Examining the Role of Supervisor Support on Generation Z\u27s Intention to Quit

The purpose of this research is to examine Generation Z’s unmet expectations and work-related boredom and its impact on their intention to quit. The study investigates the moderating role of the supervisor support in the relationship between work-related boredom and intention to quit. This research advances the understanding of the adverse effects of employees\u27 unmet expectations and work-related boredom. Generation Z joins the organizations with unrealistic expectations of work that, in turn, promote lower levels of commitment and higher turnover, and therefore warrants more research. Data were collected from 336 Generation Z respondents working in the information technology industry. The data were analyzed using least square regressions and bootstrapping techniques. The findings confirm that supervisor support moderates the relationship between work-related boredom and employees’ intention to quit such that if the degree of supervisor support is higher, then the relation is weaker. HRM practitioners need to be candid in explaining the job description and job specifications during the interview; more importantly, organizations need to address the expectations even before they are hired. The findings indicate that high supervisor support buffers the adverse effects of unmet expectations and work-related boredom. The study suggests that coaching could be an effective tool to support Generation Z’s aspirations and well-being in the workplace. Therefore, organizations should make coaching a key element in the organization’s culture and part of a manager\u27s job

Purification and characterization of heterologously produced cannabinoid receptor 1 and G proteins

G protein coupled receptors form the largest group of transmembrane proteins, which are involved in signal transduction and are targeted directly or indirectly by 40-50% of the drugs in the market. Even though a lot of biochemical and pharmacological information was acquired for these receptors in the past decades, structural information is still insufficient. G protein coupled receptors are expressed in a very minute scale in the tissues. Purification of G protein coupled receptors, in amounts needed for structural studies, from native tissue is tedious and almost impossible. To overcome this first hurdle of insufficient protein, several heterologous protein expression systems are being used. Another difficulty in structural determination of a G protein coupled receptor is that it is a membrane protein. Membrane proteins are difficult targets for structural studies. One of the possible reasons is the little hydrophilic surface area on the membrane protein, reducing the chances of crystal contact between the molecules. The present work is an attempt to investigate possible ways to overcome these problems. Aim of the project was to use G proteins to increase the hydrophilic area of the G protein coupled receptor. G protein is a physiological partner to the G protein coupled receptor which makes the complex functionally relevant. In the present work five G alpha proteins were purified to homogeneity by a two step purification using metal affinity and ion-exchange chromatography. The G alpha subunits purified were tested for their detergent susceptibility. It was found that only some G proteins were active in the presence of detergent. Observation from contemporary reports also suggest that the G alpha proteins expressed in Escherichia coli, alone may not be sufficient to bind to the G protein coupled receptors in solution. So the project was extended towards expressing a G protein coupled receptor which was reported to exist in a complex with the G proteins, in the cells. Purifying such a functional complex could be more beneficial to use for crystallization. Cannabinoid receptors were chosen for heterologous expression and purification. Production of recombinant cannabinoid receptor 2 was investigated in Pichia pastoris. The protein obtained was highly heterogenous. There were several oligomeric forms as well as degradation products in the cell membranes. Most of the protein was lost in the purification steps leading to a poor yield. Several oligomeric forms and other impurities were still present in the protein