Probing entry inhibitors' activity on HIV and development of new fusion inhibitors : integrating evolutionary biology with virology

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011The general aims of this thesis were: 1) to examine the C2, V3 and C3 envelope regions ofHIV-1 and HIV-2 at the molecular, evolutionary and structural levels; 2) to compare HIV-1and HIV-2 susceptibility to entry inhibitors and assess their potential value in HIV-2therapy; 3) to produce a new fusion inhibitor peptide using evolutionary biology basedstrategies.In the first study (Chapter 2), HIV-1 and HIV-2 were compared at the molecular,evolutionary and structural levels in the C2, V3 and C3 envelope regions. We identifiedsignificant structural and functional constrains to the diversification and evolution of C2,V3 and C3 in the HIV-2 envelope but not in HIV-1. In particular, we found that V3 in HIV-2is less exposed and more conserved than in HIV-1, suggesting fundamental differences inthe biology and infection of these viruses as well as in their susceptibility to entryinhibitors.In the second study (Chapter 3) we measured the baseline susceptibility of HIV-1 and HIV-2primary isolates to different fusion inhibitors and coreceptor antagonists, includingenfuvirtide (T-20) and maraviroc (MVC). MVC inhibited HIV-2 R5 variants at significantlyhigher IC90 concentrations than HIV-1 variants. Moreover, as previously found in HIV-1,susceptibility of HIV-2 R5 variants to MVC was inversely related with CD4+ T cell counts attime of virus isolation. These results suggest that the structure of the envelope complex ofR5 variants changes along the course of infection. More importantly, the results call fornew clinical studies to evaluate the efficacy of MVC in HIV-2 infection and to determine itsbest therapeutic dosage in early and late stage disease. We also provide definitiveevidence demonstrating that T-20 is not useful for HIV-2 therapy.In the final study (Chapter 4), we designed a new HIV fusion inhibitor peptide (P3) basedon the ancestral sequences of the HIV-2 and SIV envelope genes. P3 has an a-helixstructure as demonstrated by circular dichroism. It has broad antiviral activity at thenanomolar range against HIV-1 and HIV-2 primary isolates, including HIV-1 variantsresistant to T-20. Binding ELISA assays and selection of resistant mutants suggest that P3prevents viral fusion by binding to the transmembrane protein in the HR1 region. Thesestudies provide proof of concept that viable antiviral peptides can be constructed usingevolutionary biology strategies. Such strategies should be explored to enhance theproduction of peptide drugs and vaccines.O Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 e do tipo 2 (VIH-1 e VIH-2) são os agentes etiológicos do Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Embora sejam semelhantes na sua organização estrutural e genómica, estes lentivírus humanos apresentam características antigénicas distintas e partilham uma semelhança genética de apenas 50%. Enquanto o VIH-1 é responsável pela pandemia mundial, a infecção pelo VIH-2 localiza-se sobretudo na África Ocidental, em alguns países europeus como Portugal e França, e na Índia. A infecção pelo VIH-2 tem melhor prognóstico, a progressão para a doença é mais lenta e há melhor controlo imunológico do que na infecção pelo VIH-1. Ao contrário do VIH-1, o arsenal terapêutico actualmente disponível para tratar a infecção por VIH-2 é reduzido. Os fármacos antiretrovirais em uso foram especificamente desenvolvidos para o VIH-1 e, consequentemente, a sua actividade pode ser reduzida ou nula no VIH-2. Este é o caso concreto dos inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa e de alguns inibidores da protease. Neste contexto, os inibidores de entrada poderão ser úteis para tratar a infecção por VIH-2. Contudo, a susceptibilidade dos isolados primários de VIH-2 aos inibidores de entrada é actualmente desconhecida. A susceptibilidade do VIH aos inibidores de entrada é determinada pela qualidade da interacção do