Dealing with copper toxicity: new insights into copper detoxification in yeast

Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016Copper, an essential metal, is a double-edged sword, as its vital nature is counterbalanced by the toxic effect that it can exert on cells when not properly controlled. As such, organisms have evolved defence mechanisms against copper toxicity and, in the yeast Saccharomyces cerevisiae, the transcription factor Ace1 orchestrates several of those mechanisms, by activating copper-detoxification genes. In Saccharomyces cerevisiae iron uptake is partially dependent on copper, as the membrane multicopper-oxidase Fet3, which is part of the high-affinity iron uptake system, requires copper as a cofactor. Aft1, the low iron-sensing transcription factor in yeast, is known to regulate the expression of FET3 gene. However, we found that a strain lacking FET3 is more sensitive to copper surplus conditions than a strain carrying the AFT1 gene disrupted. This finding suggests that under such conditions another regulator came into play and controls FET3 gene expression. We next evaluated whether Ace1 could be the alternative regulator of FET3 under copper excess. To test this hypothesis, the expression of FET3 gene in cells lacking ACE1, AFT1 or both was monitored, using yeast-one hybrid and qRT-PCR approaches. A decrease of FET3 transcripts is observed, under copper loading, when ACE1 is deleted, suggesting that Ace1 is involved in FET3 regulation. Remarkably, in the absence of AFT1 we observed a copper-dependent induction of FET3 gene that was, however, completely abrogated when ACE1 was deleted from the aft1 mutant background. Our data clearly indicates that FET3 expression is dependent on Ace1 when copper is overly abundant. In this study, the link between iron and copper homeostasis was further established. Indeed, we found that ace1 cells display marked upregulation of Aft1’s targets, such as CTH2, and accumulate higher amounts of iron and copper, in a mechanism dependent on Aft1. Altogether, this work unveiled a novel protection mechanism against copper toxicity mediated by Ace1, which relies in the activations of FET3 and results in the restriction of Aft1 activity as to prevent excessive copper accumulation.O cobre é um metal essencial para a vasta maioria dos organismos, maioritariamente devido às suas propriedades de oxidação-redução, que o tornam ideal para ser cofactor de inúmeras proteínas. Nos humanos, o cobre é essencial para inúmeras funções celulares, nomeadamente para o metabolismo energético, produção de melanina e catecolaminas, destoxificação de espécies reactivas de oxigénio e homeostase de ferro. No entanto, a sua natureza essencial é contrabalançada pelos efeitos tóxicos causados quando este metal está presente em níveis acima dos considerados fisiológicos. De facto, sabe-se que o excesso de cobre potencia a produção de espécies reactivas de oxigénio (ROS), através da reacção de Fenton, e que este metal pode mesmo danificar os centros metálicos de enzimas e proteínas, levando à perda de função. Assim, os organismos desenvolveram inúmeros mecanismos de defesa contra a toxicidade provocada pelo cobre. Na levedura Saccharomyces cerevisiae, o factor de transcrição Ace1 é o responsável pela regulação destes mecanismos, ao activar genes de destoxificação do cobre, tais como genes codificantes de metalotioneínas CUP1 e CRS5, que actuam como quelantes de iões de cobre, e o gene SOD1, que codifica o superóxido dismutase, enzima que além de conter cobre no seu centro activo, é essencial na resposta ao stress oxidativo causado por este metal. Em Saccharomyces cerevisiae a entrada de ferro (Fe) na célula é parcialmente dependente do cobre, uma vez que o Fet3, uma ferroxidase de membrana que faz parte do complexo de transporte de alta afinidade de ferro, requer cobre como cofactor. O Aft1, o principal factor de transcrição envolvido na resposta à deficiência de ferro em levedura, é o conhecido regulador da expressão do gene FET3. No entanto, diversos resultados apresentados neste trabalho demonstram claramente que uma estirpe sem o gene FET3 é mais sensível ao excesso de cobre do que uma estirpe mutada no gene AFT1. Esta evidência sugere que, em condições de excesso de cobre, um outro regulador controla a expressão do gene FET3. Deste modo, foi avaliada a possibilidade de o factor de transcrição Ace1 ser o regulador alternativo do gene FET3 em condições de excesso de cobre. De facto, a região promotora do gene FET3 contém uma possível sequência de ligação do Ace1, localizada a -578 bp a montante do codão de iniciação ATG (+1). Através da monitorização dos níveis de expressão do FET3 na estirpe-selvagem e na estirpe mutada no gene ACE1 (mutante ace1), foi possível concluir que o factor de transcrição Ace1 está envolvido na regulação do gene FET3. Foi ainda observado que mesmo na ausência do regulador Aft1, ocorre uma indução da expressão do FET3, dependente do cobre que, no entanto, é totalmente suprimida quando se