Modulating receptor activation, migration and epigenetics of cancer cells using UV light

Cancer is a complex disease characterized by uncontrolled and unorganized proliferation caused by mutations and disruption of epigenetic processes, leading to a malignant phenotype. There are 14 main hallmarks that malignant cells share between them. This work addressed tree of such hallmarks, namely “sustaining proliferative signaling”, “enabling replicative immortality” and “non mutational epigenetic reprogramming”. In the first one, cancer cells are characterized by acquiring the capacity to sustain proliferative signaling by increasing the activation of key receptors, such as the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) by its cognate ligand EGF. EGFR is a trans-membrane glycoprotein with an extracellular epidermal growth factor binding domain and an intracellular tyrosine kinase domain. EGFR regulates signaling pathways that lead to cellular proliferation and is known to be overexpressed in many cancer types, including lung cancer. Previous studies have demonstrated that photonic modulation with a wavelength of 280 nm alters the 3D structure of EGFR, preventing EGF-EGFR activation and blocking the migration of cancer cells. This wavelength is considered to be safe since it has a low probability for inducing keratitis, skin erythema and skin carcinogenesis. We treated a human lung cancer cell line, A549 EGFR Biosensor, with UV at 280 nm and 295 nm and compared to cells not exposed to UV light as controls, performing wound healing assays to evaluate the migration capacity of these cells and real time fluorescence confocal imaging of cells overexpressing EGFR to determine whether there are changes in morphology and mobility of non-luminated vs. illuminated cells at 280nm and 295nm. Our results show that both the 280nm and 295nm lengths reduce the ability of cancer cells to migrate. Also, the 280nm wavelength decreases the expression of mesenchymal markers and increases the expression of epithelial markers. Furthermore, addressing the second and third hallmark, it is known that cancer cells acquire the capability of dividing indefinitely due to the activation of telomerase, a DNA polymerase that is responsible for the maintenance of telomere length, by adding repetitive sequences at the ends of chromosomes, leading to cell immortalization. We aimed at halting “enabling replicative immortality” and “non mutational epigenetic reprogramming” using the same photonic approach and to investigate if the light assault led to epigenetic changes and possible modulation of the telomerase expression/activity. In addition, we performed RT-qPCR to verify if there is an association between the expression of EGFR and Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT)) and found that hTERT expression appears to be altered by radiation when cells were exposed for 30min and harvested at 0h, 24h and 48h. Moreover, we carried out pyrosequencing assays to understand if radiation is involved in epigenetic mechanisms, through altering DNA methylation patterns in a specific promotor region of hTERT. Our data shows that cells irradiated for 30 minutes present a significant reduction in DNA methylation at the studied region and that this pattern is maintained for 24h. Since metastases represent the main cause of death in cancer patients, our data proves to be promising in the development of a new treatment in the future, that improves the quality of life of patients and prevents metastatic progression.O cancro é um conjunto de doenças complexas, caracterizado pela proliferação descontrolada e desorganizada, causada por mutações e interrupção dos processos epigenéticos, levando à invasão, migração e consequentemente ao fenótipo maligno. Quando o cancro se espalha do local de origem para outro local distante denomina-se de metástase. As metástases envolvem uma série de etapas sequenciais, nomeadamente o processo de transição epitélio-mesenquimal de células individuais do tumor primário levando ao seu extravasamento, sendo responsáveis por cerca de 90% das mortes em pacientes com cancro. Atualmente o cancro é responsável pelo aparecimento de cerca 23,6 milhões de novos casos anualmente e dez milhões de mortes em todo o mundo. Em Portugal o número anual de mortes ronda os 32 mil indivíduos considerando-se assim a segunda causa de morte, sendo que o cancro do pulmão representa a segunda neoplasia mais frequente e mortal. Existem 14 hallmarks ou características que as células malignas compartilham entre si, incluindo a multiplicação ilimitada, evasão aos supressores de crescimento, promoção da invasão e metástase, resistência à apoptose, estimulação da angiogénese, manutenção da sinalização proliferativa, eliminação da limitação de energia celular, evasão da destruição imune, instabilidade/mutação do genoma, inflamação tumoral reforçada, desbloqueamento da plasticidade fenotípica, reprogramação epigenética não mutacional, microbiomas polimórficos e senescência celular. Esta dissertação abordou mais aprofundadamente três dessas marcas, nomeadamente a “sustentação da sinalização proliferativa”, a “imortalidade replicativa” e a “reprogramação epigenética não mutacional”. Na primeira, as células cancerígenas são caracterizadas por adquirirem a capacidade de sustentar a sinalização proliferativa, aumentando a ativação de recetores-chave como o fator de crescimento epidérmico (EGF) que é um ligando do recetor fator de crescimento epidérmico (EGFR). O EGFR é uma glicoproteína transmembranar com um domínio de ligação ao EGF extracelular e um domínio de tirosina quinase intracelular que regula vias de sinalização que levam à