vírus com os receptores celulares. O VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes a este nível. Por exemplo, o VIH-2 pode ligar-se ao co-receptor CCR5 independentemente do receptor CD4 e da região V3 do invólucro. Por outro lado, as regiões C2, V3 e C3 do VIH-2 são substancialmente diferentes do VIH-1 a nível antigénico. Colectivamente, estes dados indicam que a estrutura e conformação das glicoproteínas de superfície do VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes e sugerem que a susceptibilidade e resistência dos dois tipos de vírus aos inibidores de entrada podem também ser diferentes. Os principais objectivos desta tese foram: 1) analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas das regiões C2, V3 e C3 no VIH-1 e VIH-2; 2) comparar a susceptibilidade do VIH-1 e VIH-2 aos inibidores de entrada e avaliar o seu potencial terapêutico na infecção por VIH-2; 3) produzir um novo inibidor de fusão para o VIH-2. Para melhor compreender as potenciais diferenças destes dois vírus na resposta aos inibidores de entrada começámos por analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas da região V3 e as regiões circundantes C2 e C3, num número significativo de vírus VIH-1 e VIH-2 isolados em Portugal e noutras regiões do globo, com recurso a diferentes metodologias de biologia evolutiva e computacional (Capitulo 2). Apesar da menor variabilidade das 3 regiões no VIH-2, verificámos que a região C3 está sob forte selecção positiva e encontra-se exposta à superfície sugerindo que, tal como no VIH-1, esta região poderá constituir um domínio neutralizante. No entanto, ao contrário do VIH-1, a maioria das mutações adaptativas no VIH-2 são prejudiciais e levam à extinção das linhagens virais pelo que o efeito final é um forte constrangimento à variabilidade das regiões analisadas. Ao contrário do VIH-1, verificámos que a ansa V3 do VIH-2 se encontra oclusa no complexo glicoproteico do invólucro, numa conformação que parece ser estabilizada por interacções que mantém com alguns resíduos da regiões C2 e C3. Estes resultados são consistentes com o facto de a V3 não ser imunodominante no VIH-2, ficando assim mais protegida da resposta imunitária e das eventuais mutações que dela resultam. A forte conservação da V3, da C2 e da C3 também é consistente com a sua potencialmente importante actividade imunosupressora. Em conclusão, este primeiro estudo permitiu caracterizar algumas das características estruturais e funcionais que distinguem as glicoproteínas do invólucro do VIH-1 e do VIH-2 e que estão associadas às diferentes características biológicas e fenotípicas destes dois vírus. Estes dados podem ter impacto na resposta dos dois vírus aos inibidores de entrada (analisado no Capítulo 3) e no desenvolvimento de novas vacinas. No segundo estudo (Capítulo 3) comparámos a actividade antiviral dos antagonistas dos coreceptores (AMD3100, TAK-779 e maraviroc) e dos inibidores de fusão (T-20 e T-1249) entre um grupo de 20 isolados de VIH-2 (19 isolados primários + um isolado laboratorial) e nove isolados de VIH-1 (sete isolados primários + dois isolados laboratoriais). Verificámos que a sensibilidade ao AMD3100 e ao TAK-779 é semelhante no VIH-1 e o VIH-2. No entanto, o perfil da curva dose-resposta do maraviroc (MVC) obtido para os isolados R5 foi diferente nos dois tipos de vírus. No VIH-2 os valores de IC90 foram significativamente mais elevados do que no VIH-1; por outro lado, os declives da curva dose-resposta foram mais baixos no VIH-2 do que no VIH-1. Colectivamente, estes resultados sugerem que poderão ser necessárias concentrações mais elevadas de MVC para tratar os doentes infectados pelo VIH-2. Adicionalmente, encontrámos uma correlação forte e de sentido inverso entre as susceptibilidade do VIH-2 ao MVC e o número de células T CD4+ dos doentes quando os vírus foram isolados. Vírus isolados em doentes em fase de SIDA foram menos susceptíveis ao MVC do que os vírus isolados em doentes com uma contagem de células T CD4+ superior a 200 células/ul. Ao contrário do