elimina o geneACE1. Através da monitorização da expressão de um dos genes alvo do factor de transcrição Aft1, CTH2, na estirpe selvagem e na estirpe ace1, em condições de excesso de cobre, através da técnica de qRT-PCR, observou-se que, na ausência do Ace1, há um aumento drástico dos níveis dos transcritos de CTH2. Estes dados sugerem que, na estirpe mutante ace1, a homeostase de ferro encontra-se desregulada, pelo que ocorrerá uma super-activação do factor Aft1. De acordo com esta hipótese, foi observado que a estirpe ace1 contém níveis de ferro e de cobre intracelulares marcadamente elevados quando comparados com os da estirpe-selvagem. Esta acumulação é dependente da actividade do regulador Aft1, uma vez que a sua eliminação (na estirpe mutante aft1ace1) repõe os níveis dos dois metais para valores semelhantes aos da estirpe-selvagem. O Fet3 é um enzima importante para a resposta celular ao excesso de cobre. Foi descrito que a estirpe mutante fet3 acumula grandes quantidades de cobre. Neste estudo, observou-se que esta acumulação ocorre através de um mecanismo dependente do factor de transcrição Aft1, dado que o duplo mutante fet3aft1 reverte os níveis de cobre intracelulares para níveis semelhantes aos da estirpe selvagem. Através da análise dos genes alvo do Aft1, foram seleccionados possíveis proteínas envolvidas neste mecanismo. A deleção do genes FET4, que codifica um transportador de ferro de baixa afinidade, que também tem a capacidade de transportar cobre, e do ARN4, que codifica um transportador de sideróforos de ferro, cujo substrato é a enterobactina, levou a um ganho de resistência ao cobre quando deletados de uma estirpe fet3. Resultados semelhantes foram registados após a deleção do gene FRE1, que codifica uma metaloreductase de membrana, envolvida no transporte de ferro e cobre. Estes resultados evidenciaram que a acção combinada de várias proteínas envolvidas no transporte de ferro contribuem para a acumulação de cobre observada numa estirpe mutante fet3. Assim a deficiência de ferro observada na estirpe mutante fet3, conduzirá à activação do factor de transcrição Aft1 que induzirá a expressão dos genes dessas proteínas, numa tentativa de colmatar a falta de ferro consequente da perda do sistema de transporte de ferro de alta afinidade. Neste estudo, foi ainda possível observar que a estirpe mutante aft1, que apresenta um fenótipo de sensibilidade em condições normais crescimento, recupera o seu défice de crescimento quando cobre é adicionado ao meio de cultura. Contrariamente ao esperado, a atenuação observada não é devida a um aumento do conteúdo intracelular de ferro, quando as células são crescidas na presença de cobre, uma vez que os níveis de ferro da estirpe aft1 são inferiores aos níveis registados quando cultivada em condições normais de crescimento. Com o objectivo de compreender o mecanismo subjacente a este fenómeno, testaram-se outras vias dependentes de cobre poderiam estar afectadas em condições normais de crescimento no mutante aft1, nomeadamente a respiração mitocondrial, (dado que o cobre é um cofactor do citocromo c oxidase), e a resposta ao stress oxidativo (uma vez que o cobre faz parte do Cu,Zn-Superóxido dismutase). Através da análise da sensibilidade do mutante aft1 em meio YPDGE (meio de cultura rico, contendo quase exclusivamente fontes de carbono não fermentáveis), concluiu-se que a adição de cobre melhora a capacidade respiratória da estirpe aft1, dado que foi observado uma significativa recuperação da sensibilidade deste mutante. Além disso, a análise fenotípica do mutante aft1 cultivado em meio contendo paraquat (um composto gerador de anião superóxido), suplementado ou não com cobre, permite concluir que a adição de cobre alivia também a sensibilidade desta estirpe ao stress oxidativo provocado pelo paraquat. Assim, os resultados obtidos sugerem que numa estirpe aft1 a adição de cobre promove o metabolismo respiratório e fortalece a resposta ao stress oxidativo, contribuindo desta forma para o aliviar do défice de crescimento exibido por esta estirpe. Assim, no seu conjunto, os dados apresentados nesta dissertação permitem propor uma nova via de destoxificação de cobre mediada pelo factor de transcrição Ace1. Em condições de excesso de cobre, as células de levedura activam este regulador, que por sua vez irá induzir a expressão do gene FET3. Sendo uma proteína que contém cobre no seu centro activo, o enzima Fet3 contribui não só para o tamponamento dos iões de cobre livres presentes no citosol, como também para a entrada de ferro na célula. A entrada de ferro irá prevenir a activação excessiva do Aft1, e consequente expressão dos seus genes alvo, limitando assim a entrada de mais cobre através de transportadores de baixa afinidade para ferro, o que eventualmente, levaria à morte celular. Assim, neste estudo foi pela primeira vez demonstrado que além do seu papel essencial na destoxificação do cobre intracelular, o Ace1 possui também um papel fundamental na prevenção da entrada de cobre extracelular