sample after purification. Alternatively, a baculovirus mediated insect cell expression system was investigated, to produce the receptors. Cannabinoid receptor 1 was investigated in insect cell expression system because of its better biochemical understanding and pharmacological importance than cannabinoid receptor 2. Cannabinoid receptor 1 was produced in two forms, a full length and a distal carboxy terminal truncated version. All the several gene constructs made could be expressed in the Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells. Expression levels (Bmax) for the constructs with a decahistidine tag at the amino terminus and Strep-tagII at the carboxy terminus were 40 pmol/mg and 53 pmol/mg respectively, for full length and truncated versions. These expression levels are 2 fold higher than the levels reported till now in the literature. As was quite evident from previous experiences of other research groups, purification of this receptor was a challenge. Protein purified from immobilized metal affinity chromatography (Ni-nitrilo tri acetate)(Ni-NTA) was not even 50% pure. A second purification by immobilized monomeric avidin or Streptactin agarose, making use of Biotag and StreptagII respectively, drastically reduced the protein recovery. Later on, purification of receptor was investigated on different metal chelating resins. His-Select, a Ni-NTA based matrix from Sigma, with much lesser density than Ni-NTA from Qiagen, showed a better purification profile. Purification was optimized to get 80% homogeneity but with low yield (20%). Further efforts are needed to improve the yield and purity of the receptor, to use it for crystallization. Cannabinoid receptors are known to exist in a precoupled form to G proteins in the cells. The existence of such precoupled forms of the receptor was investigated using the fluorescence techniques. Guanosine-5-triphosphate binding assay on the cell membranes, in the absence of agonists confirmed the active precoupled form of the receptor. It was found that it is possible to co-immunoprecipitate the complex. These results show that the truncated cannabinoid receptor can be produced in functional form in insect cells in much higher yields than reported. This receptor exists as a complex with G proteins even in the absence of ligands. It was also shown that the receptor/G protein complex can be coimmunoprecipitated. Further work is required to investigate the possibility of purifying this complex to use it for co-crystallization.G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Hauptklasse innerhalb jener Gruppe von Transmembranproteinen, die ein extrazelluläres Signal in eine spezifische intrazelluläre Reaktion (Signaltransduktion) umwandeln. Etwa 3% des humanen Genoms codieren für GPCRs, wobei diese wiederum den Angriffspunkt für 40-50% der zurzeit auf dem Markt befindlichen Pharmaka bilden. Diese Angaben unterstreichen die Wichtigkeit der GPCR-Superfamilie und verdeutlichen die Notwendigkeit für ein tief greifendes Verständnis ihrer Funktionsweise. Die externen Stimuli, die über GPCRs eine spezifische intrazelluläre Reaktion auslösen können, sind sehr vielfältig. Sie reichen von Licht, Geruchs- und Geschmacksstoffen über Amine, Peptide, Lipiden und Nukleotiden bis hin zu Ionen wie etwa Ca2+. Die ligandeninduzierte Konformationsänderung des Rezeptors überträgt das Signal auf ein cytosolisches Guanin-Nukleotide bindendes Protein (GProtein), das daraufhin seinerseits eine Kaskade zellulärer Reaktionen startet. Während in den letzten Jahrzehnten vielfältigste biochemische und pharmakologische Daten über diese Proteinfamilie gesammelt werden konnten, sind die vorhandenen Strukturinformationen immer noch sehr ungenügend. Die einzige für diese Proteinsuperfamilie bisher verfügbare dreidimensionale Struktur hoher Auflösung ist die des bovinen Rhodopsins. Einer der Hauptgründe für die Schwierigkeit der Stukturaufklärung bei GPCRs ist die mangelnde Verfügbarkeit des Zielproteins selbst: In ihren nativen Geweben werden GPCRs üblicherweise nur in verschwindend geringen Mengen exprimiert. Daher ist die Reinigung der für Strukturuntersuchungen benötigten Mengen aus nativen Geweben stets sehr zeitaufwendig und in vielen Fällen gar nicht möglich. Um diese erste Hürde auf dem Weg der Strukturaufklärung zu überwinden, wurde