VIH-1 não encontrámos qualquer correlação entre a carga da V3 e a susceptibilidade dos isolados R5 de VIH-2 ao MVC. De um modo geral, os nossos resultados sugerem que são necessários ensaios clínicos para avaliar a efectividade do MVC na infecção pelo VIH-2, determinar a dose terapêutica mais adequada e esclarecer se é necessário fazer um ajuste de dose de acordo com a fase da doença. Adicionalmente, e uma vez que isolados VIH-2 X4 e populações duplas/mistas são totalmente ou parcialmente resistentes ao MVC, é de extrema importância o desenvolvimento de um ensaio de tropismo (genotípico e/ou fenotípico) para o VIH-2 de modo a determinar o tropismo antes do início da terapia com MVC. Sem o conhecimento prévio do tropismo viral, o tratamento com MVC poderá seleccionar espécies X4 minoritárias que estão associadas a maior resistência à neutralização e uma progressão mais rápida da doença. No que diz respeito aos inibidores de fusão, verificámos que o T-20 tem actividade reduzida no VIH-2, confirmando estudos anteriores realizados com dois isolados laboratoriais. Por outro lado, observámos uma elevada susceptibilidade deste vírus ao T- 1249, indicando que os inibidores de fusão são potencialmente eficazes na infecção pelo VIH-2. Assim, o desenvolvimento de um novo inibidor de fusão do VIH-2 foi o objectivo do último estudo desta tese (Capítulo 4). No Capítulo 4, desenvolvemos novos péptidos inibidores de fusão a partir da reconstrução de sequências ancestrais da glicoproteína gp36 do invólucro de VIH-2 e de Vírus de Imunodeficiência dos Símios (VIS). Com esta abordagem inovadora pretendemos incorporar a história evolutiva dos vírus na sequência dos péptidos e desta forma melhorar a tolerância destas moléculas aos polimorfismos naturais da sua região alvo bem como às mutações de resistência seleccionadas na sua presença. Obteve-se um péptido ancestral (P3) constituído por 34 aminoácidos, cuja sequência corresponde às posições homólogas 628 – 661 da proteína Env do isolado VIH-1 HXB2 (ou 623 – 656 do isolado VIH-2 ROD). A sequência do P3 difere em 21 aminoácidos da sequência consenso de VIH-1, 14 aminoácidos da sequência do T-20 e 6 aminoácidos da sequência consenso de VIH-2. Ao contrário da natureza não-estruturada do T-20, o P3 tem uma conformação típica em hélice-a, o que lhe poderá conferir maior a estabilidade contra a degradação proteolítica, bem como maior afinidade para a região alvo. Por outro lado, o P3 foi facilmente solúvel em soluções aquosas o que é uma vantagem num futuro desenvolvimento de uma fórmula farmacêutica. O P3 demonstrou ter uma forte actividade antiviral contra isolados primários e laboratoriais de VIH-1 e VIH-2 (IC50 médio, 11 nM para o HIV-1 e 63.8 nM para o HIV-2), incluindo variantes resistentes ao T-20 (IC50, 0.15 – 11.8 nM). Através da passagem consecutiva de vírus em cultura na presença do péptido, foi seleccionada uma mutação de resistência na região HR1 da gp41 (VIH-1), a qual é responsável pela redução da susceptibilidade do VIH-1 ao P3 em 120x. Nas mesmas condições, e após 60 dias em cultura, não foi possível seleccionar mutações de resistência ao P3 no VIH-2. Estes resultado, em conjugação com a sua forte ligação à glicoproteína transmembranar de um isolado de VIH-2, indicam que, tal como outros péptidos baseados na região HR2 (T-20, T- 1249), o P3 inibe a entrada do VIH pela interacção com a região HR1 da gp41 e sugerem que a barreira genética para a resistência ao P3 é significativamente superior no VIH-2 do que no VIH-1. Neste estudo demonstrámos ainda que o P3 é significativamente menos antigénico do que o T-20 nos doentes infectados pelo VIH-1 o que poderá traduzir-se numa maior duração da eficácia clínica do P3 em comparação com o T-20. Os resultados obtidos com o P3 demonstram pela primeira vez que é possível desenvolver péptidos com actividade antiviral significativa utilizando metodologias de biologia evolutiva, pelo que esta abordagem poderá ser explorada no futuro para a produção de medicamentos peptídicos e, eventualmente, de vacinas