Copper Acts Synergistically With Fluconazole in Candida glabrata by Compromising Drug Efflux, Sterol Metabolism, and Zinc Homeostasis

Funding Information: This work was supported by (1) Project LISBOA-01-0145-FEDER-007660 (“Microbiologia Molecular, Estrutural e Celular”) funded by FEDER funds through COMPETE2020 – “Programa Operacional Competitividade e Internacionalização” (POCI); (2) “Fundação para a Ciência e a Tecnologia” (FCT) through programme IF (IF/00124/2015) to CP; (3) the European Union’s Horizon 2020 Research and Innovation Programme under grant agreement No. 810856; (4) COST Action CA15133, supported by COST (European Cooperation in Science and Technology); and (5) PPBI – Portuguese Platform of BioImaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) co-funded by national funds from OE – “Orçamento de Estado” and by FEDER. AG-C was supported by a FCT Ph.D. fellowship (SFRH/BD/118866/2016), and CA and VP by a FCT contract according to DL57/2016 (SFRH/BPD/74294/2010 and SFRH/BPD/87188/2012, respectively). Publisher Copyright: Copyright © 2022 Gaspar-Cordeiro, Amaral, Pobre, Antunes, Petronilho, Paixão, Matos and Pimentel.The synergistic combinations of drugs are promising strategies to boost the effectiveness of current antifungals and thus prevent the emergence of resistance. In this work, we show that copper and the antifungal fluconazole act synergistically against Candida glabrata, an opportunistic pathogenic yeast intrinsically tolerant to fluconazole. Analyses of the transcriptomic profile of C. glabrata after the combination of copper and fluconazole showed that the expression of the multidrug transporter gene CDR1 was decreased, suggesting that fluconazole efflux could be affected. In agreement, we observed that copper inhibits the transactivation of Pdr1, the transcription regulator of multidrug transporters and leads to the intracellular accumulation of fluconazole. Copper also decreases the transcriptional induction of ergosterol biosynthesis (ERG) genes by fluconazole, which culminates in the accumulation of toxic sterols. Co-treatment of cells with copper and fluconazole should affect the function of proteins located in the plasma membrane, as several ultrastructural alterations, including irregular cell wall and plasma membrane and loss of cell wall integrity, were observed. Finally, we show that the combination of copper and fluconazole downregulates the expression of the gene encoding the zinc-responsive transcription regulator Zap1, which possibly, together with the membrane transporters malfunction, generates zinc depletion. Supplementation with zinc reverts the toxic effect of combining copper with fluconazole, underscoring the importance of this metal in the observed synergistic effect. Overall, this work, while unveiling the molecular basis that supports the use of copper to enhance the effectiveness of fluconazole, paves the way for the development of new metal-based antifungal strategies.publishe

An internal promoter drives the expression of a truncated form of ccc1 capable of protecting yeast from iron toxicity