eine Vielzahl heterologer Expressionssysteme etabliert. Eine weitere Schwierigkeit bei der Strukturbestimmung von GPCRs liegt in der Tatsache begründet, dass es sich bei dieser Proteinfamilie um integrale Membranproteine handelt, und bei diesen eine Strukturbestimmung generell eine große Herausforderung darstellt. Während zurzeit bei den löslichen Proteinen bereits mehr als 13000 hochauflösende Strukturen zur Verfügung stehen, sind es bei den Membranproteinen gerade einmal etwa 120. Einer der Gründe für dieses dramatische Ungleichgewicht dürften die nur recht kleinen hydrophilen Oberflächenbereiche der Membranproteine sein, da hierdurch die Möglichkeiten für Kristallkontakte zwischen den einzelnen Proteinmolekülen einschränkt wird. Bei GPCRs letztlich werden die einzigen hydrophilen Bereiche von den die Transmembranhelices verbindenden intra- und extrazellulären Schleifen sowie den N- und C-Termini gebildet. Die genannten Bereiche sind sowohl relativ klein als auch strukturell eher flexibel, was eine Kristallisation weiter erschwert. Die vorliegende Arbeit ist ein Versuch, Wege zur Lösung der oben genannten Probleme aufzuzeigen. Ziel des Projektes war die Verwendung von G-Proteinen, um zusammen mit einem GPCR einen Komplex zu schaffen, dessen hydrophiele Beireiche stark vergrößert sind. Es handelt sich hierbei um einen der Protein-Kokristallisation mit Fv-Antikörperfragmenten entsprechenden Ansatz. Da es sich bei G-Proteinen zudem um den physiologischen Bindungs- und Interaktionspartner der GPCRs handelt, wäre die Struktur eines solchen Komplexes zudem von besonderem Interesse. Bei G-Proteinen handelt es sich um heterotrimere Proteine, mit je einer alpha-, beta- und gamma-Untereinheit, wobei der alpha-Untereinheit (G alpha) bei der Wechselwirkung mit dem GPCR die größte Bedeutung zukommt. Im humanen Genom wurden 21 verschiedenartige alpha-Untereinheiten identifiziert, wobei es sich jedoch bei einigen von ihnen um Splice-Varianten handelt. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 16 verschiedene G-alpha-Untereinheiten unter Verwendung des GATEWAY®-Systems in den Vektor pDEST14 kloniert und in Escherichia coli expremiert. Zur Bestimmung der optimalen Induktionsbedingungen und -zeiten kam ein Hochdurchsatz-Screen auf Dotblot-Basis zum Einsatz. Bei fünf der in E. coli exprimierten G-alpha-Untereinheiten war es möglich, diese mittels einer Kombination aus Immobilisierter Metallchelat-Affinitätschromatographie (IMAC) und Ionenaustausch-Chromatographie rein darzustellen. Die Bemühungen, auch die G-beta- und G-gamma-Untereinheiten in E. coli herzustellen, waren hingegen nicht erfolgreich. G-alpha-q, das zu jenen G-alpha-Untereinheiten zählt, die sich nicht in E. coli expremieren ließen, wurde erfolgreich in der methylotrophen Hefe Pichia Pastoris produziert. Das aus P. pastoris gereinigte G-alpha-q-Protein konnte für Kristallisationsansätze genutzt werden. Unter einer Bedingung wurden Kristalle erhalten, die eine Röntgenbeugung bis 6,5 Å zeigten. Zurzeit besteht ein Problem bei der Produktion dieser Untereinheit, das noch der Klärung bedarf. Die G-alpha-Untereinheiten, die rein dargestellt werden konnten, wurden hinsichtlich ihrer Aktivität in Detergenz analysiert. Hierbei zeigte sich, dass die Mitglieder der G-alpha-s-Subklasse (stimulieren die Adenylat-Cyclase) in Detergenz keinerlei Aktivität aufwiesen. Die Mitglieder der G-alpha-i-Subklasse (inhibieren die Adenylat-Cyclase) behielten hingegen in den meisten der getesteten Detergenzien ihre Fähigkeit der Guanosintriphosphat(GTP)-Bindung bei. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass die Kokristallisation eines GPCRs mit G-alpha-s wohl nicht sinnvoll ist, da bei solchen Ansätzen aufgrund des Rezeptors stets Detergenz anwesend sein muss. Zu diesem Zeitpunkt des Projektes standen in unserem Institut nur wenige an G-alpha-i koppelnde GPCRs zur Verfügung, die in ausreichenden Mengen rein dargestellt werden konnten um die G-alpha-i-Bindung zu studieren. Des Weiteren legten andere Veröffentlichungen nahe, dass in E. coli produzierte G-alpha-Untereinheiten alleine nicht in der Lage sind, an GPCRs zu binden. Aus diesen Gründen wurde das Projekt dahingehend erweitert, einen jener GPCRs zu gewinnen, von denen berichtet wurde, sie lägen in der Zelle bereits ohne gebundenen Liganden in