La activación de la E3 Ubiquitina ligasa APC/C-Cdh1 es esencial para la supervivencia neuronal. Desarrollo de un modelo murino de neurodegeneración in vivo

[ES] Las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson o la esclerosis lateral amiotrófica, cursan con la pérdida de poblaciones neuronales específicas. Con pocas excepciones, las causas etiopatológicas de estas enfermedades son, en gran medida, desconocidas e incluso en los casos en los que han sido identificados los mecanismos, éstos son aún especulativos. Sin embargo, es llamativa la presencia de similitudes en los procesos neurodegenerativos a nivel celular y molecular y las semejanzas en el desarrollo de las respuestas encefálicas, incluso en procesos con origen muy diferente. La neurodegeneración es un proceso considerado irreversible y que produce una destrucción sistemática y pautada de los componentes nucleares y citoplasmáticos de las neuronas afectadas. Ello hace que las enfermedades neurodegenerativas supongan actualmente un enorme coste personal, sanitario y socioeconómico. Como primer paso para evaluar estrategias en el tratamiento de estas neuropatologías, o al menos retrasar su aparición o ralentizar su progresión, se hace necesario conocer los mecanismos previos a la muerte celular, caracterizar los acontecimientos que se suceden durante el proceso y las etapas identificables anteriores a la degeneración neuronal, determinar los factores tanto celulares como bioquímicos que son capaces de modificar la progresión normal de este proceso. Por todo ello, es esencial disponer de modelos animales que emulen el proceso neurodegenerativo completo. El ciclo celular se define como el conjunto de procesos a partir de los cuales, de una célula madre se obtienen dos células hijas con la misma información genética. A lo largo del ciclo celular debe existir una coordinación entre el crecimiento de las células y su división. La condición esencial para que ocurra la división celular es que la célula madre transmita adecuadamente su información genética a las dos células hijas. Para ello, el DNA ha de ser replicado de forma exacta y única en cada ciclo, y las cromátidas hermanas obtenidas deben ser segregadas a cada una de las nuevas células. Se ha descrito un complejo multiproteico denominado complejo promotor de la anafase/ciclosoma (APC/C), que contiene la actividad E3 Ubiquitina ligasa que cataliza la unión de múltiples moléculas de Ubiquitina a las ciclinas. Este complejo está formado por al menos 13 proteínas diferentes. Se ha descrito una proteína con 7 repeticiones de dominios WD, denominada Cdh1, que es necesaria para el reconocimiento de la ciclina por el complejo APC/C . Cdh1 es una proteína que está regulada negativamente por los complejos Cdk/ciclina, de manera que en su estado fosforilado no interacciona con APC/C y, por tanto, es inactivo y cuando está desfosforilada interacciona con APC/C y promueve la degradación de la ciclina B1. Por todo ello, Cdh1 se considera una proteína supresora tumoral. Existen varias evidencias experimentales de que Cdh1 es uno de los reguladores más importantes de las fases G1 y G0 del ciclo celular. Su importancia para el mantenimiento de estas fases se deduce del hecho de que las células entran en fase S más fácilmente tras su inhibición o ausencia. Cdh1 no se expresa durante los primeros ciclos de división embrionarios, los cuales carecen de fases G1 y G2, coincidiendo el comienzo de su expresión con la adquisición de fase G1. La actividad de APC/C-Cdh1 está regulada por el nivel proteico y el estado de fosforilación de Cdh1, así como por la unión de proteínas inhibidoras o activadoras. En los últimos años, otros autores y nuestro grupo han descrito la presencia de Cdh1 y diferentes subunidades de APC/C en el cerebro de ratón, así como en cultivos de neuronas corticales. Recientemente, en nuestro laboratorio hemos demostrado que la actividad de APC/C-Cdh1 es esencial para la supervivencia neuronal in vitro (cultivos primarios de neuronas de rata). La inhibición de la actividad de la ligasa, mediante el silenciamiento por tratamiento con siRNA del activador Cdh1 o la sobre-expresión del inhibidor de la ligasa, Emi1, en las neuronas provoca la muerte neuronal mediante un mecanismo que implica la acumulación de la ciclina mitótica B1. De hecho, la expresión de ciclina B1 es, por sí misma, una potente neurotoxina. Cdh1 y el Sistema Nervioso: El crecimiento axónico es un proceso esencial en el establecimiento de las conexiones entre neuronas. Depende de factores externos del ambiente y también de programas intrínsecos de la célula, que gobiernan tanto el crecimiento como el patrón de los axones. En concreto, existen evidencias que sugieren un papel importante de APC/C-Cdh1 en la morfogénesis de los axones en el cerebro de mamíferos, al marcar para su degradación a los reguladores transcripcionales SnoN e Id2. Se ha puesto de manifiesto que APC/C-Cdh1 controla el desarrollo y la transmisión sináptica al regular la localización de receptores de glutamato, tipo AMPA. Se ha descrito una función presináptica de APC/C-Cdh1 en la restricción del número de botones y otra postsináptica en la restricción de la abundancia de receptores de glutamato, resaltando su importancia en el desarrollo y funcionamiento de las sinapsis. Por otra parte, se ha descrito la implicación de APC/C-Cdh1 en la plasticidad sináptica y los procesos de memoria y aprendizaje. Las neuronas poseen menor tasa glucolítica que los astrocitos y, a diferencia de ellos, son incapaces de aumentarla bajo condiciones de estrés. Ello es consecuencia de los bajos niveles de Pfkfb3 (6-fosfofructo-2-kinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa) que expresan, a diferencia de las células gliales. Esta enzima genera fructosa-2,6-bisfosfato, el activador más potente de la 6-fosfofructo-1-kinasa, principal regulador de la glucólisis. Recientemente, en nuestro laboratorio se ha descrito que APC/C-Cdh1 es la E3 Ubiquitina Ligasa responsable de regular los niveles proteicos de Pfkfb3 y, por tanto, la actividad glucolítica neuronal. De este modo, APC/C-Cdh1 mantiene baja la tasa glucolítica en las neuronas, posibilitando la utilización de la glucosa para otras funciones, como es el mantenimiento del estado antioxidante de las mismas. El ciclo celular y la viabilidad neuronal se han asociado bajo la hipótesis de que la re-entrada de las neuronas en el ciclo celular causa su muerte por apoptosis. Por tanto, nuestro laboratorio ha descrito una nueva función neuroprotectora de Cdh1, necesaria para promover la degradación de la ciclina B1 y, de ese modo, prevenir una entrada aberrante de las neuronas en el ciclo celular. Actualmente se sabe que Cdh1 regula la supervivencia neuronal, el crecimiento axónico, la sinaptogénesis y el metabolismo glucídico en neuronas en cultivo primario. Sin embargo, se desconoce la trascendencia de estas funciones in vivo. En esta Tesis Doctoral nos propusimos investigar la función de Cdh1 en cerebro y su relevancia en la supervivencia neuronal in vivo. Para ello, se utilizaron ratones knockout para Cdh1 en zonas específicas del cerebro, de manera condicional a la expresión de CaMKIIalfa-Cre. Nuestros resultados han mostrado que la eliminación de Cdh1 induce el acortamiento de la corteza cerebral y de la capa CA1 del hipocampo, de manera dependiente del tiempo, sugiriendo una pérdida selectiva de neuronas. Estos resultados corroboran in vivo la función esencial de Cdh1 en la supervivencia neuronal