Funding Information: This work was supported by Project LISBOA-01-0145-FEDER-007660 (?Microbiologia Molecular, Estrutural e Celular?) funded by FEDER funds through COMPETE2020??Programa Operacional Competitividade e Internacionaliza??o? (POCI); ?Funda??o para a Ci?ncia e a Tecnologia? (FCT) grants EXPL/BIA-MIC/2525/2013 and programme IF (IF/00124/2015) to C.P.; grant PTDC/BIA-BQM/31317/2017 to C.V.R.; the European Union?s Horizon 2020 research and innovation programme under grant agreement No. 810856 and 857203; COST Action CA15133, supported by COST (European Cooperation in Science and Technology) and PPBI?Portuguese Platform of BioImaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) co-funded by national funds from OE??Or?amento de Estado? and by FEDER. C.A. (SFRH/BPD/74294/2010), S.M.C. (SFRH/BD/91077/2012), C.V.R. (SFRH/BPD/94050/2013) and A.G.-C. (SFRH/BD/118866/2016) were supported by FCT contracts or fellowships. Funding Information: Funding: This work was supported by Project LISBOA-01-0145-FEDER-007660 (“Microbiologia Molecular, ?strutural e Celular”) funded by F?D?R funds through COMP?T?2020—“Programa Operacional Competitividade e Internacionalização” (POCI); “Fundação para a Ciência e a Tecno-logia” (FCT) grants ?XPL/BIA-MIC/2525/2013 and programme IF (IF/00124/2015) to C.P.; grant PTDC/BIA-BQM/31317/2017 to C.V.R.; the ?uropean Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under grant agreement No. 810856 and 857203; COST Action CA15133, supported by COST (European Cooperation in Science and Technology) and PPBI—Portuguese Platform of Bi-oImaging (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) co-funded by national funds from OE—“Orçamento de Estado” and by FEDER. C.A. (SFRH/BPD/74294/2010), S.M.C. (SFRH/BD/91077/2012), C.V.R. (SFRH/BPD/94050/2013) and A.G.-C. (SFRH/BD/118866/2016) were supported by FCT contracts or fellowships. Publisher Copyright: © 2021 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland.In yeast, iron storage and detoxification depend on the Ccc1 transporter that mediates iron accumulation in vacuoles. While deletion of the CCC1 gene renders cells unable to survive under iron overload conditions, the deletion of its previously identified regulators only partially affects survival, indicating that the mechanisms controlling iron storage and detoxification in yeast are still far from well understood. This work reveals that CCC1 is equipped with a complex transcriptional structure comprising several regulatory regions. One of these is located inside the coding sequence of the gene and drives the expression of a short transcript encoding an N-terminally truncated protein, designated as s-Ccc1. s-Ccc1, though less efficiently than Ccc1, is able to promote metal accumulation in the vacuole, protecting cells against iron toxicity. While the expression of the s-Ccc1 appears to be repressed in the normal genomic context, our current data clearly demonstrates that it is functional and has the capacity to play a role under iron overload conditions.publishersversionpublishe

Care4Value:measuring value in health in integrated continuous care units

Objective: To develop a digital platform for optimizing data collection processes with medical scales and monitoring data for measuring value in health. Method: Using an investigative intervention methodology, a platform was developed including qualitative and quantitative approaches in three phases: focal groups were conducted by a multidisciplinary team of investigators and healthcare providers at the pilot study site, an Integrated Continuous Care Unit (UCCI); data from a sample of 21 UCCI users was analyzed as a pre-test to classify different levels of complexity; UCCI financial data and operational costs were collected and analyzed during the 21 users stay at the UCCI. The platform’s iteractive and incremental development allowed for the collection of as a form of improvement. Results: The platform includes three modules: a mobile application; a dashboard; and an import module. Data collected on the platform are centralized and shown on the dashboard. Data are collected using a mobile application and/or an import module to input data from existing medical systems. Conclusion: The mobile application is ready to be used by healthcare providers and caregivers. The dashboard shows users’ clinical follow-up and health gain data for monitoring.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Pullulan-based nanoparticles as carriers for transmucosal protein delivery

