Plasmodium falciparum calciumabhängige Proteinkinase 1 (PfCDPK1): Strukturelle und funktionelle Charakterisierung

Veränderungen der cytosolischen Konzentration von Ca2+-Ionen spielen eine Schlüsselrolle bei der Signaltransduktion eukaryontischer Zellen. Ein Anstieg der Ca2+-Konzentration kann die Reaktion auf eine Vielzahl von Stimuli sein und ermöglicht es der Zelle sich veränderten Umweltbedingungen anzupassen. So konnte für Plasmodium falciparum, den Erreger der Malaria tropica, gezeigt werden, dass Calcium sowohl bei der Invasion der Erythrocyten als auch für die intraerythrocytäre Entwicklung der Parasiten essentiell ist. Als mögliche Zielproteine und Vermittler der Ca2+-induzierten Signaltransduktion wurden unter anderem calciumabhängige Proteinkinasen (CDPKs) identifiziert. CDPKs haben in Pflanzen und einigen Spezies der Protozoen, so auch in P. falciparum, eine Schlüsselfunktion bei der Vermittlung calciumabhängiger Phosphorylierungsereignisse inne. Sie sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt und ermöglichen es der Zelle, auf zahlreiche Umwelteinflüsse und Stress zu reagieren. CDPKs sind enge Verwandte der Calcium-Calmodulin-abhängigen Proteinkinasen (CaMPK) tierischer Zellen und Pilze. Sie unterscheiden sich aber von diesen durch die Kombination einer katalytischen Serin/Threonin-Proteinkinasedomäne und einer dem Calmodulin verwandten regulatorischen Ca2+-bindenden Domäne in einem Protein. In P. falciparum konnten bisher fünf dem klassischen Typus zuzuordnende CDPKs identifiziert werden. Die P. falciparum calciumabhängige Proteinkinase 1 (PfCDPK1) scheint an der Invasion von Erythrocyten sowie an der Regulation von Membranbiogeneseprozessen beteiligt zu sein. Die herausragende Bedeutung der CDPKs für die Funktion der Zelle und die Tatsache, dass sie nur in Pflanzen und einigen Protozoen wie Plasmodium, nicht aber in tierischen Zellen vorkommen, macht PfCDPK1 zu einem idealen Angriffsziel für die Entwicklung neuer Pharmaka gegen die Malaria tropica, die den Erreger spezifisch bekämpfen, den menschlichen Wirt dabei aber nicht schädigen. Ein Hauptaugenmerk dieser Arbeit richtete sich deshalb auf die Identifizierung eines spezifischen Inhibitors von PfCDPK1, der als Grundlage für die Entwicklung einer neuen pharmakophoren Leitstruktur dienen sollte. Dabei wurden zwei unterschiedliche Wege eingeschlagen. Zum einen wurden in einem High Throughput Screening sowie in eigenen Laborversuchen mehrere Substanzbanken auf mögliche Inhibitoren von PfCDPK1 untersucht. Zum anderen sollte durch die Kristallisation und anschließende Aufklärung der dreidimensionalen Struktur von PfCDPK1 und der Bindungsverhältnisse im Molekül die Grundlage für ein molecular modelling eines spezifischen Inhibitors gelegt werden. Die Kristallisation von Proteinen stellt hohe Anforderungen an die Reinheit und Homogenität eines Proteins in Lösung. Aus diesem Grunde wurde zunächst eine umfangreiche biochemische Charakterisierung von PfCDPK1 durchgeführt, auf deren Grundlage ein Protokoll für die Expression und Aufreinigung geeigneter Expressionskonstrukte von PfCDPK1 entwickelt wurde. Rekombinantes Protein, das nach diesem Protokoll aufgereinigt war, bildete die Ausgangsbasis für zahlreiche Kristallisationsansätze. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit befasste sich mit den Membranverankerungs- und Zielgebungsmotiven von PfCDPK1. Die Kinase besitzt in ihrem N-Terminus drei Motive, über die eine Membrananheftung erfolgen kann: eine Konsensussequenz für eine Myristylierung, eine mögliche Palmitylierungsstelle und ein Cluster basischer Aminosäuren. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl endogene als auch in vitro translatierte PfCDPK1 myristyliert wird. Darüber hinaus konnte in Membranbindungsstudien mit in vitro translatierter PfCDPK1 bzw. Mutanten mit veränderten Membranankermotiven die Membranbindungsfunktion der Myristylierung und des basischen Aminosäureclusters experimentell bestätigt werden. Die fraktionierte Saponinlyse transient transfizierter Parasiten, welche PfCDPK1 oder eine ihrer Mutanten exprimierten, untermauern diese Beobachtungen. Schließlich sollte mit Hilfe von GFP-Fusionsproteinen der Einfluss der Membranankermotive auf die Lokalisation von PfCDPK1 im infizierten Erythrocyten untersucht werden. Hierzu wurde die N-terminale Signalsequenz von PfCDPK1 und ihrer Mutanten an GFP gekoppelt, die Konstrukte in P. falciparum transfiziert und die Lokalisation der GFP-Konstrukte mittels konfokaler Laser–Scan-Mikroskopie untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass für den Transport der Kinase in die parasitophore Vakuole und von ihr abgeleiteten Membransysteme alle drei Membranbindungsmotive erforderlich sind

Analysis of Protein Palmitoylation Reveals a Pervasive Role in Plasmodium Development and Pathogenesis