The MDM2-p53 pathway is involved in preconditioning-induced neuronal tolerance to ischemia

Article number: 1610 (2018)[EN]Brain preconditioning (PC) refers to a state of transient tolerance against a lethal insult that can be evoked by a prior mild event. It is thought that PC may induce different pathways responsible for neuroprotection, which may involve the attenuation of cell damage pathways, including the apoptotic cell death. In this context, p53 is a stress sensor that accumulates during brain ischemia leading to neuronal death. The murine double minute 2 gene (MDM2), a p53-specific E3 ubiquitin ligase, is the main cellular antagonist of p53, mediating its degradation by the proteasome. Here, we study the role of MDM2-p53 pathway on PC-induced neuroprotection both in cultured neurons (in vitro) and rat brain (in vivo). Our results show that PC increased neuronal MDM2 protein levels, which prevented ischemia-induced p53 stabilization and neuronal death. Indeed, PC attenuated ischemia-induced activation of the p53/PUMA/caspase-3 signaling pathway. Pharmacological inhibition of MDM2-p53 interaction in neurons abrogated PC-induced neuroprotection against ischemia. Finally, the relevance of the MDM2-p53 pathway was confirmed in rat brain using a PC model in vivo. These findings demonstrate the key role of the MDM2-p53 pathway in PC-induced neuroprotection against a subsequent ischemic insult and poses MDM2 as an essential target in ischemic tolerance