einem Komplex mit ihrem G-Protein vor. Von der Reinigung eines solchen physiologischen Komplexes wurden sich erhebliche Vorteile für die Kristallisation versprochen. Für die heterologe Produktion und anschließende Reinigung unter oben genanntem Aspekt wurden die Cannabinoid-Rezeptoren ausgewählt. Zurzeit unterscheidet man zwei Subtypen von Cannabinoid-Rezeptoren. Zum einen den Cannabinoid-Rezeptor 1, der vornehmlich im zentralen und peripheren Nervensystem vorkommt und zum anderen den Cannabinoid-Rezeptor 2, welcher in Immunzellen gefunden wird. Beide Subtypen koppeln an G-alpha-i/o. Aus ihrer histologischen Verteilung wurde gefolgert, dass der Cannabinoid-Rezeptor 1 vermutlich eine neuroprotektive Funktion hat, während der Cannabinoid-Rezeptor 2 immunosuppressiv wirkt. Die Cannabinoid-Rezeptoren sind zudem der Angriffspunkt der Inhaltsstoffe von Cannabis (Marihuana, Haschisch), der am weitesten verbreiteten Rauschmittel. Die Verwendung von Marihuana geht jedoch über die eines bloßen Rauschmittels hinaus, da es bereits seit 2000 vor Christus zur Behandlung einer Reihe von Krankheiten eingesetzt wird. Der Pflanzenextrakt aus Cannabis sativa war z.B. dafür bekannt, Schmerzen zu lindern, Übelkeit zu unterdrücken und den Appetit zu fördern. Nach wissenschaftlicher Analyse des Cannabis sativa-Extraktes konnte delta-9-Tetrahydrocannabinol als hauptsächlicher aktiver Bestandteil identifiziert werden. Der Pflanzenextrakt enthält jedoch etwa 50 weitere, diesem verwandte Verbindungen, die mit unterschiedlichen Affinitäten an die Cannabinoid-Rezeptoren binden und eventuell eigene pharmakologische Wirkungen entfalten. Weitreichende Forschungen während der letzten Jahrzehnte haben demonstriert, dass es sich bei den Cannabinoid-Rezeptoren um viel versprechende Zielproteine bei der Bekämpfung einer Vielzahl von Krankheitssymptomen handelt. Die Produktion des Cannabinoid-Rezeptors 2 wurde zunächst im Pichia pastoris Expressionssystem untersucht. Das Expressionskonstrukt beinhaltete ein N-terminales Dekahistidin-Anhängsel sowie C-terminal die Biotinylierungsdomäne der Transcarboxylase aus Propionibacterium shermanii (Biotag). Leider stellte sich das produzierte Protein als ausgesprochen heterogen heraus, in den Zellmembranen waren mehrere oligomere Formen vorhanden, sowie verschiedene Degradationsprodukte. Versuche zur Reinigung des Proteins erwiesen sich sowohl hinsichtlich der erreichten Reinheit als auch der Ausbeute als ungenügend. Zudem zeigte die analytische Gelfiltrations-Chromatographie, dass der Großteil des Proteins aggregiert war. Als alternatives Expressionssystem wurde daher die Bakulovirus-vermittelte Expression in Insektenzellen untersucht. Hierbei lag der Fokus mehr auf der heterologen Produktion des Cannabinoid-Rezeptors 1, da bei diesem zum einen detaillierteres Verständnis der biochemischen Vorgänge vorliegt und er zum anderen die größere pharmakologische Wichtigkeit besitzt. Für die heterologe Produktion wurde sowohl eine Vollängenversion des Rezeptors als auch eine Version mit deletiertem C-Terminus verwendet. Zur Reinigung mittels Affinitätschromatographie wurden von beiden Versionen Konstrukte erstellt, die mit einem N-terminalen Polyhistidin-Anhängsel versehen waren und C-terminal entweder das Strep II-Anhängsel oder das Biotag trugen. Bei sämtlichen getesteten Konstrukten war eine Überproduktion in Spodoptera frugiperda (Sf9) Zellen zu beobachten. Mit N-terminalem Decahistidin-Anhängsel und C-terminalem Strep II-Anhängsel betrug das Produktionsniveau (Bmax) für das Vollängenkonstrukt 40 pmol/mg und 53 pmol/mg für die verkürzte Version. Diese Mengen sind gut doppelt so hoch wie die besten bis jetzt veröffentlichten Angaben und bilden eine gute Grundlage für eine nachfolgende Reinigung des Rezeptors. Die Charakterisierung des Rezeptors mittels Radioligandenbindung zeigte, dass die Agonistenbindung des Cannabinoid-Rezeptors 1 von der Anwesenheit von Magnesiumionen abhängig war, während die Antagonistenbinung Mg2+-unabhängig erfolgte. Ferner führten hohe Natriumchlorid-Konzentrationen im Reaktionspuffer zu einer verminderten Agonisten-Bindung, während sie die Antagonisten-Bindung nicht beeinflussten. Im Gegensatz zu anderen GPCRs konnte für den Cannabinoid- Rezeptors 1 auch dann noch Ligandenbindung gemessen werden, wenn 1,4-Dithiothreit (DTT) in