Quality of the Azores destination in the perspective of tourists

Tourism is a growing industry in the Autonomous Region of the Azores. However, little is known about how tourists evaluate this destination, something which certainly constitutes a shortcoming if one takes into consideration that this is a very competitive industry, with new destinations appearing every year and others increasing their market share. This paper focuses on the quality of the Azores destination in the perspective of tourists and, to an extent, has the goal of contributing to reduce this shortcoming. According to our findings, 74% of the tourists interviewed consider the global quality of the Azores destination to be very good or excellent, with the landscape, the climate/weather, the hospitality, the cleanliness and the security being the most highly-rated partial indicators. Additionally, a regression analysis indicates that the evaluation of the global quality of this destination varies according to the individual characteristics of tourists.N/

Do accelerated ventures learn what really matters? : an exploratory study of the Portuguese Ecosystem

Entrepreneurs are drivers for economic prosperity and innovation. They take risks that are normally avoided by established companies, pushing industry boundaries to the next level. Several incubation mechanisms emerged in order to support new ventures in coping with initial challenges. Accelerators were born in 2005 and completely revolutionized how business incubation is done. By offering knowledge intensive and specialized support, acceleration programs aim to speed up new ventures´ development in approximately three months. Scholars have studied this new incubation mechanism over the last years but still little is known about the impact that accelerators have on startups. In order to address this research gap, we interviewed ten accelerated startups to understand the entrepreneurs´ perspective about the program. Based on acknowledged research, we investigated the impact of accelerators on the drivers of startup success. Literature divides the drivers in four main categories – Team, Product, Marketing and Financials. We found accelerators to be remarkable Team Builders for accelerated startups. Due to the cohort effect and the knowledge-sharing environment promoted by accelerators, ventures develop their Team Personality and Credibility throughout the program. Additionally, we found that accelerators are great Market Development Champions for high-tech startups. Our results suggest that the accelerators´ market-oriented mindset positively impact all the drivers of startup success of the Marketing category.Os empreendedores são motores para o desenvolvimento económico e inovação. Eles correm riscos que são normalmente evitados pelas grandes empresas, desafiando os limites pré-estabelecidos pela indústria. Vários mecanismos de incubação surgiram para ajudar as novas empresas a enfrentar os seus primeiros desafios. Os aceleradores emergiram em 2005 e revolucionaram a forma como a incubação de novas empresas é feita. Através de um suporte especializado e baseado no conhecimento, os aceleradores têm como objetivo acelerar o desenvolvimento de novos negócios em aproximadamente três meses. Os académicos têm estudado este novo mecanismo de incubação durante os últimos anos, mas pouco se descobriu acerca do impacto que os aceleradores têm nas startups. De forma a preencher esta lacuna, foram entrevistadas dez startups previamente aceleradas para perceber a perspetiva dos empreendedores sobre o programa. Baseados em investigação reconhecida, indagamos o impacto dos aceleradores nos drivers de sucesso das startups. A literatura divide os drivers em quarto categorias principais – Equipa, Produto, Marketing e Financeiro. Concluímos que os aceleradores são um fantástico suporte ao Desenvolvimento de Equipa das startups aceleradas. Devido ao efeito cohort e ao ambiente de partilha do conhecimento promovido pelo acelerador, as empresas desenvolvem a sua Personalidade e Credibilidade enquanto equipa. Adicionalmente, descobrimos que os aceleradores prestam um grande apoio no Desenvolvimento de Mercado para as high-tech startups. Os nossos resultados sugerem que o pensamento orientado para o mercado dos aceleradores é responsável por um impacto positivo em todos os drivers de sucesso das startup, relativamente à categoria Marketing

Analysis of simply supported wood beams at ambient and high temperatures

The main objective of this work is to present a methodology for safety analysis of simply supported wood beams at ambient and high temperatures with a concentrated load at mid-span. Sixteen different beam configurations will be studied. All calculations were conducted according the Eurocode 5, part 1-1 and part 1-2. During this study will be analyzed the safe load bearing capacity according standards and compared with the elastic and plastic load from beam theory. The beam theory can provide sufficient accuracy up to the point of instability. The standard methods are generally conservative and they are suitable to be used for design purposes with safety. The studied beam cross sections will be in glued laminated wood, as yellow birch, with characteristics equals to a Glulam GL28H.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

A new species of Scinax Wagler, 1830 (Anura: Hylidae) from the middle Amazon river basin, Brazil