Asexual stage Plasmodium falciparum replicates and undergoes a tightly regulated developmental process in human erythrocytes. One mechanism involved in the regulation of this process is posttranslational modification (PTM) of parasite proteins. Palmitoylation is a PTM in which cysteine residues undergo a reversible lipid modification, which can regulate target proteins in diverse ways. Using complementary palmitoyl protein purification approaches and quantitative mass spectrometry, we examined protein palmitoylation in asexual-stage P. falciparum parasites and identified over 400 palmitoylated proteins, including those involved in cytoadherence, drug resistance, signaling, development, and invasion. Consistent with the prevalence of palmitoylated proteins, palmitoylation is essential for P. falciparum asexual development and influences erythrocyte invasion by directly regulating the stability of components of the actin-myosin invasion motor. Furthermore, P. falciparum uses palmitoylation in diverse ways, stably modifying some proteins while dynamically palmitoylating others. Palmitoylation therefore plays a central role in regulating P. falciparum blood stage development

Design and Synthesis of High Affinity Inhibitors of Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax N-Myristoyltransferases Directed by Ligand Efficiency Dependent Lipophilicity (LELP)

N-Myristoyltransferase (NMT) is an essential eukaryotic enzyme and an attractive drug target in parasitic infections such as malaria. We have previously reported that 2-(3-(piperidin-4-yloxy)benzo[b]thiophen-2-yl)-5-((1,3,5-trimethyl-1H-pyrazol-4-yl)methyl)-1,3,4-oxadiazole (34c) is a high affinity inhibitor of both Plasmodium falciparum and P. vivax NMT and displays activity in vivo against a rodent malaria model. Here we describe the discovery of 34c through optimization of a previously described series. Development, guided by targeting a ligand efficiency dependent lipophilicity (LELP) score of less than 10, yielded a 100-fold increase in enzyme affinity and a 100-fold drop in lipophilicity with the addition of only two heavy atoms. 34c was found to be equipotent on chloroquine-sensitive and -resistant cell lines and on both blood and liver stage forms of the parasite. These data further validate NMT as an exciting drug target in malaria and support 34c as an attractive tool for further optimization

A plasmodium calcium-dependent protein kinase controls zygote development and transmission by translationally activating repressed mRNAs

Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) play key regulatory roles in the life cycle of the malaria parasite, but in many cases their precise molecular functions are unknown. Using the rodent malaria parasite Plasmodium berghei, we show that CDPK1, which is known to be essential in the asexual blood stage of the parasite, is expressed in all life stages and is indispensable during the sexual mosquito life-cycle stages. Knockdown of CDPK1 in sexual stages resulted in developmentally arrested parasites and prevented mosquito transmission, and these effects were independent of the previously proposed function for CDPK1 in regulating parasite motility. In-depth translational and transcriptional profiling of arrested parasites revealed that CDPK1 translationally activates mRNA species in the developing zygote that in macrogametes remain repressed via their 3′ and 5′UTRs. These findings indicate that CDPK1 is a multifunctional protein that translationally regulates mRNAs to ensure timely and stage-specific protein expression

Mein Pfälzerland : für eine Singstimme mit Klavierbegl.

Carl Möskes. [Text:] Eugen CroissantFür 4stg. Männerchor a cappell

The Motor Complex of Plasmodium falciparum: PHOSPHORYLATION BY A CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE*

Calcium-dependent protein kinases (CDPKs) of Apicomplexan parasites are crucial for the survival of the parasite throughout its life cycle. CDPK1 is expressed in the asexual blood stages of the parasite, particularly late stage schizonts. We have identified two substrates of Plasmodium falciparum CDPK1: myosin A tail domain-interacting protein (MTIP) and glideosome-associated protein 45 (GAP45), both of which are components of the motor complex that generates the force required by the parasite to actively invade host cells. Indirect immunofluorescence shows that CDPK1 localizes to the periphery of P. falciparum merozoites and is therefore suitably located to act on MTIP and GAP45 at the inner membrane complex. A proportion of both GAP45 and MTIP is phosphorylated in schizonts, and we demonstrate that both proteins can be efficiently phosphorylated by CDPK1 in vitro. A primary phosphorylation of MTIP occurs at serine 47, whereas GAP45 is phosphorylated at two sites, one of which could also be detected in phosphopeptides purified from parasite lysates. Both CDPK1 activity and host cell invasion can be inhibited by the kinase inhibitor K252a, suggesting that CDPK1 is a suitable target for antimalarial drug development

Dissection of Minimal Sequence Requirements for Rhoptry Membrane Targeting in the Malaria Parasite

Rhoptries are specialized secretory organelles characteristic of single cell organisms belonging to the clade Apicomplexa. These organelles play a key role in the invasion process of host cells by accumulating and subsequently secreting an unknown number of proteins mediating host cell entry. Despite their essential role, little is known about their biogenesis, components and targeting determinants. Here, we report on a conserved apicomplexan protein termed Armadillo Repeats-Only (ARO) protein that we localized to the cytosolic face of Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii rhoptries. We show that the first 20 N-terminal amino acids are sufficient for rhoptry membrane targeting. This protein relies on both - myristoylation and palmitoylation motifs - for membrane attachment. Although these lipid modifications are essential, they are not sufficient to direct ARO to the rhoptry membranes. Mutational analysis revealed additional residues within the first 20 amino acids of ARO that play an important role for rhoptry membrane attachment: the positively charged residues R9 and K14. Interestingly, the exchange of R9 with a negative charge entirely abolishes membrane attachment, whereas the exchange of K14 (and to a lesser extent K16) alters only its membrane specificity. Additionally, 17 proteins predicted to be myristoylated and palmitoylated in the first 20 N-terminal amino acids were identified in the genome of the malaria parasite. While most of the corresponding GFP fusion proteins were trafficked to the parasite plasma membrane, two were sorted to the apical organelles. Interestingly, these proteins have a similar motif identified for ARO