höheren Konzentrationen (10 mM) anwesend war. Andererseits führte die Mehrzahl der getesteten Detergenzien zu einer Verringerung der Ligandenbindung. Aufgrund hoher unspezifischer Bindung des Radioliganden war ein Nachweis der Ligandenbindung für den solubilisierten sowie für den gereinigten Rezeptor bisher nicht erfolgreich. Wie den bereits vorliegenden Publikationen anderer Gruppen zu entnehmen war, stellte die reine Darstellung dieses Rezeptors eine erhebliche Herausforderung dar. Die nach Reinigung mittels IMAC vorliegende Präparation wies dann auch eine Reinheit von bestenfalls 50% auf. Eine nachfolgende zweite Affinitätschromatographie unter Verwendung von monomerer Avidin-Matrix (Biotag) oder Strep-Tactin-Agarose (Strep IIAnhängsel) führte zu einer drastischen Verringerung der Ausbeute. Im Falle der Strep-Tactin-Agarose erfolgte die Bindung des rekombinanten Rezeptors mit nur geringer Effizienz, während die Bindung an die monomere Avidin-Matrix überwiegend irreversibel war. Auch nach der zweiten Affinitätschromatographie wies die Präparation noch verschiedene Verunreinigungen auf und Variationen der Waschbedingungen konnten keine Verbesserung herbeiführen. Daraufhin wurde die Reinigung des Rezeptors mittels verschiedener IMAC-Matrices erprobt. Unter Verwendung einer von der Firma Sigma vertriebenen Ni-NTA-Matrix mit der Bezeichnung His-Select konnte ein deutlich verbessertes Reinigungsprofil erhalten werden. Unter optimierten Bedingungen wurde zwar eine Reinheit von etwa 80% erreicht, die Ausbeute lag hierbei allerdings lediglich bei 20% und war damit für den Beginn von Strukturuntersuchungen nicht genügend. Das Gelfiltrationsprofil des gereinigten Rezeptors war zudem inhomogen und deutete auf verschiedene oligomere Formen in der Präparation hin. Hier sind noch weitere Bemühungen erforderlich, um sowohl die Ausbeute als auch die Reinheit/Homogenität der Rezeptor-Präparationen so weit zu steigern, dass Kristallisationsversuche unternommen werden können. Von den Cannabinoid-Rezeptoren ist bekannt, dass sie in der Zelle auch ohne gebundenen Liganden bereits in einem Komplex mit dem G-Protein vorliegen (GPCR/GProtein-Komplex). Diese Eigenschaft könnte für die Kristallisation durchaus von großem Nutzen sein. Der GPCR/G-Protein-Komplex existiert sowohl in einer aktiven als auch einer inaktiven Form. Während der aktive GPCR/G-Protein-Komplex die konstitutiv aktive Form des Rezeptors darstellt, sind beide Formen an der G-Protein Sequestrierung in der Zelle beteiligt. Die Existenz beider genanter GPCR/G-Protein-Komplex wurde in dieser Arbeit mittels Fluoreszenztechniken untersucht. Durch Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET)-Messungen konnte gezeigt werden, dass der Cannabinoid-Rezeptor 1 in dem beschriebenen Komplex mit Gi1 vorliegt. Für den C-terminal verkürzten Cannabinoid-Rezeptor 1 in Fusion mit dem gelb fluoreszierenden Protein (CB1-417-YFP) und Gi1 in Fusion mit dem cyan fluoreszierenden Protein (Gil-CFP) konnte die Kolokalisation innerhalb der Zelle auch bei Abwesenheit eines Liganden nachgewiesen werden. Mit einem Guanosintriphosphat-Bindungsassay an Zellmembranen konnte ferner nachgewiesen werden, dass der aktive GPCR/G-Protein-Komplex auch in der Abwesenheit eines Agonisten vorliegt. In einem weiteren Experiment wurden die Membranen von Zellen, die das verkürzte Rezeptorkonstrukt mit N-terminalem Flag-Anhängsel und das heterotrimere G-Protein koexprimierten solubilisiert und erfolgreich eine Koimmunopräzipitation des Rezeptor/G-Protein-Komplexes mittels Anti-Flag M2-Agarose durchgeführt. Die in der vorliegenden Arbeit erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die C-terminal verkürzte Form des Cannabinoid-Rezeptors 1 in Insektenzellen funktionell produziert werden konnte, wobei die erreichten Produktionsniveaus weit über denen in bisherigen Veröffentlichungen liegen. Ferner konnte durch FRET-Experimente gezeigt werden, dass dieser Rezeptor auch in Abwesenheit eines Liganden in einem Komplex mit dem G-Protein vorliegt. Diese Ergebnisse wurden durch die erfolgreiche Koimmunopräzipitaion des Rezeptor/G-Protein-Komplexes bestätigt. Weiterführende Untersuchungen sind erforderlich, um zu überprüfen, in wie weit dieser Rezeptor/G-Protein-Komplexe gereinigt und eventuell für die Kokristallisation eingesetzt werden kann