Polymeric nanoparticles have revealed very effective in transmucosal delivery of proteins. Polysaccharides are among the most used materials for the production of these carriers, owing to their structural flexibility and propensity to evidence biocompatibility and biodegradability. In parallel, there is a preference for the use of mild methods for their production, in order to prevent protein degradation, ensure lower costs and easier procedures that enable scaling up. In this work we propose the production of pullulan-based nanoparticles by a mild method of polyelectrolyte complexation. As pullulan is a neutral polysaccharide, sulfated and aminated derivatives of the polymer were synthesized to provide pullulan with a charge. These derivatives were then complexed with chitosan and carrageenan, respectively, to produce the nanocarriers. Positively charged nanoparticles of 180-270 nm were obtained, evidencing ability to associate bovine serum albumin, which was selected as model protein. In PBS pH 7.4, pullulan-based nanoparticles were found to have a burst release of 30% of the protein, which maintained up to 24h. Nanoparticle size and zeta potential were preserved upon freeze-drying in the presence of appropriate cryoprotectants. A factorial design was approached to assess the cytotoxicity of raw materials and nanoparticles by the metabolic test MTT. Nanoparticles demonstrated to not cause overt toxicity in a respiratory cell model (Calu-3). Pullulan has, thus, demonstrated to hold potential for the production of nanoparticles with an application in protein delivery

Knowledge, attitude and practice of condom use by women of an impoverished urban area

OBJECTIVE Assessing the adequacy of knowledge, attitude and practice of women regarding male and female condoms as STI/HIV preventive measures. METHOD An evaluative Knowledge, Attitude and Practice (KAP) household survey with a quantitative approach, involving 300 women. Data collection took place between June and August 2013, in an informal urban settlement within the municipality of João Pessoa, Paraiba, Northeast Brazil. RESULTS Regarding the male condom, most women showed inadequate knowledge and practice, and an adequate attitude. Regarding the female condom, knowledge, attitude and practice variables were unsatisfactory. Significant associations between knowledge/religious orientation and attitude/education regarding the male condom were observed. CONCLUSION A multidisciplinary team should be committed to the development of educational practices as care promotion tools in order to improve adherence of condom use

Çédille, revista de estudios franceses

Presentació

5-Lipoxygenase-dependent recruitment of neutrophils and macrophages by eotaxin-stimulated murine eosinophils

Made available in DSpace on 2014-11-06T17:31:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 5-Lipoxygenase-Dependent Recruitment of Neutrophils and Macrophages by....pdf: 4182730 bytes, checksum: 4feed5498cec072c9157f73603c6f0a2 (MD5) license.txt: 1914 bytes, checksum: 7d48279ffeed55da8dfe2f8e81f3b81f (MD5) Previous issue date: 2014Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de Ciências da Saúde. Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Departamento de Imunologia. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Fernandes Figueira. Departamento de Pediatria. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de Ciências da Saúde. Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Departamento de Imunologia. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Fernandes Figueira. Departamento de Pediatria. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de Ciências da Saúde. Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Departamento de Imunologia. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de Ciências da Saúde. Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Departamento de Imunologia. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de Ciências da Saúde. Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Departamento de Imunologia. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de Ciências da Saúde. Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Departamento de Imunologia. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira. Departamento de Microbiologia Médica. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Fernandes Figueira. Departamento de Pediatria. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.The roles of eosinophils in antimicrobial defense remain incompletely understood. In ovalbumin-sensitized mice, eosinophils are selectively recruited to the peritoneal cavity by antigen, eotaxin, or leukotriene(LT)B4, a 5-lipoxygenase (5-LO) metabolite. 5-LO blockade prevents responses to both antigen and eotaxin.We examined responses to eotaxin in the absence of sensitization and their dependence on 5-LO. BALB/c or PAS mice and their mutants (5-LO-deficient ALOX; eosinophil-deficient GATA-1) were injected i.p. with eotaxin, eosinophils, or both, and leukocyte accumulation was quantified up to 24 h. Significant recruitment of eosinophils by eotaxin in BALB/c, up to 24 h, was accompanied bymuch larger numbers of recruited neutrophils andmonocytes/macrophages. These effects were abolished by eotaxin neutralization and 5-LO-activating protein inhibitor MK886. In ALOX (but not PAS) mice, eotaxin recruitment was abolished for eosinophils and halved for neutrophils. In GATA-1 mutants, eotaxin recruited neither neutrophils nor macrophages. Transfer of eosinophils cultured from bone-marrow of BALB/c donors, or from ALOX donors, into GATA-1 mutant recipients, i.p., restored eotaxin recruitment of neutrophils and showed that the critical step dependent on 5-LO is the initial recruitment of eosinophils by eotaxin, not the secondary neutrophil accumulation. Eosinophil-dependent recruitment of neutrophils in naive BALB/c mice was associated with increased binding of bacteria