A new species of the hylid genus Scinax is described and illustrated. The new taxon was found in the Amazonian rainforest of northern Brazil, municipalities of Maués and Careiro da Várzea, state of Amazonas. The new species is characterized by its moderate size (male mean snout-vent length 36.3mm); body robust; large, orange, black-bordered axillary and inguinal spots; and bilobate vocal sac. This new species was found in primary and secondary forest on branches of shrubs or trees in, or next to, permanent ponds and flooded areas.Uma nova espécie de hilídeo do gênero Scinax é descrita e ilustrada. O novo táxon foi encontrado na Amazonia, região norte do Brasil, municípios de Maués e Careiro da Várzea, Estado do Amazonas. A nova espécie é caracterizada pelo tamanho moderado (machas com media de comprimento rostro-cloacal de 36.3mm); corpo robusto; mancha axiliar e inguinal grande, laranja bordeada de preto; e saco vocal bilobado. Essa nova espécie foi encontrada em floresta primária e secondária sobre ramos de arbustos e árvores sobre ou próximo a poças permanentes ou áreas alagadas

Monte Carlo simulation of laser beams interaction with the human eye using Geant4

BACKGROUND: Due to the unique characteristics of the eye, ophthalmologic diagnostic techniques often rely on the photons interaction with the retina to infer its internal structure. Although these techniques are widely used, the interpretation of the generated images is not always fully understood, as in scanning laser ophthalmoscopy dark field imaging. This limits the exploitation of its full potential as a diagnostic tool for deep abnormalities in the retina, as in the situation of drusen. METHODS: With the aim of better understanding the retinal diagnostic images, we have carried out computer simulations of incident laser beams interacting with different structures of the human eye, including a retina with and without drusen. We have used the Geant4 simulation toolkit, applying the optical package of the electromagnetic (EM) physics working group, to simulate the physical processes of reflection, refraction, absorption, and scattering of low energy photons (2 eV) in biological tissues. For each simulation it was used a single beam of orange light, with a Gaussian profile, that travels through all optical elements of the eye. The reflected beam characteristics were analyzed by virtual detectors in different locations, which collected information about the number and position of photons. The geometry and optical properties of all components of the eye were considered according to the published data. RESULTS: Simulation results put in evidence that the presence of drusen influences the profile of the reflected beams. It changes the mean free path of the photons, modifying its reflection pattern, which depends on the area illuminated by the incident beam. This result is also visible when the reflected beam is analyzed outside of the eye, when the profile has no longer a symmetrical Gaussian distribution. These results will support the retinal diagnostic images that will be obtained in a near future with a new developed ophthalmic apparatus. CONCLUSIONS: The shape analysis of the reflected beams in retinal laser scanning techniques could increase its potential as a diagnostic examination tool for the deeper structures of the retina

Bargaining regimes and wages in Portugal

In this paper we analyse the bargaining regime wage-effect in Portugal. The results indicate that the bargaining regime coverage is important in explain- ing the variability of wages. Wage differentials between bargaining regimes are substantial, a fact which may be related to a decentralised wage setting which pre- vails in Portugal. The highest wages are generated by multi-firm negotiations and the lowest are generated by sectoral contracts. Single-firm contracts align at an intermediate level in the ranking.Financial support from program PRAXIS XXI under grant PRAXIS/2/2.1/CSH/781/95 and FEDER is acknowledged. The third author also acknowledges financial support from program PRAXIS XXI under grant BD/3486/94 and from the University of the Azores.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