Heparin binding domain in vitronectin is required for oligomerization and thus enhances integrin mediated cell adhesion and spreading

AbstractVitronectin is a multi-functional protein found predominantly as a monomer in blood and as an oligomer in the extracellular matrix. We have dissected the minimal regions of vitronectin protein needed for effective integrin dependent cell adhesion and spreading. A fragment of vitronectin containing the RGD integrin binding site showed similar binding affinity as that of full vitronectin protein to purified integrin αvβ3 but had diminished cell adhesion and spreading function in vivo. We demonstrate that the oligomeric state of the protein is responsible for this effect. We provide compelling evidence for the involvement of the heparin binding domain of vitronectin in the oligomerization process and show that such oligomerization reinforces the activity of vitronectin in cell adhesion and spreading.Structured summaryMINT-7905703: Vn (uniprotkb:P04004) and Vn (uniprotkb:P04004) bind (MI:0407) by molecular sieving (MI:0071

Examining the Role of Supervisor Support on Generation Z's Intention to Quit

The purpose of this research is to examine Generation Z’s unmet expectations and work-related boredom and its impact on their intention to quit. The study investigates the moderating role of the supervisor support in the relationship between work-related boredom and intention to quit. This research advances the understanding of the adverse effects of employees' unmet expectations and work-related boredom. Generation Z joins the organizations with unrealistic expectations of work that, in turn, promote lower levels of commitment and higher turnover, and therefore warrants more research. Data were collected from 336 Generation Z respondents working in the information technology industry. The data were analyzed using least square regressions and bootstrapping techniques. The findings confirm that supervisor support moderates the relationship between work-related boredom and employees’ intention to quit such that if the degree of supervisor support is higher, then the relation is weaker. HRM practitioners need to be candid in explaining the job description and job specifications during the interview; more importantly, organizations need to address the expectations even before they are hired. The findings indicate that high supervisor support buffers the adverse effects of unmet expectations and work-related boredom. The study suggests that coaching could be an effective tool to support Generation Z’s aspirations and well-being in the workplace. Therefore, organizations should make coaching a key element in the organization’s culture and part of a manager's job