Astrocytic mitochondrial ROS modulate brain metabolism and mouse behavior

[EN]To satisfy its high energetic demand1, the brain depends on the metabolic cooperation of various cell types2-4. For example, astrocytic-derived lactate sustains memory consolidation5 by serving both as an oxidizable energetic substrate for neurons6 and as a signalling molecule7,8. Astrocytes and neurons also differ in the regulation of glycolytic enzymes9 and in the organization of their mitochondrial respiratory chain10. Unlike neurons, astrocytes rely on glycolysis for energy generation9 and, as a consequence, have a loosely assembled mitochondrial respiratory chain that is associated with a higher generation of mitochondrial reactive oxygen species (ROS)10. However, whether this abundant natural source of mitochondrial ROS in astrocytes fulfils a specific physiological role is unknown. Here we show that astrocytic mitochondrial ROS are physiological regulators of brain metabolism and neuronal function. We generated mice that inducibly overexpress mitochondrial-tagged catalase in astrocytes and show that this overexpression decreases mitochondrial ROS production in these cells during adulthood. Transcriptomic, metabolomic, biochemical, immunohistochemical and behavioural analysis of these mice revealed alterations in brain redox, carbohydrate, lipid and amino acid metabolic pathways associated with altered neuronal function and mouse behaviour. We found that astrocytic mitochondrial ROS regulate glucose utilization via the pentose-phosphate pathway and glutathione metabolism, which modulates the redox status and potentially the survival of neurons. Our data provide further molecular insight into the metabolic cooperation between astrocytes and neurons and demonstrate that mitochondrial ROS are important regulators of organismal physiology in vivo

Neovascularization and functional recovery after intracerebral hemorrhage is conditioned by the Tp53 Arg72Pro single-nucleotide polymorphism

Intracerebral hemorrhage (ICH) is a devastating subtype of stroke that lacks effective therapy and reliable prognosis. Neovascularization following ICH is an essential compensatory response that mediates brain repair and modulates the clinical outcome of stroke patients. However, the mechanism that dictates this process is unknown. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells (EPCs) promote endothelial repair and contribute to ischemia-induced neovascularization. The human Tp53 gene harbors a common single-nucleotide polymorphism (SNP) at codon 72, which yields an arginine-to-proline amino-acidic substitution (Arg72Pro) that modulates the apoptotic activity of the p53 protein. Previously, we found that this SNP controls neuronal susceptibility to ischemia-induced apoptosis in vitro. Here, we evaluated the impact of the Tp53 Arg72Pro SNP on vascular repair and functional recovery after ICH. We first analyzed EPC mobilization and functional outcome based on the modified Rankin scale scores in a hospital-based cohort of 78 patients with non-traumatic ICH. Patients harboring the Pro allele of the Tp53 Arg72Pro SNP showed higher levels of circulating EPC-containing CD34 + cells, EPC-mobilizing cytokines-vascular endothelial growth factor and stromal cell-derived factor-1α-and good functional outcome following ICH, when compared with the homozygous Arg allele patients, which is compatible with increased neovascularization. To assess directly whether Tp53 Arg72Pro SNP regulated neovascularization after ICH, we used the humanized Tp53 Arg72Pro knock-in mice, which were subjected to the collagenase-induced ICH. The brain endothelial cells of the Pro allele-carrying mice were highly resistant to ICH-mediated apoptosis, which facilitated cytokine-mediated EPC mobilization, cerebrovascular repair and functional recovery. However, these processes were not observed in the Arg allele-carrying mice. These results reveal that the Tp53 Arg72Pro SNP determines neovascularization, brain repair and neurological recovery after ICH. This study is the first in which the Pro allele of Tp53 is linked to vascular repair and ability to functionally recover from stroke.This work was funded by The Instituto de Salud Carlos III Grants PI12/00685, PI15/00473 and RD12/0014/0007 (to AA), RD12/0014/0001 (to JC), PI14/01879 and CP12/03121 (to TS), RD12/0043/0021 (to JPB), CD11/00348 (to CR), CD12/00685 (to JA), CM11/00140 (to JJD), CM14/00096 (to MER-A), The Ministerio de Economía y Competitividad Grant SAF2013-41177-R (JPB), The Junta de Castilla y León (GRS843/A/13 and GRS1004/A/14; to JCG-S), The Xunta de Galicia (GRC2014/027; to JC) and the European Regional Development Fund (ERDF).Peer Reviewe

Short-term fructose ingestion affects the brain independently from establishment of metabolic syndrome

Chronic fructose ingestion is linked to the global epidemic of metabolic syndrome (MetS), and poses a serious threat to brain function. We asked whether a short period (one week) of fructose ingestion potentially insufficient to establish peripheral metabolic disorder could impact brain function. We report that the fructose treatment had no effect on liver/body weight ratio, weight gain, glucose tolerance and insulin sensitivity, was sufficient to reduce several aspects of hippocampal plasticity. Fructose consumption reduced the levels of the neuronal nuclear protein NeuN, Myelin Basic Protein, and the axonal growth-associated protein 43, concomitant with a decline in hippocampal weight. A reduction in peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha and Cytochrome c oxidase subunit II by fructose treatment is indicative of mitochondrial dysfunction. Furthermore, the GLUT5 fructose transporter was increased in the hippocampus after fructose ingestion suggesting that fructose may facilitate its own transport to brain. Fructose elevated levels of ketohexokinase in the liver but did not affect SIRT1 levels, suggesting that fructose is metabolized in the liver, without severely affecting liver function commensurable to an absence of metabolic syndrome condition. These results advocate that a short period of fructose can influence brain plasticity without a major peripheral metabolic dysfunction