OVERSEE: Identification Of Anomalous Vessel Behaviour

This project revolves around the detection of anomalous behaviors, more specifically on maritime vessels and using the Automatic Identification System (AIS) data. To accomplish the intended goal while having several restrictions like the large amounts of data which imply performance issues or the lack of labelled data and restrictions on creating one since anomalous behavior should be detected even without a priori characterization. To achieve the detection of anomalies Hierarchical Temporal Memory (HTM) based algorithms were used. HTM theory core is based on cortical research, the algorithms used on this project have as focus the ability to learn temporal sequences, since the behavior of maritime vessels is described by a data stream of AIS data which includes fields like the geolocation, speed over ground (SOG), course over ground (COG), vessel type or identification. This project starts with the expectation that an algorithm that can use the sequences of behavior instead of the behavior at any point in time will present better results.The first step of the project was to understand how to use HTM algorithms to detect anomalous behavior. The basic model used to process the data is composed of several components. The first is a Geospatial Encoder which transforms coordinates data into Sparse Distributed Representations (SDRs) used on all other steps of the process. SDRs are basically a list of bits, each being a 0 or 1 depending on the input data but with semantic meaning which produces differences from simple binary data. The second being a Spatial Pooler algorithm able to make use of the SDRs semantics and able to normalize the data while maintaining encoded information and presenting the first step on the general learning capabilities, being able to learn and predict the next step based only on the current information. The last component is the Temporal Memory, it extends the capability of the learning algorithm, it enables the prediction of the future data based on the sequence of data previously learned. All these components allow the ability to learn complex sequences of data, in this project the ability to learn sequences was first applied to learn sequences of positions. The ability to learn sequences and later perform predictions allows a simple way of detecting anomalous behavior. After the creation of a model capable of having as input the current position and making predictions, an anomalous behavior should be detected when a prediction is very different from the actual next value. In this case if there's no close prediction to a position after the sequence of positions being previously assessed then an abnormal behavior is detected.The next phase of the project was about improving the characterization of the sequences, the vessel trajectories are not only characterized by positions but also by other information like speed or the timestamp at each new data point. This data could be used directly or by derivation of new information, e.g. timestamp can be converted into time from sequence start. To use these data as input was also important to choose the right encoder and pertinent parameters. To accomplish these a better understanding of the vessels' trajectories is fundamental to which an analysis of the data was conducted. Still, the main concern on this stage was to try different data with different HTM algorithm parameters to understand the impact of different information on the ability to detect anomalies while trying to improve the performance both in terms of learning sequences, reducing false anomalies, and improving the amount of information describing a sequence, boosting the ability to find true anomalies. This is the main phase and involves a multitude of experiments and the definition of some metrics and data samples to allow the quantification of the results obtained in order to compare different models.With an increasingly number of ships equipped with an Automatic Identification System more and more data is being generated and creating an opportunity for new studies of the maritime vessel behaviors.The problem of securing and protecting vast expanses of the maritime zone could use the help of an automatic vessel anomalous behavior system. With that objective in mind the development of this project took the capabilities of Hierarchical Temporal Memory theory and respective algorithms to help identify anomalous behaviors on vessel trajectories improving sea monitoring capabilities and the possibility of more opportune warnings and subsequent action plans from simple contact or vessel identification to arrest or rescue missions

A eficácia escolar e liderança pedagógica percebida e o sucesso dos alunos

O presente estudo aborda o sucesso escolar sob a proeminência e polivalência de dois referentes do desenvolvimento organizacional e epistemológico: a eficácia e a liderança instrucional. As teorias, os modelos, as perspetivas, os problemas, as questões, as variáveis são propostas a um ritmo de conflitualidade e descontinuidade e bipolaridade: Os fatores de sucesso são macroestruturais, organizacionais, políticos, grupais, individuais? Qual o estado da problemática científica? O determinismo de Coleman, a reunificação genética e a insolvência da adaptação ou o estatuto diferenciado da organização escolar enquanto rede social de processo cognitivo? Há dados de investigação que preconizam os efeitos observáveis da liderança no desempenho dos alunos. A melhoria das escolas passa pelo comportamento de liderança educativa e profissional: o líder intensifica interações e estimula a motivação do sucesso. Outros autores, outras tendências evidenciam uma expressão moral na qualidade da liderança. O desenvolvimento organizacional da escola eficaz é comportamento colaborativo e que maximiza o clima de trabalho. No contexto empírico, duas dimensões são diferenciadas: o processo metodológico e a análise de resultados. O pressuposto é determinado pela abrangência da modelagem multinível e seletividade em diferentes variáveis e contextos que afetam o rendimento e sucesso escolar dos alunos. Objetivo mais concreto do estudo é validar os efeitos pedagógicos no sucesso escolar, analisar a influência do professor sobre práticas e respostas de aprendizagem. Tudo é suportado pela dinâmica do projeto de Investigação 3EM, que por sua vez executa-se como uma abordagem modelada pela investigação e problemática da eficácia escolar