Glycosylated notch and cancer

Glycosylation is one of the key components influencing several signaling pathways implicated in cell survival and growth. The Notch signaling pathway plays a pivotal role in numerous cell fate specifications during metazoan development. Both Notch and its ligands are repeatedly glycosylated by the addition of sugar moieties, such as O-fucose, O-glucose, or O-xylose, to bring about structural and functional changes. Disruption to glycosylation processes of Notch proteins result in developmental disorders and disease, including cancer. This review summarizes the importance and recent updates on the role of glycosylated Notch proteins in tumorigenesis and tumor metastasis

Kinetic regulation of multi-ligand binding proteins

Background: Second messengers, such as calcium, regulate the activity of multisite binding proteins in a concentration-dependent manner. For example, calcium binding has been shown to induce conformational transitions in the calcium-dependent protein calmodulin, under steady state conditions. However, intracellular concentrations of these second messengers are often subject to rapid change. The mechanisms underlying dynamic ligand-dependent regulation of multisite proteins require further elucidation. Results: In this study, a computational analysis of multisite protein kinetics in response to rapid changes in ligand concentrations is presented. Two major physiological scenarios are investigated: i) Ligand concentration is abundant and the ligand-multisite protein binding does not affect free ligand concentration, ii) Ligand concentration is of the same order of magnitude as the interacting multisite protein concentration and does not change. Therefore, buffering effects significantly influence the amounts of free ligands. For each of these scenarios the influence of the number of binding sites, the temporal effects on intermediate apo- and fully saturated conformations and the multisite regulatory effects on target proteins are investigated. Conclusions: The developed models allow for a novel and accurate interpretation of concentration and pressure jump-dependent kinetic experiments. The presented model makes predictions for the temporal distribution of multisite protein conformations in complex with variable numbers of ligands. Furthermore, it derives the characteristic time and the dynamics for the kinetic responses elicited by a ligand concentration change as a function of ligand concentration and the number of ligand binding sites. Effector proteins regulated by multisite ligand binding are shown to depend on ligand concentration in a highly nonlinear fashion

Heterozygous Loss-of-Function Mutations in DLL4 Cause Adams-Oliver Syndrome.

Adams-Oliver syndrome (AOS) is a rare developmental disorder characterized by the presence of aplasia cutis congenita (ACC) of the scalp vertex and terminal limb-reduction defects. Cardiovascular anomalies are also frequently observed. Mutations in five genes have been identified as a cause for AOS prior to this report. Mutations in EOGT and DOCK6 cause autosomal-recessive AOS, whereas mutations in ARHGAP31, RBPJ, and NOTCH1 lead to autosomal-dominant AOS. Because RBPJ, NOTCH1, and EOGT are involved in NOTCH signaling, we hypothesized that mutations in other genes involved in this pathway might also be implicated in AOS pathogenesis. Using a candidate-gene-based approach, we prioritized DLL4, a critical NOTCH ligand, due to its essential role in vascular development in the context of cardiovascular features in AOS-affected individuals. Targeted resequencing of the DLL4 gene with a custom enrichment panel in 89 independent families resulted in the identification of seven mutations. A defect in DLL4 was also detected in two families via whole-exome or genome sequencing. In total, nine heterozygous mutations in DLL4 were identified, including two nonsense and seven missense variants, the latter encompassing four mutations that replace or create cysteine residues, which are most likely critical for maintaining structural integrity of the protein. Affected individuals with DLL4 mutations present with variable clinical expression with no emerging genotype-phenotype correlations. Our findings demonstrate that DLL4 mutations are an additional cause of autosomal-dominant AOS or isolated ACC and provide further evidence for a key role of NOTCH signaling in the etiology of this disorder

Bharat Chillakuri's Quick Files

The Quick Files feature was discontinued and it’s files were migrated into this Project on March 11, 2022. The file URL’s will still resolve properly, and the Quick Files logs are available in the Project’s Recent Activity