proliferação celular. Este é conhecido por ser sobrexpresso em muitos tipos de cancro, incluindo o cancro do pulmão, representando cerca de 10-20% das mutações em todos os tipos de cancro do pulmão onde cerca de 50% destes acontecem em jovens adultos não fumadores. Dado o seu papel na promoção da proliferação celular e pela oposição à apoptose o EGFR foi referido como um proto-oncogene, uma vez que está envolvido em inúmeras vias de sinalização como a MAPK, PI3K-AKT-mTOR, EGFR-STAT3 e a fosfolipase C (PLC)/proteína cascata de sinalização da quinase C (PKC) que por sua vez ativam genes responsáveis pela proliferação, sobrevivência e diferenciação celular em vários tipos de cancro. No presente projeto, pretendemos impedir a "sinalização proliferativa sustentada" usando uma nova terapia fotónica e investigar se o estímulo com luz leva a alterações epigenéticas e a uma possível modulação da expressão da telomerase em células cancerígenas. Estudos anteriores demonstraram que a modulação fotónica com um comprimento de onda de 280 nm altera a estrutura 3D do EGFR, impedindo a ativação do EGF-EGFR e bloqueando assim a migração celular. Este comprimento de onda é considerado um comprimento de onda seguro por apresentar uma baixa probabilidade de indução de queratite, eritema cutâneo e carcinogénese cutânea. Além disso, os valores de irradiância aplicados são pelo menos 20 vezes mais fracos que os níveis solares de UVB. Planeou-se comparar os efeitos de 280 nm vs o comprimento de onda menos seguro de 295 nm para investigar a janela terapêutica da luz ultravioleta. Para isso usou-se uma linhagem de células de cancro do pulmão humano com sobrexpressão de EGFR, A549 EGFR Biosensor, que através da realização de ensaios de cicatrização de feridas permitiu-nos avaliar a capacidade de migração dessas células, enquanto a microscopia confocal de fluorescência em tempo real possibilitou-nos determinar se existiam mudanças na morfologia e mobilidade de células não iluminadas vs. iluminadas com os comprimentos de 280nm e 295nm. Adicionalmente, e abordando agora o segundo e o terceiro hallmark, sabe-se que as células cancerígenas adquirem a capacidade de se dividir indefinidamente devido à ativação da telomerase, uma DNA polimerase que é responsável pela manutenção do comprimento dos telómeros, pela adição de sequências repetitivas (5'-GGTTAG-3') nas extremidades dos cromossomas, levando à imortalização celular. A atividade da telomerase pode ser identificada pelo seu domínio proteico catalítico (hTERT). Dado que foi previamente identificada uma região especifica no promotor da TERT, designada de THOR, que se encontra comumente hipermetilada em vários tipos de cancro, levando à ativação da hTERT que por sua vez reativa a telomerase nessas células. A ativação da telomerase tem sido observada em cerca de 90% de todos os tumores humanos, o que sugere que a imortalidade conferida pela telomerase desempenha um papel chave no desenvolvimento do cancro. Para verificar se existe uma associação entre a expressão de EGFR e a Transcriptase Reversa da Telomerase (hTERT), foram realizados diversos ensaios de RT-qPCRs. Além disso, foram efetuados ensaios de pirosequenciação de forma a compreender se a radiação está envolvida em mecanismos epigenéticos, por meio da metilação do DNA na região promotora THOR. Através do conjunto dos resultados obtidos, podemos concluir que tanto o comprimento de 280nm quanto o de 295 nm reduzem a capacidade de migração e motilidade das células cancerígenas. Por outro lado, o comprimento de 280nm também diminui a expressão de marcadores mesenquimais, como a N-caderina, e aumenta a expressão de marcadores epiteliais, como a E-caderina, envolvidos no processo de Transição-Epitélio-Mesenquimal. A expressão de hTERT parece ser alterada pela radiação quando as células são irradiadas por 30 minutos e recolhidas às 0h, 24h e 48h. No entanto, quando as células são irradiadas por 60 minutos, os resultados obtidos não mostraram ser significativos, não sendo assim possível inferir que exista uma diminuição da metilação do DNA na região THOR. A radiação com 280 nm leva a mudanças epigenéticas apenas quando as células são irradiadas por 30 minutos. Uma vez que o recetor de EGF e a telomerase são frequentemente mais expressos em cancros e outras doenças proliferativas da pele, pode ser possível reduzir significativamente o potencial proliferativo dessas células usando-os como alvos de uma terapia baseada na radiação ultravioleta, permitindo extrapolar uma nova forma de tratamento mais seguro e menos prejudicial à saúde dos pacientes com cancro do pulmão assim como impedir a progressão metastática das células. Esta nova abordagem fotónica, por sua vez, pode ser aplicável ao tratamento de vários tipos de cancro isoladamente ou em combinação com outras terapias existentes

Characterisation of microbial attack on archaeological bone

As part of an EU funded project to investigate the factors influencing bone preservation in the archaeological record, more than 250 bones from 41 archaeological sites in five countries spanning four climatic regions were studied for diagenetic alteration. Sites were selected to cover a range of environmental conditions and archaeological contexts. Microscopic and physical (mercury intrusion porosimetry) analyses of these bones revealed that the majority (68%) had suffered microbial attack. Furthermore, significant differences were found between animal and human bone in both the state of preservation and the type of microbial attack present. These differences in preservation might result from differences in early taphonomy of the bones. © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved