίπεδα με την
ενίσχυση του hsa-miR-34a στα δείγματα, ανέδειξε την απουσία ειδικότητας στη
μεθοδολογία μας και γι’ αυτό αποφασίστηκε ο σχεδιασμός και η σύνθεση νέων
105
miR-34a-ειδικών stem-loop RT εκκινητών και πρόσθιου (F) εκκινητή της real - time
qPCR αντίδρασης. Ο νέος miR-34a-ειδικός stem-loop RT εκκινητής δε βελτίωσε
την εικόνα σχηματισμού μη ειδικών προϊόντων της μεθόδου, όπως φάνηκε από
τον έλεγχο των NCrev.transc. δειγμάτων του. Με το νέο πρόσθιο (F) εκκινητή για το
hsa-miR-34a δεν παρατηρήθηκε καμπύλη ενίσχυσης στα δείγματα ορού της
μελέτης μας και έτσι συμπεραίνουμε ότι δεν αποδίδει στη συγκεκριμένη
περίπτωση.
Συνοπτικά, αναπτύξαμε κι επικυρώσαμε τη μεθοδολογία για την
ποσοτικοποίηση του hsa-miR-146a σε δείγματα ορού ασθενών με επιληψία,
χρησιμοποιώντας το cel-miR-39 ως γονίδιο αναφοράς για σκοπούς
κανονικοποίησης. Η ανάπτυξη ειδικής μεθόδου προσδιορισμού για το hsa-miR-
34a δεν ήταν ικανοποιητική. Απαιτούνται μελλοντικές μελέτες με μεγαλύτερο
αριθμό ασθενών, ώστε να βελτιωθεί η εγκυρότητα για την έκφρασή του σε
δείγματα ορού ασθενών με επιληψία.RESEARCH OF MicroRNAs EXPRESSION LEVELS SERUM OF PATIENTS
WITH EPILEPSY
Papagrigoriou Maria Eleni, Biologist, University of Patras
ABSTRACT
Epilepsy is a disorder of the brain characterized by an enduring
predisposition to generate epileptic seizures and by the neurobiologic, cognitive,
psychological and social consequences of this condition as it was defined by the
International League Against Epilepsy (ILAE) in 2005. Recently though (ILAE
2014) epilepsy is also considered as a disease of the brain defined by any of the
following conditions: i) at least two unprovoked (or reflex) seizures occurring >24 h
apart, ii) one unprovoked (or reflex) seizure and a probability of further seizures
similar to the general recurrence risk (at least 60%) after two unprovoked seizures,
occurring over the next 10 years and iii) diagnosis of an epilepsy syndrome.
Epilepsy is one of the oldest conditions in humanity which affects individuals of all
ages. It has been reported that approximately 50,000,000 people worldwide have
epilepsy, with an incidence of 24-53/100,000 in developed regions, making it one
of the most common neurological diseases globally.
MicroRNAs (miRNAs) is a class of small non-coding RNA which regulates
gene expression by preventing the process of protein expression as they bind to
the 3’-UTR of the mRNA target. Α dysregulation in their expression has been
linked to a number of clinically important diseases including epilepsy. MiRNAs are
highly expressed in human brain relatively to other organs. Changes to brain
miRNA levels following prolonged seizures (status epilepticus) in animal models is
a fact. Pathogenic situations which have main role in epilepsy such as neuronal
death, inflammation and gliosis are under miRNAs’ control. They exist in a wide
range of tissues and extracellular body fluids including serum and blood plasma
and so they can be used for clinical purpsose as new biomarkers for
epileptogenesis or even for the prognosis of epilepsy.
In the present study the development and optimization of new molecular
assay methods for hsa-miR-34a and hsa-miR-146a levels in serum of patients with
107
epilepsy has been performed. For this purpose we used tumor cell lines DU145,
BT-20, AGS and DLD-1, as well as 24 serum samples from patients with drugresistant
epilepsy and 24 serum samples from patients with no drug-resistant
epilepsy. The experiment protocol involved the isolation of total RNA, the reverse
transcription of RNA to cDNA using miRNA-specific stem-loop RT primers and
quantitation of cDNA with quantitative real time PCR (qPCR), using TaqMan-MGB
probes. The cel-miR-39 was used as endogenous control.
The efficacy control of our method was conducted initially by perfoming
single miR-specific reverse transcription and then by multiple miR-specific reverse
transcription for cel-miR-39, hsa-miR-146a and hsa-miR-34a in all four cell lines of
our study. It was observed satisfactory amplification of our target-molecules either
the use of single- or multiple-miR-specific reverse transcription. However, negative
control samples revealed the enhancement of non-specific products, specially in
hsa-miR-34a requiring further optimization of the method.
Aiming the reduction of non-specific product in hsa-miR-34a assay method
we conducted optimization of the miR-specific primers concentration in reverse
transcription reactions. The amplification curves for the total of the concentration
that have been used were satisfactory. Yet negative control samples showed once
more the enhancement of non specific products for hsa-miR-34a, requiring further
optimization of the method.
Therefore more optimizations were performed initially for the concentration
of the universal R primer and then for the forward primer of the qPCR reaction,
aiming to the reduction of non specific product in hsa-miR-34a assay method. In
both cases the ability of the assay for hsa-miR-34a was confirmed in the total
range of the used concentrations, while a significant reduction for the non specific
product was observed.
The efficacy control of our method was evaluated also in serum samples
from patients with epilepsy and for the cell line DU145, using multiple miR-specific
RT for cel-miR-39, hsa-miR-146a και hsa-miR-34a. The efficacy of our method
was satisfactory all the concentrations tested. More precisely, hsa-miR-146a it was
observed satisfactory amplification in the vast majority of the serum samples
tested as well as for the cell line DU145.
108
After testing our method in 20 serum samples from patients with epilepsy, a
satisfactory efficicacy in samples tested following the same assay method was
confirmed. However, the significant amplification of non-specific products in similar
amplification levels with hsa-miR-34a in samples, indicated the lack of specificity in
our assay method and therefore we decided the design of novel miR-34a-specific
stem-loop RT primer and forward qPCR prime. The use of the new miR-34a
specific stem-loop RT primer did not resulted to the reduction of non-specific
product accumulation, while the use of the new forward qPCR hsa-miR-34a primer
did not produce suitable amplification curves.
In summary, we have developed and validated the methodology for the
quantification of hsa-miR-146a in serum samples from patients with epilepsy,
using cel-miR-39 as endogenous reference gene for normalization purposes. The
development of miR-34a specific assay was not satisfactory. Further studies using
larger number of patients are required, in order to improve validity for its
expression in serum samples from patients with epilepsy
